王淑芳, 陳 月 錢媛媛

(1. 淮海工學(xué)院 海洋學(xué)院, 江蘇 連云港 222005; 2. 淮海工學(xué)院 江蘇省海洋生物技術(shù)重點建設(shè)實驗室, 江蘇 連云港 222005)

深海熱液噴口金屬硫化物中甲烷菌的多樣性研究

王淑芳1,2, 陳 月1, 錢媛媛1

(1. 淮海工學(xué)院 海洋學(xué)院, 江蘇 連云港 222005; 2. 淮海工學(xué)院 江蘇省海洋生物技術(shù)重點建設(shè)實驗室, 江蘇 連云港 222005)

對兩個來自太平洋洋脊胡安·德富卡的兩個熱液煙囪的金屬硫化物4136-2和4148-B1進行甲烷菌甲基輔酶M還原酶的編碼基因mcrA的序列擴增, 構(gòu)建克隆文庫并進行分子進化分析。結(jié)果表明在這個甲烷富集的熱液噴口周圍含有豐富的甲烷產(chǎn)生菌, 沒有任何甲烷氧化菌存在。兩個硫化物樣品的甲烷產(chǎn)生菌種類完全不同。在4136-2硫化物中的甲烷產(chǎn)生菌都與熱液口的高溫環(huán)境有關(guān)系, 主要屬于甲烷球菌目的甲烷暖球菌(Methanocaldococcus), 少部分屬于甲烷火菌目甲烷嗜高熱菌屬的坎氏甲烷嗜高熱菌(Methanopyrus kandleri)。與這兩個屬的可分離菌株的氨基酸同源性為89%～97%, 核苷酸同源性高達92%～100%。4148-B1硫化物中發(fā)現(xiàn)的一類疑似甲基輔酶M還原酶的編碼序列, 它們與已知的甲烷菌mcrA序列核苷酸同源性為69%～72%, 氨基酸同源性僅為43%～47%。這可能是由于4148-B1來自于正在噴發(fā)的超高溫?zé)嵋簢娍谙嚓P(guān)。由于與已發(fā)表的甲烷菌克隆子或菌株同源性較低, 有可能是熱液口特有的以前未發(fā)現(xiàn)的甲烷菌。

胡安·德富卡; 金屬硫化物; 甲烷產(chǎn)生菌; mcrA

20世紀(jì)70年代, 科學(xué)家在東太平洋深海區(qū)發(fā)現(xiàn)的海底熱液口及其周圍生機盎然的生物群。這是生命科學(xué)史上一次具有深遠意義的重大發(fā)現(xiàn), 也是人類認識自然的一大進步。研究熱液口環(huán)境下的微生物群落結(jié)構(gòu)對探索生命起源具有重要的基礎(chǔ)研究意義。

在太平洋洋脊胡安·德富卡(Juan de Fuca Ridge,JDF)熱液場 Endeavour部分, 甲烷濃度高達 1.8～3.4 mmol/L, 二氧化碳濃度高達11.6～18.2 mmol/L, 氫氣濃度高達 50 mmol/L[1]。遠遠高于 EPR、SJdF和Guanymas的熱液口。在東太平洋樣脊一次爆發(fā)過程中,“A”煙囪口中的氫氣從 25 mmol/kg升高到 45 mmol/kg, 甲烷的濃度從 0.13 mmol/kg升高到 0.19 mmol/kg[2]。Gorda熱液噴發(fā)后的甲烷濃度達到背景海水的16倍, 濃度從2 nmol/L到100 nmol/L, 與其他熱液場穩(wěn)定的熱液口環(huán)境中的濃度相似[3]。熱液流體一般含有2～20 mmol/kg的二氧化碳。另外在非常熱的流體中還檢測到約為 300 mmol/kg的二氧化碳[4,5]。豐富的甲烷含量為甲烷氧化菌的生命活動提供必要的物質(zhì)能量, 豐富的氫和二氧化碳為甲烷產(chǎn)生菌的生命活動提供必要的物質(zhì)和能量。生物可以利用這些氣體作為能源維持生長和代謝活動[6]。

Endeavour 熱液系統(tǒng)最重要的特點是熱液流體具有高濃度的甲烷和氨根離子[7]。熱液流體中甲烷的碳同位素組成最高而且出現(xiàn)在海底系統(tǒng)中沒有沉積物覆蓋的位置, 同時這些同位素數(shù)據(jù)與高達背景值900倍的甲烷含量相呼應(yīng), 說明Endeavour熱液場海底有豐富的甲烷產(chǎn)生菌[8]。能夠利用二氧化碳產(chǎn)生甲烷的超嗜熱的甲烷菌已經(jīng)從東太平洋脊(EPR)13°N,21°N[9-11]和胡安·德富卡熱液場的 Main Endeavour附近的熱液煙囪中分離得到[12]。本文采用甲烷菌的甲基輔酶M還原酶α亞單位編碼基因(mcrA)作為分子標(biāo)記檢測甲烷產(chǎn)生古菌和甲烷氧化古菌在胡安·德富卡熱液煙囪的金屬硫化物4148-B1及4136-2中甲烷循環(huán)中發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 菌株、培養(yǎng)基與試劑

大腸桿菌 (Escherichia coli) DH5α 為本實驗室保存; pMD18-T Vector購自寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa Biotechnology (Dalian) Co., Ltd.); 氨芐青霉素 (Amp)購自南京創(chuàng)瑞公司; PCR引物由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成; DNA回收試劑盒購自上海生工公司的; 培養(yǎng)基配制參照 Maniatis等[13]的分子克隆方法。

1.2 采樣點特征描述及金屬硫化物巖石樣品的采集

本試驗所用樣品是2005年秋季, 由中國和美國兩國科學(xué)家在胡安·德富卡洋脊(Juan de Fuca Ridge或JDF)熱液區(qū)由Atlantis/Alvin科考船采集的熱液煙囪樣品。采樣噴口位點如圖1所示。樣品4148是在Main Endeavour熱液場(MEF)采集的一個正在噴發(fā)的煙囪體, 可以清晰地觀察到熱液通道的內(nèi)中外各層, 以及各層礦物不同的顏色, 中心溫度估計超過350℃。煙囪結(jié)構(gòu)在超凈工作臺把煙囪體從煙囪通道到外壁分成三層, 4148-B1是煙囪的最外層, 估計溫度在 100℃。硫化物樣品 4136-2采自 MEF北面的Clam Bed熱液場。Clam Bed熱液場是一個大的熱液彌散流活動場。這里觀察到有微生物席、螃蟹和管狀蠕蟲的存在, 但沒有發(fā)現(xiàn)以前這里的標(biāo)志性生物貽貝(Clam), 探測器顯示此處最高溫度是29.2℃。采集的硫化物樣品迅速冷卻, 放入－20℃冰箱保存直到進行DNA提取。在保存過程中沒有發(fā)現(xiàn)樣品有外觀的變化。

1.3 金屬硫化物樣品中總DNA的提取

硫化物巖石樣品用已滅菌的鑿子和小刀從大的樣品上分離下來, 用研缽研磨。DNA的提取方法參照zhou等[14]的方法。30 mL的離心管加入5g樣品和13.5 mL DNA提取液(100 mmol/L Tris-HCl [pH 8.0], 100 mmol/L EDTA鈉鹽[pH8.0], 100 mmol/L磷酸鈉 [pH 8.0], 1.5 mol/L NaCl, 1% CTAB)和 100μL蛋白酶K(10 g/L)在37℃溫浴30 min。再加入1.5 mL 20% SDS, 在65℃溫浴2 h, 溫浴過程中每隔15～20 min混勻一次。溫浴結(jié)束離心并收集上清, 加入氯仿/異戊醇(24：1)進行抽提兩次。收集上清, 加入 2/3體積的異丙醇進行 DNA沉淀, 離心得到的沉淀就是DNA的粗提物。用1%的瓊脂糖檢測提取的總DNA的大小。粗提物用上海生工的UNIQ-10柱式PCR產(chǎn)物回收試劑盒純化。純化后的DNA放入－80℃冰箱保存。

1.4 mcrA基因PCR擴增

mcrA擴增參照前人的方法[15]用通用引物 ME1(5′-GCM ATG CAR ATH GGW ATG TC-3′)和 ME2(5′-TCA TKG CRT AGT TDG GRT AGT-3′)擴增環(huán)境基因組的mcr基因。反映程序如下： 94℃變性 3 min;再接94℃40 s, 49℃1 min, 72℃1 min, 35個循環(huán); 最后72℃延伸10 min。擴增反應(yīng)體系：DNA (約20～50 ng/μL) 1 μL, Taq 聚合酶 Buffer(10×)5μL,dNTP(20 mmol/L) 4 μL,引物(10 pmol/uL)各 1 μL, Mg2+(25 mmol/L)3～5 μL, Taq 酶(1U/μL) 3μL, 補水至 50 μL。擴增2～3管重復(fù), 產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收。

1.5 mcrA基因的文庫構(gòu)建及陽性菌篩選

對PCR產(chǎn)物進行膠回收以純化mcrA基因片段,然后用pMD18-T克隆試劑盒(TaKaRa)按照操作說明連接到pMD18-T載體并轉(zhuǎn)化到DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞,從而構(gòu)建 mcrA基因的克隆文庫。37℃培養(yǎng)12～16 h后, 用 pMD18-T載體的通用引物 UPI(5′-GGAAACAGCTATGACCATG-3′)和 UPII(5′-TTGGGTAACGCCAGGGT-3′)進行菌落 PCR, 檢測插入片段大小。檢測到插入片段在960 bp左右的克隆子為陽性。隨機挑選不同數(shù)目的克隆子進行測序。測序數(shù)目根據(jù)多樣性指數(shù)的計算結(jié)果進行, 以文庫的庫容(Coverage)[16]達到85%以上為標(biāo)準(zhǔn)。

1.6 mcrA陽性克隆子測序及序列分析

引物M13+/-的PCR產(chǎn)物用Applied Biosystems 3730xl 測序儀進行序列核苷酸測序。核苷酸序列用DNAMAN 6.0蛋白翻譯功能翻譯成氨基酸序列。氨基酸序列和核苷酸序列在 NCBI上的網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫進行同源序列比對, 查找同源性最高的克隆子和菌株并對所有氨基酸序列用ClustalX 1.83進行比對。最終截取78個序列的173個氨基酸用Mega 3.1(http：//www.megasoftware.net/index.html)進行分子進化樹的構(gòu)建, 并以1000次的步長和臨位法進行計算。Dotur[17](http：//www.plantpath.wisc.edu/fac/joh/dotur.html)用來做稀釋曲線和Chao1非參數(shù)豐度度評估及西普森指數(shù)(Simpson)和香農(nóng)指數(shù)(Shanoon index)。庫容(Coverage)用Good[16]的計算公式進行手工計算。最小分類操作單元(OTUs)用來定義不同的克隆子群,本文以古菌mcrA氨基酸大于等于 98%作為分類最小分類操作單元的標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 Endeavour段Main Endeavour熱液場采樣噴口和樣品圖Fig. 1 Hydrothermal field vent and sample of the endeavour segment main endeavour

2 結(jié)果

口的兩個金屬硫化物巖石中提取的環(huán)境總 DNA進行PCR擴增, 得到約760 bp的片段。克隆到DH5α菌株后, 4136-2隨機挑選34個陽性克隆子, 4148-B1隨機挑選27個陽性克隆子, 將獲得的61個克隆子進行測序。

2.1 甲烷菌甲基輔酶M編碼基因mcrA的文庫構(gòu)建

采用mcrA的通用引物ME1和ME2對來源于熱液

2.2 甲烷菌甲基輔酶 M 編碼基因mcrA序列分析及多樣性評估

獲得的 61個氨基酸序列在 NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)中進行比對, 搜索最同源的克隆子和可培養(yǎng)菌株, 結(jié)果如表1。61個序列中的43個氨基酸序列與甲烷古菌甲烷輔酶 M的α亞基同源, 同源性在 43%～97%之間。同時這 43個序列的核苷酸序列與已發(fā)表的甲烷甲基輔酶M的序列的同源性達到69%～100%。另外18個序列最同序列不是甲烷古菌的mcrA蛋白, 說明在擴增過程中出現(xiàn)了比較嚴重的非特異性擴增。在胡安·德富卡熱液口的金屬硫化物中甲烷菌都屬于廣古菌中的甲烷產(chǎn)生菌。4136-2文庫中 97.06%的甲烷菌來自在甲烷球菌(Methanococcales), 2.94%甲烷菌來自甲烷嗜高熱菌(Methanopyrales)。4148-B1與已知的克隆子及可培養(yǎng)菌株氨基酸同源性只有 43%～47%, 核苷酸同源性為69%～72%, 屬于未知的甲烷古菌。

表1 胡安·德富卡熱液口甲烷菌mcrA序列NCBI數(shù)據(jù)庫比對分析Tab. 1 Analysis of mcrA sequences from JDF vent

本試驗采用自動分析軟件 Dotur對兩個硫化物巖石中的的甲烷古菌進行多樣性評估, 結(jié)果如表2。Shannon-Wiener指數(shù), Simpson's指數(shù)以及Chao1[18-19]無偏估計, 文庫覆蓋率等幾個指數(shù)用來評估構(gòu)建的文庫的多樣性, 以評估文庫對取樣位點甲烷古菌多樣性的反應(yīng)程度。43個mcrA序列以≥98%的氨基酸同源性分為7個OUTs, 兩個OTUs來自4148-B1, 5個OTUs來自4136-2。4136-2和4148-B1mcrA基因構(gòu)建的克隆文庫覆蓋率分別為 94.1%和 88.9%,Shannon-Wiener指數(shù)分別為0.68和0.78, Chao1無偏估計值為5.33和2.00。這表明在胡安·德富卡熱液口甲烷菌的多樣性并不豐富, 試驗中構(gòu)建的兩個文庫得到的 7個 OTUs完全可以代表這兩個位點的甲烷古菌的多樣性分布。比較而言, 4148-B1文庫的H’及1/D較4136-2大, 表明4148-B1文庫的多樣性較4136-2豐富。稀釋曲線(Rarefaction curves)分析(圖2)支持以上結(jié)果。

圖 2 熱液口金屬硫化物巖石中甲烷古菌 mcrA基因多樣性的稀釋曲線Fig. 2 Rarefaction curves of mcrA gene from vent sulfide rock

表2 胡安·德富卡熱液口甲烷菌mcrA基因克隆文庫的多樣性評估Tab. 2 Measurement of mcrA clone library from JDF vent

2.3 甲烷菌甲基輔酶 M 編碼基因mcrA系統(tǒng)進化分析

圖3 胡安·德富卡熱液口甲烷菌mcrA基因編碼的氨基酸的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogentic tree of mcrA gene from JDF vent系統(tǒng)發(fā)育樹采用鄰接法構(gòu)建; 粗體為本研究中獲得的甲烷菌mcrA基因的克隆子, 命名為4136-2和4148-B1分別表示克隆子來自于硫化物樣品4136-2和4148-B1; 分支上的數(shù)值代表經(jīng)1000次計算后的置信度值; 比例標(biāo)尺代表氨基酸5%的置換概率The tree was constructed by Neighbor-Joining Method; the bold ones were got in this study, names 4136-2 and 4148-B1 expressing clones from sulfide rock 4136-2 and 4148-B1, respectively; the values on the branches expressing 1000 bootstrap and the scale expressing 5% exchange rate

NCBI比對結(jié)果為甲烷古菌mcrA的43個序列,用MAGE 3.1構(gòu)建分子進化樹, 如圖3所示。4136-2的mcrA序列與已分離的嗜熱菌有最大同源關(guān)系, 在89%～97%。與克隆子的同源性較菌株低, 在70%～72%。4136-2硫化物中的甲烷菌群落97.06%來自在甲烷球菌(Methanococcales), 2.94%來自甲烷嗜高熱菌(Methanopyrales)。4148-B1序列沒有找到氨基酸同源性超過47%的mcrA序列。核苷酸比對可以找到同源性在 69%～72%的同源序列, 說明這些克隆子序列屬于甲烷菌的甲基輔酶M的編碼基因。多樣性類型4136-2-8與Methanopyrus kandleri[20](GenBank序列號： AE010358)有最大同源關(guān)系, 同源性為95%。多樣性類型 4136-2-14與Methanococcus voltae[21](GenBank序列號： X07793)有最近同源關(guān)系,同源性為 89%。與這兩個序列同源關(guān)系最近的克隆子是來源于酸性泥炭的克隆子 FinME_09[22](GenBank序列號： DQ099689), 同源性分別為71%和70%。4136-2-1與 Methanocaldococcus jannaschii[23](GenBank序列號： F64405)的同源性為 97%。4136-2-20和4136-2-24與Methanocaldococcus jannaschii DSM 2661[23](GenBank 序列號： L77117)有最大同源關(guān)系, 同源性分別為93%和97%。與這三個序列最同源的克隆子 novmcr4[24](GenBank序列號：AF525516)來自富營養(yǎng)湖, 與三個序列的同源性在71%～72%間。樣品4148-B1的mcrA序列4148-B1-3與來源于富營養(yǎng)湖的克隆子novmcr2[24](GenBank序列號： AF525515)同源關(guān)系最近, 為 47%。與之同源關(guān)系最近的菌株是嗜熱菌 Methanopyrus kandleri AV19[25](GenBank序列號： AM114193)氨基酸同源性為 43%, 核苷酸同源性為 72%。另一類型克隆子4148-B1-59與來源于富含甲烷的水稻土壤的克隆子RC-I[25](GenBank 序 列 號 ： NC_009464)及Methanosphaera stadtmanae DSM 3091[26](GenBank序列號： NC_007681)的氨基酸同源性最高, 都是43%。核苷酸比對時, 與RC-I的同源性為69%。

3 分析與討論

3.1 熱液口金屬硫化物甲烷菌類型分析

甲烷菌甲基輔酶M編碼基因mcrA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹分析已經(jīng)表明在胡安·德富卡熱液場熱液口硫化物巖石中甲烷古菌的類型比較豐富, 存在不同類型的甲烷產(chǎn)生菌及一類未知的甲烷菌。溫度較低的硫化物4136-2中的甲烷產(chǎn)生菌與已分離培養(yǎng)的甲烷產(chǎn)生菌有最近的同源關(guān)系。說明胡安·德富卡熱液口與其他熱液口一樣, 其附近環(huán)境中甲烷菌是熱液口附近比較常見的菌種。但熱液通道外壁的硫化物 4148-B1距離噴口較近, 其中的甲烷菌與已知的菌完全不同。

甲烷產(chǎn)生菌是一類絕對厭氧菌, 是產(chǎn)生甲烷的生物來源[27]。甲烷球菌(Methanococcales)生活在中溫、嗜熱或極端嗜熱的環(huán)境中, 通過還原CO2和水生成甲烷產(chǎn)生能量供其活動[28]。胡安·德富卡熱液場周圍環(huán)境含有豐富的二氧化碳和氫氣, 為甲烷產(chǎn)生菌的代謝和活動提供物質(zhì)和能量[6,29-30]。本試驗中克隆子數(shù)最大的一個多樣性類型 4136-2-1(占總數(shù)的82.4%)的 97%的同源菌株 Methanocaldococcus jannaschii(GenBank序列號： F64405)最初分離自太平洋EPR熱液場的白煙囪附近的沉積物中, 發(fā)表在《Science》雜志上。另外一類多樣性類型屬于甲烷火菌(Methanopyrus)。與本試驗中得到的序列最近親緣關(guān)系的甲烷火菌是 Methanopyrus kandleri AV19(GenBank序列號： AE010358)。它是一株超嗜熱菌, 分離自加利福尼亞海灣二氧化碳和氫氣豐富的黑煙囪中, 與其他產(chǎn)甲烷生物一樣還原二氧化碳和水生成甲烷。

3.2 金屬硫化物巖石中甲烷菌類型與環(huán)境的關(guān)系

4136-2和 4148-B1兩個金屬硫化物樣品的甲烷菌甲基輔酶M編碼基因mcrA反映的甲烷菌類型反映了胡安·德富卡熱液口的甲烷菌的類型和變化。4136-2樣品中得到的甲烷菌全部是甲烷產(chǎn)生古菌,且與高溫來源的甲烷球菌及甲烷火菌有最近的同源關(guān)系。這反映了4136-2樣品采集自熱液噴口附近, 并且噴口附近含有豐富的二氧化碳和氫氣, 這與胡安·德富卡的文獻資料報道的相同。4148-B1樣品的克隆子雖然與已知的克隆子序列同源性不高, 但也與熱液口或水稻田等甲烷豐富的環(huán)境相關(guān)。其中一類與嗜熱菌的核苷酸同源性達到 72%, 氨基酸同源性為47%。由于序列很新, 更多的研究需要繼續(xù)。

致謝： 本試驗是在國家海洋局第三海洋研究所海洋生物遺傳資源重點實驗室完成。實驗期間受到實驗室各位老師的指導(dǎo), 在此表示感謝。

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Studies on the biodiversity of methanogens from hydrothermal vent chimney

WANG Shu-fang1,2, CHEN Yue1, QIAN Yuan-yuan1
(1. Huaihai Institute Technology, Oceanography Institute, Lianyungang 222005, China; 2. Key Laboratory of Marine Biotechnology in Jiangsu Province, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China)

Jun.,25,2011

juan de fuca (JDF); sulfide; methogen; mcrA

The chimney sulfides (named 4136-2 and 4148-B1) obtained from Juan de Fuca Ridge were used as samples, aiming at mcrA gene amplification, clone library construction and phylogenetic tree analysis. The results showed that there were only CH4production microbes but no CH4oxidation microbes in the samples and the species in the two sulfides were different. The methanogen from 4136-2 sulfide rock were linked to a high temperature environment. These methanogen belong to Methanocaldococcus and Methanopyrus kandleri. The similarities of protein sequences between 4136-2 clones and isolated Methanocaldococcus and Methanopyrus kandleri strains were from 89% to 97%, and The similarities of mucleotide sequences between 4136-2 clones and isolated Methanocaldococcus and Methanopyrus kandleri strains were from 92% to 100%. The mcrA sequences from 4148-B1 sulfide rock had low identities with sequences deposited in GenBank. The similarities of mucleotide sequences identities of 4148-B1 clones and published mcrA sequences were form 69% to 72%, and the similarities of protein sequences were form 43% to 37%. This also linked to its super high temperature environment and may suggest there were un-discovered methanogen living in the vent.

Q93.3

A

1000-3096(2012)06-0031-08

2011-06-25;

2011-12-11

淮海工學(xué)院引進人才基金項目(KQ09021)

王淑芳(1976-), 女, 河北安國人, 講師, 博士。從事微生物資源研究。電話： 0518-85895427, E-mail： wangshufang2001@hotmail.com

(本文編輯：梁德海)