嗅覺(jué)受體基因和蛋白的研究進(jìn)展

彭 鶴，趙魯杭 綜述

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州310058)

嗅覺(jué)在動(dòng)物的生命活動(dòng)中起著重要作用，是生物體感受外界環(huán)境的一種生理感覺(jué)。生物嗅覺(jué)系統(tǒng)可以識(shí)別環(huán)境中成千上萬(wàn)種不同的氣味分子，以獲得對(duì)外界環(huán)境的直觀感覺(jué)聯(lián)系。許多動(dòng)物依賴(lài)嗅覺(jué)來(lái)完成交配、取食、避開(kāi)天敵、識(shí)別有毒物質(zhì)以及群體交流等。

1991年Buck和Axel首次在小鼠體內(nèi)克隆了嗅覺(jué)受體(olfactory receptors，ORs)基因并發(fā)現(xiàn)了嗅覺(jué)受體基因超家族［1］，證明了嚙齒類(lèi)動(dòng)物大約有1 000種不同類(lèi)型的嗅覺(jué)受體基因。隨后，他們又對(duì)嗅覺(jué)信號(hào)在腦內(nèi)的傳遞、修飾和加工進(jìn)行了深入研究，闡明了嗅覺(jué)受體屬于7次跨膜的G-蛋白偶聯(lián)受體家族，在氣味識(shí)別過(guò)程中起著重要的作用。嗅覺(jué)感知起始于嗅覺(jué)受體蛋白與氣味分子的結(jié)合，配體受體結(jié)合物活化細(xì)胞內(nèi)的G-蛋白，活化的G-蛋白激活腺苷酸環(huán)化酶，使細(xì)胞內(nèi)大量的ATP轉(zhuǎn)化成cAMP。cAMP是細(xì)胞內(nèi)第二信使，可使細(xì)胞膜上的核苷酸門(mén)控離子通道打開(kāi)，引起細(xì)胞外鈣離子等陽(yáng)離子內(nèi)流，細(xì)胞產(chǎn)生動(dòng)作電位。由此，將氣味分子的化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)化成電信號(hào)，通過(guò)軸突傳到更高級(jí)的腦部結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)嗅覺(jué)的感知。這些研究讓人們對(duì)嗅覺(jué)的認(rèn)識(shí)產(chǎn)生了飛躍，Buck和Axel也因此獲得了2004年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。

1 OR基因研究

1.1 OR基因和假基因化 OR是由嗅覺(jué)細(xì)胞表達(dá)的一種蛋白質(zhì)，能夠與氣味分子結(jié)合。而OR基因?qū)儆跀?shù)量龐大的多基因超家族，在哺乳動(dòng)物中僅次于免疫系統(tǒng)編碼基因。隨著各物種基因組計(jì)劃的展開(kāi)，一些物種基因組序列的測(cè)序完成，發(fā)現(xiàn)人類(lèi)有851個(gè)OR基因，并成簇地分布在染色體上(除了20號(hào)和 Y染色體)［2］;鼠類(lèi)大約有 1296 個(gè)，也成簇地分布在鼠染色體中(除了12號(hào)和Y染色體)［3-4］。犬的OR基因庫(kù)含有971個(gè)OR基因，而雞的則由554個(gè)OR基因組成［5］。相比較而言，魚(yú)類(lèi)的OR基因數(shù)目少，僅約100個(gè)OR基因。

研究證明，OR基因在進(jìn)化過(guò)程中出現(xiàn)了不同程度的假基因化。所謂假基因化(pseudogene)是指基因中含有一個(gè)或多個(gè)破壞框架(包括移碼，片段終止密碼，或片段破壞散布重復(fù)等)［6］。Idan等就189個(gè)人種中51個(gè)OR基因進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)功能基因在這些人種中假基因化有擴(kuò)大的趨勢(shì)，還發(fā)現(xiàn)OR基因在人類(lèi)基因組中功能種群的多樣性，也就是個(gè)體之間的差異，揭示了不同的人嗅覺(jué)靈敏度不同［7］。人類(lèi)OR基因中約50%的基因?yàn)榧倩?，只?84個(gè)完整的具有潛在功能的基因［8］，鼠OR基因也有約20%的假基因化，真正具有功能的OR基因約為1 200個(gè)，是人類(lèi)的3倍多。這可能與鼠的生存對(duì)嗅覺(jué)依賴(lài)度遠(yuǎn)大于人類(lèi)有關(guān)。

1.2 OR基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)調(diào)控 OR是由多基因超家族編碼，每個(gè)嗅覺(jué)受體基因由約1 kb長(zhǎng)的編碼區(qū)域組成，且編碼區(qū)域內(nèi)沒(méi)有內(nèi)含子，編碼區(qū)下游是多聚腺苷酸信號(hào)約0.15～1.5 kb長(zhǎng)。OR基因的5＇端有數(shù)目可變的非編碼外顯子，從非編碼外顯子到編碼外顯子總長(zhǎng)在1～11 kb之間，這些非編碼外顯子在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中是可以選擇性斷裂拼接，產(chǎn)生不同類(lèi)型的ORmRNA，但是最終編碼的嗅覺(jué)受體蛋白結(jié)構(gòu)卻相同［9］。有研究表明，嗅覺(jué)受體基因主要是在嗅覺(jué)感覺(jué)神經(jīng)元表面表達(dá)，與其它G-蛋白偶聯(lián)受體比較，非編碼外顯子選擇性拼接可能調(diào)節(jié)了OR表達(dá)的組織特異性。

嗅覺(jué)感覺(jué)神經(jīng)元表達(dá)嗅覺(jué)受體有著嚴(yán)格的規(guī)范，1個(gè)嗅覺(jué)感覺(jué)神經(jīng)元只表達(dá)OR基因庫(kù)中的1個(gè)OR基因，即One Neuron-One Receptor原則。而且每種生物的嗅覺(jué)表達(dá)都遵循這種原則［10］。OR基因這種嚴(yán)格表達(dá)的形式，一直讓人費(fèi)解。這其中的核心調(diào)節(jié)機(jī)制目前尚不清楚，1個(gè)嗅覺(jué)感覺(jué)神經(jīng)元只表達(dá)等位基因中的1個(gè)，這種等位基因排斥是如何在嗅覺(jué)系統(tǒng)中完成的也不明確。為了探索這其中的機(jī)理，研究者選擇基因調(diào)控的幾個(gè)重要位點(diǎn)，如啟動(dòng)子序列、增強(qiáng)子和轉(zhuǎn)錄起始結(jié)合位點(diǎn)等作為研究的入手點(diǎn)。Sakano研究小組通過(guò)生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)，在小鼠MOR28基因簇的上游有一個(gè)長(zhǎng)2 kb的DNA區(qū)域，稱(chēng)為“H區(qū)域”(H源于小鼠基因與人類(lèi)基因的高度同源)，這個(gè)區(qū)域在嚙齒動(dòng)物和人類(lèi)的OR基因序列中都是保守序列，可能作為一個(gè)順式作用基因座控制區(qū)(locus control region，LCR)，調(diào)控 OR表達(dá)。實(shí)驗(yàn)證明，H區(qū)域與MOR28下游OR基因相互作用，激活 OR基因庫(kù)中單個(gè) OR基因的表達(dá)［11］。Michaloski等在一些OR基因的啟動(dòng)子序列中發(fā)現(xiàn)了1個(gè)高度保守區(qū)域O/E-like位點(diǎn)，對(duì)OR基因表達(dá)調(diào)控可能有增強(qiáng)作用［12］。Serizawa等人則用遺傳學(xué)方法對(duì)小鼠的嗅覺(jué)感覺(jué)神經(jīng)元進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)單個(gè)OR基因選擇性表達(dá)的這種少見(jiàn)，隨機(jī)的轉(zhuǎn)錄激活形式是由負(fù)反饋抑制機(jī)制調(diào)控［13］，當(dāng)1個(gè)OR基因在嗅覺(jué)神經(jīng)元中表達(dá)蛋白后，這個(gè)蛋白通過(guò)反饋?zhàn)饔靡种菩嵊X(jué)神經(jīng)元內(nèi)其它OR基因的表達(dá)。近年，Tobar研究小組利用生物信息學(xué)方法，在人類(lèi)OR基因的5＇端的非編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)1個(gè)高度保守的區(qū)域(highly conserved regions，HCR)。這個(gè)HCR位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(transcription start sites，TSS)上游，在功能基因和假基因中都存在，Tobar等采用T-Coffee工具對(duì)多個(gè)OR的轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行多重序列對(duì)齊分析，發(fā)現(xiàn)不同的HCR基因有不同的TATA-box和轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)，這提示HCR在不同位置表現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄作用不同，對(duì)OR基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控可能有增強(qiáng)功能［14］。

1.3 OR的分類(lèi)及進(jìn)化 目前已知的OR基因分為Ⅰ型和Ⅱ型OR兩類(lèi)。在研究非洲爪蟾等兩棲動(dòng)物時(shí)發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型OR能特異性檢測(cè)水溶性氣味，而Ⅱ型OR能識(shí)別揮發(fā)性氣味。在哺乳動(dòng)物中，Ⅰ型OR只占10%，而Ⅱ型OR明顯占大多數(shù)。在魚(yú)類(lèi)中，所有OR基因都屬于Ⅰ型［15］。研究發(fā)現(xiàn)，在多數(shù)物種中大部分Ⅱ型OR是假基因，如水生哺乳動(dòng)物條紋海豚有大量的Ⅱ型受體基因，這些基因都已證明是沒(méi)有功能的假基因［16］，這可能與條紋海豚的生存環(huán)境相關(guān)。

比較基因組學(xué)研究顯示，哺乳動(dòng)物的嗅覺(jué)靈敏度與功能性O(shè)R基因在基因組中所占比例呈正相關(guān)，同時(shí)在物種進(jìn)化過(guò)程中，功能性O(shè)R所占比例與該物種對(duì)嗅覺(jué)的依賴(lài)性相關(guān)，與進(jìn)化論中的“用進(jìn)廢退”原則一致。研究證明，有很大部分的OR基因退化為假基因，鼠的嗅覺(jué)受體基因大約有20%假基因化［3］，而人類(lèi)基因家族含有更多(＞50%)［2］。這標(biāo)志著鼠有更大的選擇壓力來(lái)保持1個(gè)大的嗅覺(jué)受體的功能。研究顯示，嗅覺(jué)受體基因在人類(lèi)和靈長(zhǎng)類(lèi)物種中假基因化呈流行趨勢(shì)，造成這個(gè)趨勢(shì)的主要原因可能是基因漂流，一種基因隨機(jī)復(fù)制和缺失的過(guò)程［17-18］。這種過(guò)程也導(dǎo)致了OR基因在不同物種中的進(jìn)化差異，最后才有嗅覺(jué)功能的千差萬(wàn)別。

2 OR蛋白研究

2.1 OR蛋白的結(jié)構(gòu) 嗅覺(jué)受體蛋白是行使嗅覺(jué)功能的主要蛋白，它的發(fā)現(xiàn)不僅在闡明嗅覺(jué)系統(tǒng)的組織和功能中起著不可替代的作用，同時(shí)為生物體中的其它化學(xué)感受器的研究提供了模板［19］。嗅覺(jué)受體蛋白為G蛋白偶聯(lián)受體，約含300～350個(gè)氨基酸，缺乏N-末端信號(hào)肽序列。序列分析顯示它們與7次跨膜的G-蛋白偶聯(lián)受體含有共同的結(jié)構(gòu)特征，如7個(gè)疏水性的α-螺旋跨膜結(jié)構(gòu)(每個(gè)大約有19-26個(gè)氨基酸)，蛋白的N-末端位于細(xì)胞外側(cè)，C-末端位于細(xì)胞內(nèi)側(cè)(圖1)［1］。除此之外，嗅覺(jué)受體蛋白還有一些特征性的結(jié)構(gòu):高度同源的細(xì)胞外1環(huán)和2環(huán)的半胱氨酸之間形成1個(gè)二硫鍵(圖1)，N-末端區(qū)域有1個(gè)一致保守的NXS/T序列，在細(xì)胞內(nèi)有幾個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)和眾多的保守短序列［20］。通過(guò)比較分析發(fā)現(xiàn)，不同的OR氨基酸序列具有一致的高度保守區(qū)，如膜內(nèi)第1環(huán)的 LHTPMY，第3跨膜區(qū)末端和膜內(nèi)第2環(huán)頭端的MAYDRYVAIC，第5跨膜區(qū)末端的SY，第6跨膜區(qū)頭端的FSTCSSH以及第7跨膜區(qū)的PMLNPF［21］。除了保守區(qū)域外，跨膜的3、4、5區(qū)都表現(xiàn)出高度的序列多樣性，通過(guò)與其它的7次跨膜蛋白(如β2腎上腺素受體)結(jié)構(gòu)類(lèi)比，發(fā)現(xiàn)它們是氣味分子識(shí)別和結(jié)合區(qū)域的一部分，已經(jīng)在這些區(qū)域確定了17個(gè)高度可變的氨基酸殘基。嗅覺(jué)受體跨膜的3、4、5區(qū)的這些可變的氨基酸殘基可能與氣味識(shí)別多樣性相關(guān)［22］。

圖1 嗅覺(jué)受體蛋白結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic representation of an olfactory receptor

2.2 嗅覺(jué)受體識(shí)別氣味分子的機(jī)制 研究者［23］通過(guò)單個(gè)神經(jīng)細(xì)胞的RT-PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，每1個(gè)嗅覺(jué)神經(jīng)元只表達(dá)OR基因家族中1個(gè)基因，重組嗅覺(jué)受體在嗅覺(jué)感覺(jué)神經(jīng)元中表達(dá)的功能分析及給予相應(yīng)配體刺激后細(xì)胞內(nèi)鈣成像實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，單個(gè)OR可以識(shí)別多種氣味，1種氣味也可被多個(gè)OR識(shí)別，而且不同的氣味可以被不同的嗅覺(jué)受體組合所識(shí)別，這說(shuō)明OR家族是通過(guò)1個(gè)組合方式來(lái)辨別氣味分子的。Malnic等［24］將脂肪酸和醇類(lèi)對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，氣味分子在結(jié)構(gòu)或是濃度上的微小變化都會(huì)導(dǎo)致嗅覺(jué)受體的識(shí)別變化及組合代碼的變化。不同研究顯示，被同一OR識(shí)別的多種氣味分子在結(jié)構(gòu)上有相似之處，比如含有相同的功能基團(tuán)或脂肪酸的分子長(zhǎng)度等，而識(shí)別同一氣味分子的多個(gè)嗅覺(jué)受體在結(jié)構(gòu)上可能有著共同的模序(圖2)［24］。

圖2 受體組合代碼Fig.2 Combinatorial receptor code

2.3 OR蛋白異源表達(dá) 盡管人們對(duì)OR做了大量的研究，但是到目前為止，對(duì)于OR的配體確定和信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制的了解有限，OR家族中只有很少的蛋白確定了其配體，而阻礙OR特征性描述的主要原因是這些受體在異源細(xì)胞中難以有效表達(dá)。

OR蛋白的7次跨膜結(jié)構(gòu)和強(qiáng)疏水性質(zhì)(膜蛋白)，同時(shí)缺少N-末端信號(hào)肽定位使得它們?cè)诋愒醇?xì)胞中表達(dá)時(shí)不易定位在質(zhì)膜上［25］，難于提取純化。為此，研究者針對(duì)嗅覺(jué)受體蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，對(duì)其在異源系統(tǒng)中表達(dá)做了大量的修飾、選擇，例如在嗅覺(jué)受體基因的N-端加信號(hào)肽(如rho-tag)幫助定位在細(xì)胞膜上，構(gòu)建融合蛋白增加受體蛋白的可溶性，選擇易于表達(dá)的異源系統(tǒng)如大腸桿菌、人胚胎腎細(xì)胞(HEK-293)等［26-28］。Saito 等人從單個(gè)嗅覺(jué)感覺(jué)神經(jīng)元的基因表達(dá)分析中，發(fā)現(xiàn)了3種新穎的蛋白質(zhì)，這3種蛋白質(zhì)可以促進(jìn)OR蛋白在異源系統(tǒng)的表達(dá)［29］，分別為受體運(yùn)輸?shù)鞍?receptor transporting protein，RTP)1、2 和受體表達(dá)增強(qiáng)蛋白1(receptor expression enhancing protein 1，REEP1)。另一些研究組則證實(shí)一些熱休克蛋白作為分子伴侶可以幫助OR蛋白的正確折疊［30］。盡管如此，相對(duì)于龐大的OR家族這些研究還是有限的，OR蛋白在異源系統(tǒng)中穩(wěn)定有效的高表達(dá)還需要進(jìn)一步探索。

3 展望

嗅覺(jué)系統(tǒng)對(duì)生物生存具有重要的作用。隨著近年來(lái)人們?cè)谛嵊X(jué)方面進(jìn)行的大量研究，嗅覺(jué)受體基因、結(jié)構(gòu)及受體蛋白等方面取得了較大的進(jìn)展，盡管如此，相對(duì)于龐大的嗅覺(jué)受體基因家族，這些研究只是冰山一角，許多問(wèn)題有待解決，比如嗅覺(jué)受體基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)制還有待進(jìn)一步探索，嗅覺(jué)受體蛋白在異源系統(tǒng)中的表達(dá)，因其本身結(jié)構(gòu)的限制，在異源系統(tǒng)中定位不準(zhǔn)確，表達(dá)量少等問(wèn)題，嗅覺(jué)受體的氣味配體的確定等等，還待做更進(jìn)一步研究。同時(shí)，近年來(lái)人們將嗅覺(jué)受體與生物傳感器結(jié)合構(gòu)建了仿生嗅覺(jué)傳感器，有望在生物醫(yī)學(xué)、疾病診斷與醫(yī)藥分析、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用，但這兩方面的結(jié)合研究還不夠全面和成熟，有待我們的探索和深入研究。盡管如此，相信隨著生物技術(shù)的發(fā)展，嗅覺(jué)受體的研究會(huì)取得更多的突破，充分發(fā)掘嗅覺(jué)機(jī)能為人類(lèi)創(chuàng)造價(jià)值。

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