宿主蛋白殘留檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析中存在的問(wèn)題

北京市藥品審評(píng)中心（100053）徐春娥 田曉娟 劉鶴 佟利家

宿主殘留蛋白（Host Cell Protein，以下簡(jiǎn)稱為HCP），是指在生物制品中殘留的宿主蛋白。這類蛋白成分復(fù)雜，種類繁多，且會(huì)因生產(chǎn)過(guò)程及純化工藝的不同而發(fā)生變化?；蚬こ坍a(chǎn)品中殘留的宿主細(xì)胞蛋白是影響制品純度的重要因素，反復(fù)使用含宿主細(xì)胞蛋白的基因工程制品，有可能會(huì)引起機(jī)體的過(guò)敏反應(yīng)，而且其具有潛在的“佐劑效應(yīng)”，也可能引起機(jī)體對(duì)藥物產(chǎn)生抗體，進(jìn)而影響藥物的療效。HCP在生物制品中的殘留量反映的不僅是制品批間的一致性，而且還是衡量生物制品質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)。

目前，HCP檢測(cè)使用的方法包括酶聯(lián)免疫法（ELISA）、聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）、毛細(xì)管電泳（CE）、等電聚焦（IEF）和高效液相層析（HPLC）等。Capito F等報(bào)告[1]，采用傅立葉轉(zhuǎn)換紅外光譜學(xué)（Fourier transform mid infrared spectroscopy，F(xiàn)T-MIR）可以對(duì)重組蛋白純化過(guò)程中的大量（20μg/mL～200μg/mL）宿主殘留蛋白進(jìn)行監(jiān)控。目前，《中國(guó)藥典》[2]三部（2010版）中對(duì)于大腸桿菌、酵母、假單胞菌表達(dá)的蛋白質(zhì)的HCP檢測(cè)，采用的是雙抗夾心ELISA法，《美國(guó)藥典》[3]中規(guī)定使用SDS-PAGE或免疫測(cè)定法。而另有一些生物制品公司，如美國(guó)Cygnus technologies（賽納斯科技）公司研究開發(fā)了一系列HCP檢測(cè)試劑盒，國(guó)內(nèi)采用的一般表達(dá)宿主蛋白殘留檢測(cè)多數(shù)使用商品化的檢測(cè)試劑盒；對(duì)于尚沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)品的表達(dá)宿主，廠家則需要建立這類表達(dá)宿主的內(nèi)部參考品。

商品化檢測(cè)試劑盒一般都是經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的生產(chǎn)工藝方法學(xué)驗(yàn)證的，并進(jìn)行了嚴(yán)格的產(chǎn)品性能評(píng)估，每個(gè)試劑盒都有與此產(chǎn)品匹配的最適合的計(jì)算方法，試劑盒中對(duì)結(jié)果的分析方法進(jìn)行了嚴(yán)格的限制，要求在試劑盒規(guī)定的稀釋度范圍內(nèi)進(jìn)行測(cè)量，并且采用所要求的方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析才能得到準(zhǔn)確的數(shù)值，如point-to-point（點(diǎn)對(duì)點(diǎn)）、cubic spline（三次樣條曲線）和四參數(shù)對(duì)數(shù)法等。因此，在使用商品化試劑盒時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行操作。筆者在進(jìn)行原始記錄核查時(shí)發(fā)現(xiàn)，有些研究單位在進(jìn)行宿主蛋白殘留檢測(cè)結(jié)果分析時(shí)，未嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書要求進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。而申請(qǐng)人一般會(huì)將說(shuō)明書中要求的point-to-point 簡(jiǎn)單的理解為直線回歸分析方法，習(xí)慣采用直線回歸分析方法和兩點(diǎn)間直線分析方法，這樣就會(huì)導(dǎo)致計(jì)算的結(jié)果不夠準(zhǔn)確。此外，也不能準(zhǔn)確的反映測(cè)定方法中自變量和因變量之間的關(guān)系?，F(xiàn)以兩例核查中發(fā)現(xiàn)的未按照規(guī)定方法進(jìn)行分析的實(shí)際案例為例進(jìn)行分析，以提請(qǐng)相關(guān)檢測(cè)人員的注意。

例1：注射用生物制品A表達(dá)宿主為293T細(xì)胞，制造檢定規(guī)程要求成品宿主蛋白殘留量低于50ng/劑量。申請(qǐng)人使用的是Cygnus生產(chǎn)的293細(xì)胞蛋白殘留檢測(cè)試劑盒，要求在規(guī)定的稀釋度范圍內(nèi)進(jìn)行測(cè)量，并且采用如point-to-point（點(diǎn)對(duì)點(diǎn)）、cubic spline（三次樣條曲線）或四參數(shù)對(duì)數(shù)法進(jìn)行分析，而申請(qǐng)人卻采用了直線回歸分析方法進(jìn)行測(cè)定。宿主蛋白殘留檢測(cè)原始數(shù)據(jù)見(jiàn)附表1。

附圖1 采用Cubic Spline方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線

附圖2 第一次測(cè)量和第三次測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)曲線（Cubic Spline法）

附圖3 第二次測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)曲線（Cubic Spline法）

附表1 注射用生物制品A中三批成品的宿主蛋白殘留檢測(cè)原始數(shù)據(jù)

附表2 注射用生物制品A采用不同分析方法檢測(cè)殘留蛋白的結(jié)果對(duì)比

附表3 某注射用生物制品B原液3次宿主蛋白殘留檢測(cè)的原始數(shù)據(jù)

附表4 某注射用生物制品B原液3次宿主蛋白殘留檢測(cè)采用不同分析方法的結(jié)果對(duì)比

采用試劑盒中要求的分析方法之一—Cubic Spline進(jìn)行分析，標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)附圖1，曲線方程為：y=-24.093+345.5817x-341.7936x2+407.1602x3。注射用生物制品A采用直線回歸分析方法與Cubic Spline分析方法進(jìn)行分析，兩種分析方法結(jié)果對(duì)比見(jiàn)附表2。

從附表2中的結(jié)果可以看出，采用Cubic Spline方法進(jìn)行分析時(shí)，三批成品的293細(xì)胞宿主蛋白殘留量分別為25.19ng/劑量、26.93ng/劑量和24.64ng/劑量，原分析方法采用線性回歸分析法，數(shù)據(jù)分別為25.91ng/劑量、27.50ng/劑量和25.36ng/劑量，所得結(jié)果差異不大，均低于該品50ng/劑量的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，符合該品制造檢定規(guī)程要求。

例2：某注射用生物制品B原液要求檢測(cè)宿主殘留蛋白，表達(dá)宿主為巴斯德畢赤酵母，制造檢定規(guī)程規(guī)定宿主殘留蛋白應(yīng)不高于蛋白質(zhì)總量的0.050%。申請(qǐng)人使用的是Cygnus生產(chǎn)的酵母蛋白殘留檢測(cè)試劑盒（原始數(shù)據(jù)見(jiàn)附表3）。采用試劑盒中要求的分析方法之一—Cubic Spline進(jìn)行分析，第一次測(cè)量和第三次測(cè)量所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線相同（見(jiàn)附圖2），曲線方程為：y=-3.6553+145.4702x+136.8839x2-1 0 2.8 3 6 4 x3；第二次測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)附圖3，曲線方程為：y=7.6 4 5 4-388.3606x+6171.5782x2-14154.8888x3，而申請(qǐng)人卻采用了直線回歸分析方法進(jìn)行分析，兩種分析方法結(jié)果對(duì)比詳見(jiàn)附表4。

根據(jù)計(jì)算結(jié)果我們可以看出，采用Cubic Spline方法對(duì)同一批原液進(jìn)行三次測(cè)量，與直線回歸分析方法相比，雖然得出的結(jié)果均在其質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)，即宿主殘留蛋白均不高于蛋白質(zhì)總量的0.050%，第一次和第三次測(cè)量?jī)煞N方法的分析結(jié)果差異不大，而第二次測(cè)量結(jié)果卻出現(xiàn)較大偏離。

通過(guò)分析標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，在數(shù)值較高部分和較低部分通常不是線性的，抗原或抗體濃度過(guò)高時(shí)，對(duì)應(yīng)的ELISA讀數(shù)不會(huì)再顯著升高，這時(shí)會(huì)達(dá)到一個(gè)平臺(tái)期，同樣在低濃度時(shí)也有一個(gè)平臺(tái)期，只有在適當(dāng)?shù)臐舛葧r(shí)才會(huì)出現(xiàn)類似直線的曲線。

在上述兩個(gè)例子中，由于數(shù)據(jù)落在近似直線的區(qū)域，采用直線回歸的方法與試劑盒要求的方法分析結(jié)果沒(méi)有明顯的差異，而當(dāng)所測(cè)量數(shù)值落在標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)值較高部分或較低部分時(shí)，如果使用線性回歸分析就會(huì)導(dǎo)致結(jié)果偏高或偏低，出現(xiàn)較大的誤差。因此，在實(shí)際分析中應(yīng)該嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書要求對(duì)所得數(shù)據(jù)要進(jìn)行多參數(shù)擬和，這樣才能得到準(zhǔn)確反映實(shí)驗(yàn)結(jié)果的曲線，從而回歸出準(zhǔn)確的結(jié)果。（注：本文所引用原始數(shù)據(jù)已經(jīng)與申請(qǐng)人溝通，同意使用）