鄭 立, 韓 平, 劉 濤, 崔志松, 郭秀春, 羅 丹, 高 偉

(1. 國家海洋局 第一海洋研究所, 山東 青島 266061; 2. 中國海洋大學(xué), 山東 青島 266003)

海帶中昆布素的熒光定量檢測及提取工藝優(yōu)化

鄭 立1, 韓 平1, 劉 濤2, 崔志松1, 郭秀春1, 羅 丹2, 高 偉1

(1. 國家海洋局 第一海洋研究所, 山東 青島 266061; 2. 中國海洋大學(xué), 山東 青島 266003)

針對昆布素檢測技術(shù)的難點, 利用昆布素與苯胺藍能特異性結(jié)合的特點, 采用熒光分光光度計建立了昆布素含量的熒光快速檢測方法。實驗結(jié)果表明： NaOH濃度對昆布素立體結(jié)構(gòu)影響較大, 在昆布素解旋過程中加入70 μL 3 mol/L的 NaOH 能使昆布素-苯胺藍熒光復(fù)合物具有最大的熒光信號; 通過三維熒光掃描, 確定昆布素-苯胺藍熒光復(fù)合物的最佳激發(fā)和發(fā)射波長分別為398 nm和502 nm, 在此條件下昆布素-苯胺藍熒光復(fù)合物濃度與其熒光值正相關(guān)(R2=0.999 4); 方法學(xué)分析表明： 該測定方法具有較高的精密度(RSD為2.52%)和穩(wěn)定性(RSD為2.09%), 檢測范圍為20～80 mg/L。基于所建立的昆布素含量快速檢測方法, 本文設(shè)計了有關(guān)提取溫度、提取時間、pH以及乙醇濃度四個因素三個水平的正交試驗對海帶中昆布素的提取條件作了初步優(yōu)化, 結(jié)果表明： 海帶中昆布素的最佳提取條件是：置于稀鹽酸(pH為1)溶液中于25℃下提取4 h, 90%乙醇沉淀。

昆布素; 苯胺藍; 熒光; 定量測定; 提取工藝

昆布素(laminarin)又稱海帶淀粉、褐藻淀粉, 其基本結(jié)構(gòu)單位為 β-1,3-葡萄糖苷(圖 1), 是一種低分子質(zhì)量葡聚糖, 廣泛存在于褐藻門、海帶科、昆布屬等植物體中的。

圖1 昆布素基本結(jié)構(gòu)單位圖Fig. 1 The structure of laminarin unit

有報道稱昆布素具有抗腫瘤、抗氧化、保護肝臟、降低血壓等多種生物活性, 還可以作為免疫增強劑, 預(yù)防放療所致造血組織損傷, 刺激造血恢復(fù)及增強癌癥患者的免疫功能[1-4], 所以不少學(xué)者開展了昆布素提取制備的研究, 以加深對其應(yīng)用機理的認(rèn)識, 但目前昆布素仍沒有進行應(yīng)用, 其中最主要的原因之一是對于昆布素含量的測定還沒有簡單易行的方法。盡管利用光譜技術(shù)可以對單糖和多糖進行含量檢測[5], 但如何專門針對昆布素進行特異性檢測還鮮有報道, 大多數(shù)的方法是在提取昆布素后,水解多糖, 測定葡萄糖的含量來推算昆布素的含量。例如, Cameron等[6]就是測定樣品經(jīng)酵母處理前后的還原力差值, 以計算葡萄糖含量來計算昆布素 , 該方法處理時間長, 且步驟繁瑣, 不能得到廣泛應(yīng)用;Miyanishi 等[7]則利用固定化葡萄糖氧化酶及β-1,3-葡萄糖苷酶的裝置酶解昆布素, 通過電流法測定葡萄糖含量來推算昆布素含量, 該方法雖然快速、操作簡單, 但受所須儀器的限制, 所以不適合在實驗室廣泛使用。

如何建立快速, 簡便、準(zhǔn)確的昆布素含量的檢測方法, 是其提取制備的前提, 也為它的應(yīng)用提供基礎(chǔ)依據(jù)。苯胺藍是一種熒光染料, 能與β-1,3-葡聚糖特異性結(jié)合生成熒光復(fù)合物, 熒光強度與β-1,3-葡聚糖正相關(guān)[8], 由于昆布素的基本結(jié)構(gòu)單位為 β-1,3-葡萄糖苷, 所以筆者認(rèn)為昆布素可被苯胺藍標(biāo)記, 但在檢測過程中的最佳條件還需要進一步探討。本文即針對上述問題, 開展了基于熒光染色原理的昆布素快速定量測定方法的研究, 并對海帶昆布素的酸提醇沉提取工藝進行了研究, 針對提取溫度、pH、提取時間以及乙醇濃度四個影響昆布素提取效率的主要因素[9-11], 設(shè)計正交試驗, 采用熒光染色方法定量測定提取到的昆布素, 對昆布素提取條件也進行了初步優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鹽酸(1 mol/L); 氨基乙酸 (0.2 mol/L); 苯胺藍(1 mg/L); 氫氧化鈉 (0.2 mol/L、3 mol/L); 以上藥品均為分析純, 以上溶液均用超純水配制; 昆布素標(biāo)準(zhǔn)品(提取于Laminaria digitata, Sigma), 1 000 mg/L;日本真海帶(Laminaria japonica)。

1.2 實驗儀器

FW100型高速萬能粉碎機; SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵; DHG-9075A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱;EYELA 數(shù)顯水浴鍋 SB-1000; EYELA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀N-1000; TGL-16G臺式離心機; Hitachi FL-4500熒光分光光度計。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗試劑制備

氨基乙酸/氫氧化鈉緩沖液的制備(pH 9.5)： 取250 mL 0.2 mol/L的氨基乙酸溶液和 100 mL 0.2 mol/L NaOH溶液加水定容至1 000 mL。苯胺藍混合染料制備： 取400 mL 1 μg/mL苯胺藍溶液和200 mL 1 mol/L的鹽酸混合, 然后加入600 mL pH 9.5的氨基乙酸/氫氧化鈉緩沖液。

1.3.2 最佳熒光測定及染色條件的確定

自然狀態(tài)下, 昆布素(1,3-β-葡聚糖)結(jié)構(gòu)為三股螺旋, 而在堿性條件下, 其結(jié)構(gòu)會發(fā)生由三股螺旋向單股螺旋的轉(zhuǎn)變(解旋過程), 單股螺旋是與苯胺藍結(jié)合的最佳形式[12-14]。取體積為 65 μL 3 mol/L NaOH, 加水至 100 μL, 與 500 μL 昆布素(1000 μg/mL)溶液混合, 80℃下水浴30 min(解旋反應(yīng)), 水浴完畢后加入1 000 μL苯胺藍混合染料, 50℃水浴30 min 進行染色反應(yīng), 之后將其置于常溫下使未結(jié)合的苯胺藍染料褪色。反應(yīng)完畢后在激發(fā)波波長300～450 nm, 發(fā)射波波長300～600 nm范圍內(nèi)對其進行三維熒光掃描, 根據(jù)三維熒光光譜, 確定最佳激發(fā)和發(fā)射波長。本文所有熒光檢測均以超純水作空白對照, 并均設(shè)有三個平行樣。

在昆布素解旋過程中, 分別加入不同體積的NaOH(3 mol/L)溶液, 以上述確定的最佳激發(fā)和發(fā)射波長對昆布素-苯胺藍熒光復(fù)合物進行二維掃描, 確定昆布素的最佳解旋條件。加入的 NaOH體積分別為 55、60、66、70、75、80、85、90 μL。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及方法學(xué)考察

配制系列濃度為 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 mg/L的昆布素標(biāo)準(zhǔn)品溶液, 按照1.3.2確定的最佳激發(fā)發(fā)射波長及熒光染色條件, 通過二維掃描建立昆布素濃度與其熒光信號的線性關(guān)系方程并確定線性范圍。將標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至低濃度進行熒光測定, 測其峰高響應(yīng)值及極限噪音強度, 以三倍信噪比計算昆布素的檢出限。將昆布素標(biāo)準(zhǔn)品溶液熒光染色后重復(fù)測定6次, 計算RSD (相對標(biāo)準(zhǔn)偏差), 并在其熒光染色后0、8、16、24 h分別進行測定, 計算其RSD, 考察穩(wěn)定性。

1.3.4 昆布素的提取

將海帶樣品50℃過夜烘干后粉碎成末, 稱取10 g干海帶粉末, 置于含200 mL鹽酸溶液三角瓶中提取, 間歇攪拌。對溫度、提取時間、pH及乙醇濃度4個因素進行3個不同水平的正交試驗分析。表1為本實驗設(shè)計的正交試驗因素水平表。

表1 昆布素提取正交試驗因素水平表Tab. 1 The factors and levels of the orthogonal experiment

提取完畢后, 用sevag法除蛋白[15]。提取液離心(5 000 r/min, 20 min), 取上清液, 分別用50%、70%、90%乙醇進行沉淀, 離心后收集沉淀, 60℃烘干, 即為粗多糖。將粗多糖配成濃度為100 mg/L的溶液待用。

1.3.5 不同提取條件海帶粗多糖中昆布素含量的測定

將1.3.4中不同提取條件得到的海帶粗多糖水溶液, 按照 1.3.2確定的條件進行熒光測定, 得到的熒光值代入1.3.3建立的昆布素濃度與熒光信號的線性關(guān)系方程, 計算出昆布素含量, 從而確定最優(yōu)化的昆布素提取條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳測定波長及最佳染色條件的確立

本實驗對昆布素-苯胺藍熒光復(fù)合物進行三維熒光掃描, 圖2為其三維熒光譜圖, 可以看出在激發(fā)波波長300～450 nm, 發(fā)射波波長300～600 nm范圍內(nèi)有一強峰, 其對應(yīng)值即最佳激發(fā)和發(fā)射波長, 分別為398 nm和502 nm。為了確定苯胺藍對昆布素染色反應(yīng)最佳條件, 在昆布素解旋過程中分別加入不同體積的NaOH(3 mol/L)溶液, 在激發(fā)波波長398 nm、發(fā)射波波長502 nm條件下測定熒光信號, 其相關(guān)結(jié)果見圖3。

圖2 昆布素標(biāo)準(zhǔn)品與苯胺藍復(fù)合物三維熒光圖(65 μL 3mol/L NaOH)Fig. 2 3D fluorescent spectroscopy of laminarin and aniline blue fluorescent complex

圖3 昆布素解旋過程加入NaOH(3 mol/L)體積對二維熒光信號強度的影響Fig. 3 The influence of NaOH on the fluorescence of laminarin-aniline blue complex in the process of laminarin derotation

從圖3可以看出加入70 μL NaOH(3 mol/L)后得到的熒光信號最強, 達到了9 744。 而加入過多或過少的 NaOH都會使熒光信號迅速減弱, 由此可以推斷合適的堿性條件對昆布素-苯胺藍復(fù)合物的信號測定起到非常重要的作用, 即在此堿性條件下, 昆布素的三股螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)閱喂陕菪? 最大限度地與苯胺藍染料結(jié)合生成熒光復(fù)合物。

2.2 方法學(xué)考察

配制系列濃度的昆布素標(biāo)準(zhǔn)品溶液, 以上述確定的最佳熒光染色條件(加入70 μL 3 mol/L NaOH進行解旋)與苯胺藍反應(yīng)生成熒光復(fù)合物, 在激發(fā)波波長 398 nm, 發(fā)射波波長 502 nm下檢測熒光信號強度。昆布素濃度與熒光信號呈線性相關(guān), 其線性關(guān)系見圖4。

圖4 昆布素濃度與熒光強度線性關(guān)系(EX398/EM502)Fig. 4 The linear correlation between concentration and fluorescence of laminarin

在濃度20～80 mg/L范圍內(nèi), 昆布素濃度與熒光強度線性關(guān)系良好,R2達到了 0.999 4, 其回歸方程為A=5.2034C-4.9(式1), 式中C為昆布素的濃度,A為昆布素苯胺藍熒光復(fù)合物信號強度(EX398/EM502)。將標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋至低濃度, 測得其檢出限為0.75 mg/L。根據(jù)重復(fù)測定6次測定的結(jié)果, 計算RSD為2.52%, 說明該方法重復(fù)性良好。根據(jù)樣品染色后 0、8、16、24 h分別進行測定的結(jié)果,計算出其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 RSD為 2.09%, 說明昆布素的苯胺藍熒光復(fù)合物在24 h內(nèi)化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。

2.3 海帶中昆布素提取條件的優(yōu)化

將海帶多糖粗樣品通過所建立的昆布素含量測定方法, 計算得到不同提取條件下昆布素的含量(表 2)。

表2 昆布素提取正交試驗與結(jié)果Tab. 2 Orthogonal experiment program and results of laminarin extraction

在設(shè)計四因素三水平正交試驗中, 9組實驗結(jié)果顯示10 g干海帶中昆布素的提取量在15.3 mg到67.5 mg之間; 根據(jù)極差分析, pH對昆布素提取效率影響最大; 昆布素提取的最佳提取條件是： 稀鹽酸(pH為1)溶液于25℃下提取4 h, 提取液用90%的乙醇進行沉淀, 在此條件下, 進行了 10 g干海帶昆布素的提取, 含量達到70.1 mg。

3 討論

昆布素為低分子量β-1,3-葡聚糖, 本身無紫外可見光吸收及熒光特性, 目前對昆布素含量的檢測多采用衍生化手段, β-1,3-葡聚糖特有的 3股螺旋的立體結(jié)構(gòu)使其能與剛果紅[14]、苯胺藍[8]、熒光增白劑[16]等衍生試劑特異性結(jié)合。昆布素與剛果紅結(jié)合形成的復(fù)合物在550 nm處有吸收, 可用于昆布素的含量檢測, 但是該方法操作復(fù)雜, 檢出限極低, 不適用于常規(guī)實驗室的檢測; 而使用熒光增白劑時, 由于本底值過高, 與昆布素結(jié)合后的熒光值較大且容易溢出, 超出檢測限, 使得測定結(jié)果不準(zhǔn)確。Ko 等[8]曾利用衍生試劑苯胺藍, 采用熒光方法檢測了食物中β-1,3-葡聚糖的分布情況, 但是目前還沒有針對海帶中昆布素的衍生化定量快速檢測方法, 而這也是限制海帶昆布素提取制備及其應(yīng)用的主要瓶頸。

本文對昆布素?zé)晒鉁y定方法進行了研究, 利用苯胺藍染料與昆布素特異性結(jié)合原理, 驗證了 Ko方法[8]中的熒光復(fù)合物的最佳激發(fā)和發(fā)射波長(EX398/EM502), 并在此基礎(chǔ)上優(yōu)化染色條件, 確定了染色過程中最佳的 NaOH濃度, 建立了針對海帶中昆布素含量的熒光測定方法, 方法學(xué)考察表明其具有較高的精密度(RSD=2.52%)和穩(wěn)定性(RSD=2.09%), 與 Cameron[6]法以及 Miyanishi[7]法相比, 更簡便和快速, 更適用于實驗室應(yīng)用, 是昆布素含量有效的檢測手段, 可以促進昆布素功能的研究開發(fā),具有良好的應(yīng)用前景。

分析發(fā)現(xiàn)海帶中多糖的主要成分為褐藻膠(algin)、褐藻糖膠(fucoidan) 和昆布素(laminarin) 3種, 海帶粗多糖可采用熱水、稀酸、弱堿、酶等方法進行提取[9,10,17], 可根據(jù)所需要的特定多糖組分進行選擇。由于algin和fucoidan在海帶多糖中的含量較高, 所以上述提取方法獲得的海帶多糖主要是這兩種多糖; 而昆布素在海帶中的含量少(約占海帶干重的0.5%～1%)[18]、分子質(zhì)量小(＜104D)[19-20], 不容易提純, 所以專門針對昆布素的提取研究還少有報道,一般采用弱酸進行提取[18,21]。本文通過正交試驗初步優(yōu)化了海帶中昆布素的弱酸提取工藝, 結(jié)果顯示低pH及高乙醇濃度時昆布素的提取率最高, 認(rèn)為較低的pH有利于多糖的提取; 高濃度乙醇有利于低分子量多糖的沉淀, 但提取時間不宜過長, 長時間提取可能導(dǎo)致多糖的降解, 分子質(zhì)量變小, 不利于乙醇對昆布素的沉淀。

[1] Bohn J A, BeMiller J N. (1,3)- β-D-glucan as biological response modifiers： a review of structure-functional activity relationship [J]. Carbohydr Polym, 1995, 28(1)：3-14.

[2] Wakshull E, Brunke-Reese D, Lindermuth J, et al.PGG-glucan, a soluble β-(1,3)-glucan, enhances the oxidative burst response, microbicidal activity, and activates an NFkB-like factor in human PMN： evidence for a glycosphingolipid β-(1,3)-glucan receptor [J].Immunopharmacology, 1999, 41(2)： 89-107.

[3] 許鳳清, 吳皓. 海帶多糖的研究進展[J]. 中國中醫(yī)藥信息雜志, 2005, 12(6)： 107-109.

[4] Kim K H, Kim Y W, Kim H B, et al. Anti-apoptotic activity of laminarin polysaccharides and their enzymatically hydrolyzed oligosaccharides from Laminaria japonica [J]. Biotechnol Lett, 2006, 28(6)： 439-446.

[5] Myklestad S M, Skanoy E, Hestmann S. A sensitive and rapid method for analysis of dissolved mono-and polysaccharides in seawater [J]. Marine Chem, 1997,56(3-4)： 279-286.

[6] Cameron M C, Ross A G, Percival E G V. Methods for the routine estimation of mannitol, alginic acid and combined fucose in seaweeds [J]. J Soc Chem Ind,1948, 67(4)： 161-164.

[7] Miyanishi N, Inaba Y, Okuma H, et al. Amperometric determination of laminarin using immobilized beta-1,3-glucanase [J]. Biosens Bioelectron, 2004,19(6)： 557-562.

[8] Ko Y T, Lin Y L. 1,3-β-Glucan quantification by a fluorescence microassay and analysis of its distribution in foods [J]. J Agric Food Chem, 2004, 52(11)：3313-3318.

[9] 陳彥, 謝繼鋒, 金先菊, 等. 海藻多糖的分離純化和組成分析 [J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2003, 31(5)： 710-717.

[10] 杜斌, 韓華云, 張秋榮. 昆布多糖的提取分離及 F1的純化與鑒定 [J]. 中國藥學(xué)雜志, 2002, 37(9)：657-659.

[11] 郭亞貞, 慥王, 曲鵬鵬. 香菇多糖的純化和結(jié)構(gòu)分析[J]. 上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報, 2000, 9(3)： 276-279.

[12] Arnosti C. A new method for measuring polysaccharide hydrolysis rates in marine environments [J]. Organic Geochemistry, 1996, 25(1-2)： 105-115.

[13] Arnosti C. Fluorescent derivatization of polysaccharides and carbohydrate-containing biopolymers for measurement of enzyme activities in complex media [J].Journal of Chromatography B, 2003, 793(1)： 181-191.

[14] Mao C F, Hu M C, Wang W H. Physicochemical characterization of grifolan： Thixotropic properties and complex formation with Congo Red [J]. Carbohydrate Polymers, 2007, 68(3)： 502-510.

[15] 夏泉, 劉鋼, 葛朝亮, 等. Sevag法去除黃芪粗多糖中蛋白質(zhì)成分的研究 [J]. 安徽醫(yī)藥, 2007, 11(12)：1069-1071.

[16] Nishikawa S, Zinkl G M, Swanson R J, et al. Callose(β-1,3 glucan) is essential for Arabidopsis pollen wall patterning, but not tube growth [J]. BMC Plant Biol,2005, 5： 22-28.

[17] 林英, 曹松屹, 曹冬煦, 等. 海帶多糖提取方法研究進展[J]. 水產(chǎn)科技情報, 2008, 35(4)： 168-170.

[18] Zvyagintseva T N, Shevchenko N M, Popivnich I B, et al. A new procedure for the separation of water-soluble polysaccharides from brown seaweeds [J].Carbohydrate Research, 1999, 322 (1-2)： 32-39.

[19] 韓平, 鄭立, 劉濤, 等. 高效液相色譜柱后衍生法在線測定海帶淀粉的相對分子質(zhì)量 [J]. 分析測試學(xué)報,2009, 28(9)： 1066-1068.

[20] Rioux L E, Turgeon S L, Beaulieu M. Effect of season on the composition of bioactive polysaccharides from the brown seaweed Saccharina longicruris [J].Phytochemistry, 2010, 71(13)： 1586-1595.

[21] 紀(jì)明侯. 海藻化學(xué) [M]. 北京： 科學(xué)出版社, 1997：308-309.

Fluorescence quantitative detection and extraction process optimization of laminarin from kelp

ZHENG Li1, HAN Ping1, LIU Tao2, CUI Zhi-song1, GUO Xiu-chun1, LUO Dan2,
GAO wei1
(1. The First Institute of Oceanography, State Oceanic Administration, Qingdao 266061, China; 2. Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

Mar.,10,2011

Laminarin; Aniline blue; Fluorescence; Quantification; Extraction technique

Laminarin is a series of bioactive low-molecular weight glucan. Aiming at resolving the difficulty of laminarin quantification in kelp, a rapid analytical method based on aniline blue staining was established. Aniline blue could combine specifically to laminarin and form a fluorescent complex which could be detected by fluorospectrophotometer. The results show that the concentration of NaOH significantly influenced the three dimensional structure of laminarin. The fluorescence intensity of laminarin-aniline blue complex reached the maximum when 70 μL of 3 mol/L NaOH was added during the process of laminarin despiralization. The optimal excitation and emission wavelengths of the fluorescent complex were 398 nm and 502 nm respectively. A linear correlation between the concentration of the complex range from 20～80 mg/L and the fluorescent intensity was obtained(R2=0.9994). The methodological study indicated that the repeatability and stability of this analytical method were 2.52% and 2.09% respectively. Using above laminarin quantitative method, we also studied the optimal extraction technique of laminarin through orthogonal experiment. The results show that the optimal condition is to keep kelp powder in hydrochloric acid (pH=1) solution for 4 hours at 25°C and precipitate laminarin with 90% ethanol.

Q539

A

1000-3096(2012)05-0075-06

2011-03-10;

2011-04-18

海洋公益性行業(yè)專項項目(200805039); 國家自然科學(xué)基金資助項目(41076108, 40806053)

鄭立(1976-), 男, 湖北武漢人, 副研究員, 從事海洋活性物質(zhì)研究, 電話： 0532-88961802; E-mail： zhengli@fio.org.cn

(本文編輯：康亦兼)