王艷杰，張立德，王 健，關(guān)洪全，劉旭東，劉慧慧，柴紀(jì)嚴(yán)，趙金茹，王德山

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽(yáng) 110032)

近年來(lái)對(duì)于5-HT與IBS關(guān)系的研究已成為熱點(diǎn)。因此本課題組通過(guò)建立腹瀉型腸易激綜合征(D-IBS)大鼠模型，并觀察眼針對(duì)該模型大鼠結(jié)腸組織中5-HT表達(dá)的影響，探索眼針對(duì)IBS治療的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性Wistar大鼠30只，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供(許可證編號(hào)SCXK(京)2007-0001)，體重 220g±20g。

1.2 主要試劑和儀器

大鼠 5-HT ELISA試劑盒(美國(guó) ADL公司，Catalogue No:QRCT-301330121013EIA/UTL);兔抗大鼠5-HT抗體(美國(guó) ADL公司)、SABC試劑盒和DAB等(武漢博士德生物工程有限公司)。2010型anthos酶標(biāo)儀(奧地利安圖斯);RM2235型手動(dòng)石蠟切片機(jī)，EG1150C型包埋機(jī)，HI1220型烘片機(jī)(德國(guó)LEICA)，BX51型OLYMPUS反射熒光顯微鏡(日本OLYMPUS)。

1.3 動(dòng)物分組、模型建立和評(píng)價(jià)

30只SPF級(jí)Wistar大鼠按照隨機(jī)數(shù)字法分為正常組、IBS模型組、眼針組3組，每組10只，分籠飼養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)7d以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，然后開始建立D-IBS動(dòng)物模型。其中IBS模型組和眼針組采用慢性應(yīng)激結(jié)合束縛方法建立D-IBS模型。D-IBS的模型建立和評(píng)價(jià)參考王艷杰等［1］的報(bào)道。以 Katz 等慢性應(yīng)激法［2］與 Williams等［3］束縛方法結(jié)合建立D-IBS模型。在18d中讓大鼠隨機(jī)循環(huán)接受6種不同的應(yīng)激刺激，包括:①冷水游泳(14℃，5min);②夾尾(180 s);③禁水(24 h);④禁食(24 h);⑤電擊(電壓為 30 V，電擊 5 s，間歇 5 s，共進(jìn)行120 s);⑥高溫(溫箱中40℃30min);每天隨機(jī)接受1種刺激，18d內(nèi)平均每種刺激3次，同時(shí)每天給予30%水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射麻醉，用膠帶束縛前肩、前上肢及胸部，限制其搔抓頭面部，束縛時(shí)間1h。觀察大鼠一般狀態(tài)、結(jié)腸組織病理學(xué)、結(jié)腸轉(zhuǎn)運(yùn)功能和腸道敏感性等變化對(duì)模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.4 眼針治療方法

模型通過(guò)評(píng)價(jià)后，眼針組給予眼針治療每日1次，連續(xù)針刺 7d。治療方法參考王德山［4］等的報(bào)道。眼針取穴及刺法:用31號(hào)13mm毫針，于大鼠眶周2mm處針刺，定位參照人體取穴方法，取下焦區(qū)、大腸區(qū)、肝區(qū)、脾區(qū)針刺。通過(guò)觸摸大鼠眼周，確定眼眶眶緣的位置，并在標(biāo)記好的穴區(qū)部位，眼眶眶緣上1mm～2mm部位采用斜刺方法進(jìn)行針刺。具體方法:左眼按照順時(shí)針?lè)较?右側(cè)按逆時(shí)針?lè)较?，從該穴區(qū)的起始定位線處斜向下45°角向終止定位線方向進(jìn)針，刺入真皮，達(dá)到皮下組織，進(jìn)針2mm左右，留針20min。留針期間進(jìn)行刮柄刺激，在留針10min時(shí)，采用刮柄法行針1次，刮針柄5下以加強(qiáng)刺激。

1.5 腸道敏感性(腹部回縮反射)檢測(cè)

治療結(jié)束后采用腹部回縮反射(AWR)測(cè)定大鼠腸道敏感性。實(shí)驗(yàn)前禁食12h，乙醚麻醉狀態(tài)下將帶有球囊的導(dǎo)尿管置入距肛門內(nèi)1cm處并固定于尾部，將大鼠限制在特制的透明塑料籠(20cm×6cm×8cm)內(nèi)，只能前后運(yùn)動(dòng)而不能轉(zhuǎn)身。清醒30min后向球囊內(nèi)分別注入溫水?dāng)U張結(jié)、直腸(CRD)，觀察引起大鼠腹部抬起(結(jié)腸擴(kuò)張時(shí)腹肌收縮并抬離桌面)以及背部拱起的壓力閾值(結(jié)腸擴(kuò)張時(shí)骨盆抬起，身體呈弓狀)，進(jìn)行行為評(píng)估。

1.6 血清和結(jié)腸5-HT含量的變化檢測(cè)

治療結(jié)束后，20%烏拉坦(5ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血3ml離心分離血清。在取血后，打開大鼠腹腔取結(jié)腸組織，用預(yù)冷生理鹽水洗去血液，濾紙吸干，按1∶9(結(jié)腸組織:生理鹽水，W∶V)加入生理鹽水制備組織勻漿，離心取上清。取血清和上清液按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)，然后利用全自動(dòng)酶標(biāo)儀，在450nm處測(cè)定各孔的OD值，采用CurveExpert 1.3進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，并計(jì)算出對(duì)應(yīng)的濃度值。

1.7 結(jié)腸5-HT表達(dá)的變化檢測(cè)

利用多聚賴氨酸進(jìn)行防脫片處理，切片常規(guī)脫蠟至水。3%H2O2滅活內(nèi)源性酶，蒸餾水洗3次。熱修復(fù)抗原，冷卻后 PBS洗滌1～2次。滴加5%BSA封閉液，室溫20min。滴加適當(dāng)稀釋的一抗(1∶100)，4℃過(guò)夜。PBS洗2min/3次，滴加生物素化山羊抗小鼠 IgG，20℃ ～37℃孵育 20min。PBS洗5min/2次，滴加試劑 SABC在室溫下孵育 30min。PBS洗5min/4次，DAB顯色，室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間。蒸餾水洗滌，蘇木素輕度復(fù)染、脫水、透明、封片，顯微鏡觀察并拍照。采用 BI2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，選取200倍圖像，觀察結(jié)腸黏膜固有層和肌層，細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色為5-HT陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞，每張切片隨機(jī)選取3～5個(gè)高倍視野測(cè)定平均光密度值，平均光密度值代表陽(yáng)性表達(dá)參數(shù)，平均光密度值越大，陽(yáng)性表達(dá)越強(qiáng)。

1.8 統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS13.0處理，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(珋x±s)表示實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行多組數(shù)據(jù)的方差分析，組間比較采用LSD法。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 眼針對(duì)D-IBS模型大鼠腸道敏感性的影響

表1顯示，與正常組比較，D-IBS模型組背部拱起閾值和腹部抬起閾值均顯著降低(P＜0.01);眼針治療結(jié)束后，和D-IBS模型組比較，眼針組背部拱起閾值和腹部抬起閾值均顯著升高(P＜0.01)。

表1 眼針對(duì)D-IBS模型大鼠背部拱起和腹部抬起閾值的影響(珋x±s)

2.2 眼針對(duì)D-IBS模型大鼠血清和結(jié)腸5-HT含量的影響

表2顯示，與正常組比較，D-IBS模型組5-HT水平顯著升高 (P＜0.01);與D-IBS模型組比較，眼針組5-HT水平降低 (P＜0.01)。

表2 眼針對(duì)D-IBS模型大鼠血清和結(jié)腸5-HT含量的影響(珋x±s)

2.3 眼針對(duì)D-IBS模型大鼠結(jié)腸組織5-HT表達(dá)的影響

圖1顯示，5-HT免疫組化染色呈棕黃色反應(yīng)，各組標(biāo)本均可見(jiàn)免疫染色陽(yáng)性細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞主要表達(dá)在結(jié)腸固有層;與正常組比較，D-IBS模型組細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞著色較深，染色強(qiáng)度增強(qiáng)，平均光密度值顯著升高(P＜0.01);而與D-IBS模型組比較，眼針組免疫組化染色強(qiáng)度降低，表現(xiàn)為著色較淺，平均光密度值顯著降低(P＜0.01)。

圖1 眼針對(duì)IBS模型大鼠結(jié)腸5-HT免疫組化染色強(qiáng)度的影響

3 討論

眼針療法是我院著名老中醫(yī)彭靜山先生于1974年開創(chuàng)的一種獨(dú)特的針刺療法［5、6］。近 40年來(lái)，經(jīng)千萬(wàn)病例證實(shí)眼針對(duì)30余種疾病確有療效，特別對(duì)急性腦中風(fēng)及頑固性疼痛等具有“隨針起效”的顯著療效。彭老是根據(jù)中醫(yī)基礎(chǔ)理論，結(jié)合“五輪八廓”、“八卦”學(xué)說(shuō)創(chuàng)立的眼針療法，他將眼周分為“八區(qū)十三穴”，并認(rèn)為“八區(qū)十三穴絡(luò)腦通臟腑”，通過(guò)觀察穴區(qū)白睛脈絡(luò)形態(tài)和顏色以診斷疾病稱“觀眼識(shí)證”，依據(jù)“觀眼識(shí)證”及臟腑辨證取穴針刺以治療疾病。因此眼針是從整體觀念出發(fā)，認(rèn)為眼與五臟六腑之間依靠經(jīng)絡(luò)的溝通、聯(lián)絡(luò)具有密切聯(lián)系，使全身構(gòu)成一個(gè)有機(jī)的統(tǒng)一整體，維持著人體的正常生命活動(dòng)，若臟腑經(jīng)絡(luò)功能失調(diào)，則可影響到眼睛，使眼睛發(fā)生各種變化。在眼眶邊緣穴區(qū)施針，就可以達(dá)到疏通經(jīng)絡(luò)、調(diào)整臟腑經(jīng)絡(luò)氣血、平衡陰陽(yáng)、調(diào)節(jié)臟腑治療全身疾病的目的。為了進(jìn)一步探索眼針是如何作用于內(nèi)臟及其調(diào)整胃腸道功能的機(jī)制，本課題組提出五臟六腑之精華皆注于目，臟腑功能氣血盛衰均與眼穴相關(guān)聯(lián)，眼針刺激外周相關(guān)穴位，能夠啟動(dòng)靶器官神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞因子等釋放和分泌，從而調(diào)控局部血運(yùn)與代謝、改善其功能效應(yīng)，達(dá)到治療效果的假說(shuō)。為了證明這一假說(shuō)本課題組建立了D-IBS大鼠模型，并采用眼針治療，通過(guò)測(cè)定結(jié)腸組織5-HT的表達(dá)變化，來(lái)探索眼針的作用機(jī)制，從而為豐富眼針的中醫(yī)理論基礎(chǔ)內(nèi)涵提供現(xiàn)代醫(yī)學(xué)依據(jù)。

表3 眼針對(duì)D-IBS模型大鼠結(jié)腸5-HT免疫組化染色強(qiáng)度的影響(珋x±s)

IBS是一組以腹痛或腹部不適，同時(shí)伴有排便習(xí)慣改變和(或)大便性狀異常為主要癥狀的腸道功能性疾病。越來(lái)越多的研究表明，IBS的發(fā)病與精神因素和腸道的刺激因素有關(guān)。應(yīng)激可通過(guò)腦-腸軸影響胃腸道的運(yùn)動(dòng)、分泌、感覺(jué)功能。本實(shí)驗(yàn)采用慢性應(yīng)激結(jié)合急性束縛的方法建立了由精神應(yīng)激引起的IBS大鼠模型，較好地模擬了人類IBS的重要病因-精神創(chuàng)傷。本實(shí)驗(yàn)在造模過(guò)程中，在應(yīng)激刺激下大鼠逐漸出現(xiàn)躲避、畏懼、嘶叫、激惹及好斗傾向，受刺激時(shí)稀便率增加，體重增長(zhǎng)率降低，與人類IBS有一定的相似性，說(shuō)明造模成功。該模型中醫(yī)辨證屬于肝郁脾虛型，因此本實(shí)驗(yàn)以整體觀念為理論基礎(chǔ)，以辨證論治為治療原則，結(jié)合眼針選穴方法，確定疏肝健脾為治療法則，選取下焦區(qū)、大腸區(qū)、肝區(qū)、脾區(qū)為治療腧穴，共奏調(diào)理臟腑、平衡陰陽(yáng)之效。

內(nèi)臟敏感性增加是 IBS患者基本的病理生理改變。包括便秘型和腹瀉型患者都有腹痛或腹部不適，肛門直腸測(cè)壓顯示兩型 IBS患者都存在內(nèi)臟高敏感性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組比較，D-IBS模型組背部拱起閾值和腹部抬起閾值均顯著降低，說(shuō)明模型制備成功;眼針治療結(jié)束后，與D-IBS模型組比較，眼針組背部拱起閾值和腹部抬起閾值均顯著升高，說(shuō)明針刺眼周的相應(yīng)穴區(qū)能夠調(diào)控腸道功能，降低腸道敏感性，但其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

5-羥色胺又稱為血清素(serotonin)，來(lái)源于色氨酸的代謝，人體大約95%的5-HT來(lái)源于腸道，其中90%的5-HT儲(chǔ)存于腸嗜鉻細(xì)胞(enterochromaffin cell，EC)中，10%存在于腸神經(jīng)系統(tǒng)(enteric nervous system，ENS)，且二者均可攝取色氨酸或胺前體在色氨酸羥化酶催化下合成5-HT［7］。外周神經(jīng)系統(tǒng)的5-HT幾乎全部由位于胃腸腺腔底部的EC產(chǎn)生、貯存和再攝?。?］。近來(lái)有報(bào)道［9、10］，腹瀉型 IBS 患者的血漿5-HT濃度較健康人明顯增高。與正常組比較，腹瀉型、便秘型 IBS分泌5-HT的 EC細(xì)胞數(shù)量明顯增多，差異有顯著性。免疫組化染色顯示，IBS組EC細(xì)胞內(nèi)合成的5-HT增加，電鏡顯示腸道EC細(xì)胞功能活躍。EC細(xì)胞對(duì)腸腔內(nèi)壓力和化學(xué)刺激非常敏感，一旦腸腔內(nèi)壓力升高即可分泌5-HT，作用于黏膜下傳入神經(jīng)神經(jīng)元上的5-HT受體，激發(fā)蠕動(dòng)反射并調(diào)節(jié)腸道分泌功能。臨床上［11］慢傳輸性便秘、IBS、功能性腹脹等胃腸功能性疾病患者常伴有明顯的情緒精神狀態(tài)異常，而一些針對(duì)5-HT信號(hào)系統(tǒng)的抗抑郁藥、抗焦慮藥也能有效緩解IBS，這又從另一個(gè)側(cè)面提示5-HT在胃腸道功能性疾病中扮演了重要角色。我國(guó)學(xué)者李兆申等［12］發(fā)現(xiàn)與正常組比較 C-IBS、D-IBS腸道分泌5-HT的 EC細(xì)胞數(shù)量明顯增加，電鏡下見(jiàn)其分泌功能狀態(tài)活躍。Spiller等［13］報(bào)道 IBS患者的直腸活檢標(biāo)本中，含5-HT的EC細(xì)胞數(shù)量增多，可見(jiàn)EC細(xì)胞與 IBS的發(fā)病有一定的聯(lián)系。

本課題的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，與正常組比較，DIBS模型組血清和結(jié)腸組織5-HT水平顯著升高，說(shuō)明腹瀉型腸易激綜合征模型大鼠腸道合成和分泌5-HT增多。而眼針治療后，與D-IBS模型組比較，眼針組血清和結(jié)腸組織5-HT水平降低，說(shuō)明通過(guò)辨證取穴，針刺眼周下焦、大腸、脾和肝區(qū)等穴區(qū)能夠調(diào)控腸道5-HT的合成和分泌，從而調(diào)控腸道功能。本課題實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組標(biāo)本均可見(jiàn)5-HT免疫染色陽(yáng)性細(xì)胞，主要表達(dá)在結(jié)腸固有層;與正常組比較，D-IBS模型組細(xì)胞染色強(qiáng)度增強(qiáng)，表現(xiàn)為細(xì)胞著色較深，進(jìn)一步說(shuō)明腹瀉型腸易激綜合征模型大鼠腸道 EC細(xì)胞數(shù)量增加，合成和分泌5-HT增多。而與D-IBS模型組比較，眼針組免疫組化染色強(qiáng)度降低，表現(xiàn)為著色較淺，說(shuō)明眼針治療能夠減少腸道EC細(xì)胞數(shù)量，減少5-HT的合成和分泌。因此說(shuō)明通過(guò)辨證取穴，眼針刺激外周相關(guān)穴位，啟動(dòng)了靶器官即腸道的5-HT等神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和分泌，從而調(diào)控了結(jié)腸的運(yùn)動(dòng)與代謝功能，改善其功能效應(yīng)，達(dá)到了治療效果，為中醫(yī)理論中五臟六腑之精華皆注于目，臟腑功能氣血盛衰均與眼穴相關(guān)聯(lián)，眼針“八區(qū)十三穴絡(luò)腦通臟腑”提供了現(xiàn)代生物學(xué)支撐依據(jù)。

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