王瑩瑩，祈 欣，梁春璇，許朵霞，袁 芳，高彥祥，*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083;

2.中國計量科學(xué)研究院，北京 100083）

美拉德反應(yīng)條件對ε－聚賴氨酸－殼聚糖復(fù)合物乳化性及抑菌性的影響

王瑩瑩1，祈 欣2，梁春璇1，許朵霞1，袁 芳1，高彥祥1，*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083;

2.中國計量科學(xué)研究院，北京 100083）

采用干熱美拉德反應(yīng)制備了ε－聚賴氨酸－殼聚糖共價復(fù)合物，研究了反應(yīng)時間及反應(yīng)溫度對共價復(fù)合物乳化性和抑菌性的影響。褐變檢測、凝膠滲透色譜分析以及紅外分析表明:ε－聚賴氨酸和殼聚糖在干熱反應(yīng)后發(fā)生共價交聯(lián)并且結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。當(dāng)ε－聚賴氨酸與殼聚糖質(zhì)量比1∶5時，在70℃下反應(yīng)6h的共價復(fù)合物不僅提高了乳化穩(wěn)定性和乳化活性，而且保留了其抑菌活性。

ε－聚賴氨酸，殼聚糖，美拉德反應(yīng)，乳化性，抑菌性

ε－聚賴氨酸作為新型天然防腐劑，已于2003年10月被FDA批準(zhǔn)為安全食品保鮮劑，而且ε－聚賴氨酸在體內(nèi)可被分解為人體必需的L－賴氨酸，所以ε－聚賴氨酸天然、營養(yǎng)、安全。ε－聚賴氨酸作為天然抗菌劑應(yīng)用于食品工業(yè)中的一個難題是其易與蛋白質(zhì)或酸性多糖結(jié)合，可能造成抗菌活性的喪失［1］。此外，由于ε－聚賴氨酸乳化性能差，使其應(yīng)用受到限制，多用于淀粉食品［1－2］。HoYuTing 等［3］通過凝膠過濾層析法和SDS－PAGE證實了葡聚糖通過美拉德反應(yīng)共價結(jié)合到ε－聚賴氨酸上，該共價接枝物的乳化性能不僅優(yōu)于 ε－聚賴氨酸，還優(yōu)于商業(yè)乳化劑Sunsoft SE－11（蔗糖脂肪酸酯）和Q－18S（多縮丙三醇酯）。而且，該接枝物保留了ε－聚賴氨酸的大部分抑菌能力。殼聚糖是天然多糖中唯一大量存在的堿性氨基多糖，具有很多優(yōu)良特性，包括成膜性、保濕性、抗菌性等，并能發(fā)生諸如水解、螯合、絮凝、吸附等多種化學(xué)反應(yīng)［4］。國內(nèi)外研究表明:殼聚糖具有一定乳化性，可以做乳化劑使用［5－8］。也有學(xué)者將殼聚糖通過美拉德反應(yīng)共價結(jié)合到蛋白質(zhì)上，提高蛋白質(zhì)的乳化性質(zhì)。例如，大豆蛋白的乳化性很低，而Usui等［9］制備的大豆蛋白－殼聚糖接枝物的乳化活性提高了2倍，乳化穩(wěn)定性提高了8倍。本文以ε－聚賴氨酸和殼聚糖為實驗原料，研究了美拉德反應(yīng)條件（主要是溫度和時間）對ε－聚賴氨酸－殼聚糖共價復(fù)合物的乳化性和抑菌性的影響。旨在為新型多功能食品添加劑（乳化劑和抑菌劑）的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

ε－聚賴氨酸 浙江銀象生物工程有限公司;殼聚糖 浙江金殼生物化學(xué)有限公司，脫乙酰度91.3%;葵花籽油 購自超市;實驗菌種 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院微生物實驗室提供;Mueller－Hinton 肉湯培養(yǎng)基（MHB）、Mueller－Hinton瓊脂培養(yǎng)基（MHA） 北京奧博星生物技術(shù)公司。

冷凍干燥機 Alpha 1－2 D Plus 德國 Marin Christ;激光光散射儀DAWN EOS 美國Wyatt公司;高速剪切機Ultra－turrax T25 Digital 德國 IKA公司;高壓均質(zhì)機NS1001L2K 意大利Niro－Soavi公司;激光粒度儀Nano－ZS90 英國Malvern公司;濃縮體系穩(wěn)定性分析儀Turbiscan Lab Expert 法國Formulation公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 ε－聚賴氨酸與殼聚糖共價復(fù)合物的制備及褐變檢測 將ε－聚賴氨酸與殼聚糖以質(zhì)量比1∶5分散于適量去離子水中［10－11］，冷凍干燥后，將凍干粉置于底部盛有飽和KBr（相對濕度79%）的干燥器中，分別采用60、70、80℃反應(yīng)溫度，反應(yīng) 1～12h，在不同的反應(yīng)時間內(nèi)取樣。將上述樣品用1%乙酸溶液配制成總物質(zhì)含量為1%（w/v）的溶液，于420nm處測定吸光值A(chǔ)420，1%乙酸溶液為空白對照［12］。

1.2.2 凝膠滲透色譜（GPC）分離條件 將殼聚糖及其接枝物樣品溶于乙酸緩沖液中，用0.22μm微孔過濾膜過濾后進樣，采用Wyatt EOS光散射檢測器和Wyatt optilab示差檢測器;流速和柱溫分別控制在0.5mL/min和 35.0℃;進 樣 量 200μL;激 光 波長690nm。

1.2.3 紅外分析 將制備好的ε－聚賴氨酸－殼聚糖復(fù)合物溶于乙酸緩沖液，再置于蒸餾水中透析1周，然后將所得透析液冷凍干燥制成干粉。準(zhǔn)確稱取適量樣品，加入一定量干燥的溴化鉀，一同研磨成均勻的粉末，壓成薄片，再用傅里葉紅外分光光度計作全波段（4000～450cm－1）掃描。

1.2.4 乳狀液的制備 將反應(yīng)前后的樣品分別以1%的質(zhì)量濃度溶于醋酸緩沖液（pH4.0）中，攪拌過夜，至完全溶解，形成水相。在高速剪切機的攪拌下緩慢將3mL葵花籽油加入147mL水相中，以10000r/min剪切10min，形成粗乳狀液;再將粗乳狀液通過高壓均質(zhì)機（一、二級均質(zhì)壓力分別為6、60MPa）均質(zhì)三次，制成ε－聚賴氨酸－殼聚糖復(fù)合物乳狀液。

1.2.5 乳狀液粒徑分析 將制備的乳狀液用去離子水稀釋1000倍后，采用Zetasizer Nano－ZS90激光粒度儀室溫分析乳液粒徑大小，結(jié)果以平均粒徑（nm）表示。

1.2.6 乳狀液物理穩(wěn)定性快速評價 本實驗采用Turbiscan Lab Expert濃縮體系穩(wěn)定性分析儀對乳狀液的穩(wěn)定性進行快速分析。儀器采用脈沖近紅外光源（λ=880nm）自下而上掃描樣品，兩個同步光學(xué)探測器分別搜集透射光和背散射光。在一定時間內(nèi)連續(xù)掃描樣品，獲得透射光與背散射光信號對樣品高度的函數(shù)曲線圖，即可反映出樣品中顆粒運動趨勢，進而預(yù)測出納米乳狀液的穩(wěn)定性。實驗選用穩(wěn)定性系數(shù)來分析乳狀液的穩(wěn)定性。穩(wěn)定性系數(shù)越小，表示樣品越穩(wěn)定。實驗中，每個樣品取20mL置于Turbiscan測試瓶中（樣品高度約為43mm），將測試瓶放入檢測池中，溫度設(shè)定為常溫25℃，每30min掃描一次，掃描8h，記錄掃描圖譜。

1.2.7 抑菌實驗 菌種活化:用接種環(huán)將原始菌種接種到新鮮培養(yǎng)基斜面上，于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h;細菌菌懸液制備:從菌種斜面上刮取少量菌體接種于MHB培養(yǎng)基增菌，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)20～24h后，采用活菌計數(shù)法測定菌數(shù)，將制備好的菌液放入4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

稱取一定量不同條件下制備的ε－聚賴氨酸－殼聚糖復(fù)合物溶于1%乙酸溶液（無菌水配制）中，制成濃度為2%的樣品溶液，并用1%乙酸溶液做空白對照。用打孔器制備直徑為6mm的濾紙片。將滅過菌的濾紙片分別放入不同樣品溶液中，浸泡40min，取出待用。將0.1mL 106～107cfu/mL的細菌懸液接種于固體LB培養(yǎng)基上，涂布均勻，用無菌鑷子取浸泡過的濾紙片貼于含菌平板上［13］，再將培養(yǎng)皿于溫度4℃條件下放置2h，然后將細菌培養(yǎng)皿置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。測量抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與討論

2.1 ε－聚賴氨酸－殼聚糖復(fù)合物褐變檢測

溫度對美拉德反應(yīng)影響較大，有研究表明，反應(yīng)溫度與美拉德反應(yīng)速度呈正相關(guān)，溫度相差10℃，反應(yīng)速度相差3～5倍［14］。如圖1所示，60℃條件下，時間對褐變影響不大;隨著溫度的升高，時間對褐變的影響顯著;80℃加熱時，6h以后褐變較為嚴(yán)重。

圖1 不同溫度下Maillard反應(yīng)進程Fig.1 Progress curves of Maillard reaction at different temperatures

2.2 ε－聚賴氨酸－殼聚糖復(fù)合物凝膠滲透色譜分析

圖2中，斜線表示分子量，其斜率由化學(xué)性質(zhì)決定，反映分子鏈的光學(xué)性質(zhì)，斜率發(fā)生變化，表示物質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)發(fā)生變化。由圖2可以看出，ε－聚賴氨酸－殼聚糖混合物（mixture）的斜率明顯區(qū)別于80℃反應(yīng)6h的ε－聚賴氨酸－殼聚糖共價復(fù)合物（conjugate）的斜率，表明ε－聚賴氨酸－殼聚糖混合物在加熱處理下，發(fā)生了Maillard反應(yīng)，共價結(jié)合生成了ε－聚賴氨酸－殼聚糖接枝物。反應(yīng)前后物質(zhì)的相對分子質(zhì)量分布變化如表1所示，接枝物與混合物相比，相對分子質(zhì)量在40ku以下的組分含量減少，相對分子質(zhì)量在20～40ku及15ku以下的組分變化尤其明顯;40～100ku分子段的組分含量略有增加，相對分子質(zhì)量在100ku以上的組分含量增加較多。

2.3 紅外分析

圖2 ε－聚賴氨酸－殼聚糖復(fù)合物凝膠滲透色譜圖Fig.2 The gel permeation chromatographyof ε－polylysine/chitosan

圖3中，ε－聚賴氨酸－殼聚糖共價復(fù)合物與殼聚糖相比，其特征譜帶酰胺Ⅰ譜帶和酰胺Ⅱ譜帶的吸收明顯增強。殼聚糖的還原末端與ε－聚賴氨酸的氨基反應(yīng)形成的席夫堿中的C=N結(jié)構(gòu)引起了1560cm－1處吸收的增強［13］，在殼聚糖與纖維素二糖的美拉德反應(yīng)中也出現(xiàn)了類似的結(jié)果［15］。CH（R1，R2）NH2結(jié)構(gòu)中的C－N伸縮振動在1200～1100cm－1處具有吸收［16］，所以ε－聚賴氨酸－殼聚糖共價復(fù)合物在1153.89cm－1處吸收峰的增強是由共價結(jié)合到殼聚糖上的ε－聚賴氨酸中豐富的α氨基引起的，C－O伸縮也在該處具有吸收［17］。1080cm－1附近出現(xiàn)強C－O伸縮振動吸收峰［18］。以上分析表明，ε－聚賴氨酸與殼聚糖發(fā)生了美拉德反應(yīng)，以共價鍵的形式結(jié)合起來。

表1 ε－聚賴氨酸/殼聚糖復(fù)合物相對分子質(zhì)量分布Table 1 Molecular weight of ε－polylysine/chitosan

圖3 ε－聚賴氨酸、殼聚糖及其共價復(fù)合物FT－IR圖譜Fig.3 FT－IR spectrum of ε－polylysine，chitosan and conjugate

2.4 反應(yīng)條件對ε－聚賴氨酸－殼聚糖共價復(fù)合物制備乳狀液粒徑及穩(wěn)定性的影響

由圖4及圖5可知，熱處理前后的殼聚糖制備乳狀液的粒徑和穩(wěn)定性無差異，可見殼聚糖性質(zhì)穩(wěn)定，干熱處理對其性質(zhì)無影響。通過Maillard反應(yīng)，質(zhì)量比為1∶5的ε－聚賴氨酸－殼聚糖反應(yīng)3h的共價復(fù)合物制備的乳液粒徑比0h的顯著性降低，而且隨著反應(yīng)時間的延長繼續(xù)下降，6h以后趨于穩(wěn)定。在相同時間下，80℃的粒徑最小，70℃次之，60℃最大，表明溫度越高，反應(yīng)程度越高。適度交聯(lián)，可以使直線型的殼聚糖分子形成具有一定分支結(jié)構(gòu)的大分子，能夠有效地包裹油滴［3］，從而提高殼聚糖的乳化活性。ε－聚賴氨酸是陽離子表面活性物質(zhì)，在水中帶正電;分子內(nèi)部有疏水性的亞甲基，外部有親水的羧基和氨基。ε－聚賴氨酸－殼聚糖共價復(fù)合物與殼聚糖相比，增加了殼聚糖的陽離子和亞甲基數(shù)目，提高復(fù)合物乳化性的同時使其具有一定的疏水性，從而使復(fù)合物能快速且緊密地吸附在油水界面上。

圖4 不同溫度和時間對ε－聚賴氨酸－殼聚糖復(fù)合物制備乳狀液粒徑的影響Fig.4 Influence of reaction tempreture andtime during preparation of ε－polylysine－chitosan conjugateson the droplet size of emulsions

ε－聚賴氨酸－殼聚糖共價復(fù)合物的乳化穩(wěn)定性系數(shù)變化如圖5所示，60、70、80℃的穩(wěn)定性系數(shù)在3h時顯著降低，隨著反應(yīng)時間的延長，70、80℃的穩(wěn)定性系數(shù)在6h以后逐漸增大，即乳化穩(wěn)定性變差，80℃尤其明顯，由0h的1.40降至6h的0.61，隨后在9、12h分別增至1.19、1.76。這是由于在80℃條件下，ε－聚賴氨酸與殼聚糖反應(yīng)劇烈造成的。ε－聚賴氨酸若由n個賴氨酸聚合而成，則具有n+1個自由氨基，反應(yīng)基團多，反應(yīng)活性大，尤其是ε－聚賴氨酸末端的ε氨基。Maillard反應(yīng)一般分為三個階段，蛋白質(zhì)－多糖復(fù)合物主要是第一階段的Amadori重排產(chǎn)物中的一類，反應(yīng)時間過長將影響復(fù)合物的功能性［19］。反應(yīng)溫度60℃與80℃相比，反應(yīng)較溫和，3、6、9h的穩(wěn)定性系數(shù)無顯著性差異。在殼聚糖與溶菌酶的

圖5 不同溫度和時間對ε－聚賴氨酸－殼聚糖復(fù)合物制備乳狀液穩(wěn)定性的影響Fig.5 Influence of reaction tempreture and time during preparation of ε－polylysine－chitosan conjugates on emulsions stability

表2 不同溫度、不同時間條件下的ε－聚賴氨酸－殼聚糖共價復(fù)合物對大腸桿菌的抑菌直徑（mm）Table 2 Antibacterial activity of ε－polylysine－chitosan conjugates heated for different reaction tempretures and times on Escherichia coli（mm）

表3 不同溫度、不同時間條件下的ε－聚賴氨酸－殼聚糖共價復(fù)合物對金黃色葡萄球菌的抑菌直徑（mm）Table 3 Antibacterial activity of ε－polylysine－chitosan conjugates heated for different reaction tempretures and times on Staphylococcus aureus（mm）

Maillard反應(yīng)中，共價復(fù)合物由于具有了殼聚糖的陽離子排斥力，可以抑制油滴的聚合，從而提高了其乳狀液的穩(wěn)定性［10］。ε－聚賴氨酸－殼聚糖共價復(fù)合物中由于ε－聚賴氨酸的加入，陽離子增多，分子間靜電排斥力增大，使乳液穩(wěn)定性提高，但是當(dāng)反應(yīng)程度較大時，生成的物質(zhì)分子量過大，交聯(lián)程度過高，蛋白質(zhì)多糖共價復(fù)合物的溶解性降低［19］，從而降低了乳狀液的穩(wěn)定性。

2.5 美拉德反應(yīng)條件對ε－聚賴氨酸－殼聚糖共價復(fù)合物抑菌性質(zhì)的影響

由表2及表3可以看出，不同反應(yīng)程度的ε－聚賴氨酸－殼聚糖共價復(fù)合物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌呈現(xiàn)出不同的抑菌性。1%乙酸空白對照未出現(xiàn)抑菌圈，表明該濃度乙酸溶液對ε－聚賴氨酸－殼聚糖共價復(fù)合物的抑菌性沒影響。對于大腸桿菌，60℃和70℃條件下不同處理時間的ε－聚賴氨酸－殼聚糖共價復(fù)合物的抑菌性未出現(xiàn)變化，而80℃對其影響明顯，加熱3h后抑菌性明顯降低。在60℃和70℃條件下，加熱6h時，ε－聚賴氨酸－殼聚糖共價復(fù)合物對金黃色葡萄球菌的抑菌性明顯降低，由0h時的7.28mm分別下降到7.08、6.75mm，70℃對其影響更為顯著。80℃對金黃色葡萄球菌的影響呈現(xiàn)出與大腸桿菌相同的趨勢。

不同反應(yīng)程度的ε－聚賴氨酸－殼聚糖共價復(fù)合物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌性不同，可能與ε－聚賴氨酸和殼聚糖的抑菌機理有關(guān)。對于殼聚糖的抑菌機理，通常有兩種解釋，一種是大分子的殼聚糖吸附在微生物細胞表面，形成一層高分子膜，阻止了營養(yǎng)物質(zhì)向細胞內(nèi)運輸，從而起到殺菌和抑菌作用［20］;令一種是殼聚糖的正電荷與微生物細胞膜表面的負電荷之間的相互作用，改變了微生物細胞膜的通透性，引起微生物細胞死亡［21］。Vaara［22］和Santini［23］等研究 ε－聚賴氨酸的抑菌機理發(fā)現(xiàn)，ε－聚賴氨酸在水溶液中由于帶有正電荷（－NH+3），能夠與革蘭氏陰性菌細胞外膜結(jié)合并將其破壞，從而導(dǎo)致細胞死亡。Ting等［3］人研究美拉德反應(yīng)對ε－聚賴氨酸抑菌性的影響，發(fā)現(xiàn) ε－聚賴氨酸與葡聚糖在80℃、pH11的條件下，反應(yīng)初期對ε－聚賴氨酸的抑菌性沒有影響，但是延長加熱時間則會導(dǎo)致ε－聚賴氨酸對部分微生物的抑菌濃度有所降低。李春林［24］在亞臨界水體系里研究了這二者的美拉德反應(yīng)，也出現(xiàn)了類似的結(jié)果，在110℃、5MPa下，反應(yīng)達到75min時，復(fù)合物的最小抑菌濃度（MIC）提高到原來的2倍。

表2及表3中，80℃條件下，ε－聚賴氨酸－殼聚糖共價復(fù)合物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌性顯著降低，是由于該條件下ε－聚賴氨酸和殼聚糖反應(yīng)程度較大，造成ε－聚賴氨酸自由氨基大量損失，而自由氨基是ε－聚賴氨酸的“消毒因子”;此外，ε－聚賴氨酸和殼聚糖交聯(lián)過度，導(dǎo)致生成的復(fù)合物分子量過大，分子移動性和靈活性變差，從而降低了其抑菌性。

3 結(jié)論

研究表明，ε－聚賴氨酸、殼聚糖混合物在加熱條件下發(fā)生Maillard反應(yīng)，生成ε－聚賴氨酸－殼聚糖共價復(fù)合物。在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件下（ε－聚賴氨酸、殼聚糖質(zhì)量比1∶5、反應(yīng)溫度70℃、反應(yīng)時間6h），生成的共價復(fù)合物不僅提高了乳化穩(wěn)定性和乳化活性，而且保留了抑菌能力。

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Effect of Maillard reaction conditions on emulsifying properties and antibacterial activity of ε－polylysine－chitosan conjugates

WANG Ying－ying1，QI Xin2，LIANG Chun－xuan1，XU Duo－xia1，YUAN Fang1，GAO Yan－xiang1，*
（1.College of Food Science ＆ Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China;2.National Institute of Metrology，Beijing 100083，China）

In this study，the conjugation of ε－polylysine and chitosan through Maillard reaction under different dry heating conditions had been investigated.Emulsifying properties and antibacterial activity of ε－polylysine－chitosan conjugates were compared at different reaction temperatures and reaction times.The browning at 420nm，gel permeation chromatography of ε－polylysine－chitosan conjugates and FTIR proved the conjugation of ε－polylysine and chitosan.It was found that the conjugates formed from ε－polylysine and chitosan（1∶5 weight ratio）at 70℃ for 6h had excellent emulsifying properties and retained the antibacterial activity of ε－polylysine and chitosan.

ε－polylysine;chitosan;Maillard reaction;emulsifying properties;antibacterial activity

TS202.3

A

1002－0306（2012）17－0134－05

2012－02－15 *通訊聯(lián)系人

王瑩瑩（1986－），女，碩士研究生，研究方向:食品添加劑。

國家自然科學(xué)基金資助項目（31071609）。