劇慧棟，李月穎，張樂祎，李秀娟，趙寶華，徐保紅*

(1.石家莊市疾病預(yù)防控制中心，河北 石家莊 050011;2.河北師范大學(xué)，河北 石家莊 050024)

奶牛乳房炎是奶牛的一種多發(fā)病和常見病，是由多種致病微生物引起的局部病變，對(duì)奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大損失。據(jù)統(tǒng)計(jì)，能引起奶牛乳房炎的微生物主要是細(xì)菌，以無乳鏈球菌(Streptoco-ccus agalactiae)、停乳鏈球菌(S.dysgalactiae)、沙門菌(Salmonella sp.)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)感染居多［1-2］。PCR-焦磷酸測(cè)序技術(shù)是近幾年發(fā)明的一種實(shí)時(shí)DNA序列分析技術(shù)，以快速、準(zhǔn)確、實(shí)時(shí)分析DNA序列見長(zhǎng)，使用該技術(shù)可以在很短的時(shí)間內(nèi)，得到大通量的待測(cè)菌的基因序列，從而鑒定出引起奶牛乳房炎的致病菌種類［3-4］。本文采用生物信息學(xué)分析技術(shù)確定了無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的具有相對(duì)保守區(qū)域的特異性基因，對(duì)所選基因進(jìn)行了序列比對(duì)和分析，以使所獲的基因更具有代表性，避免或減少假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。為了驗(yàn)證PCR-焦磷酸測(cè)序方法的準(zhǔn)確性，選取了大量的目的菌株和參照菌株進(jìn)行了重復(fù)性驗(yàn)證，結(jié)果表明應(yīng)用PCR-焦磷酸測(cè)序方法對(duì)上述奶牛乳房炎4種主要致病菌的檢測(cè)準(zhǔn)確率非常高，沒有出現(xiàn)一例漏檢和誤檢。因此，該方法的建立為奶牛乳房炎致病菌的檢驗(yàn)工作提供了一種新的更加準(zhǔn)確、快速的檢驗(yàn)手段［5-8］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 無乳鏈球菌108株，停乳鏈球菌類馬亞種100株，沙門氏菌136株，金黃色葡萄球菌203株，乳房鏈球菌(Streptococcus agalactiae)、大腸埃希菌(Escherichia coli)、腸侵襲大腸埃希菌(Enteroinvasive E.coli)、腸毒性大腸桿菌(Enterotoxigenic E.coli)、腸出血性大腸埃希菌、腸致病大腸埃希菌(Enterohemorrhagic E.coli)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)、陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)、阪崎腸桿菌(Enterobacter sakazakii)、無害李斯特菌(Listeria innocua)、單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)、假結(jié)核耶爾森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yersinia enterocolitica)、產(chǎn)酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)、肺炎克雷伯菌(K.peneumoniae)、假單胞桿菌(Pseudomonadaceae)、綠膿假單胞桿菌(Pesudomonas pyocyaneum)、宋內(nèi)志賀菌(Sh.sonnei)、福氏志賀氏菌(Sh.flexneri)、痢疾志賀氏菌(Sh.dysenteriae)、鮑氏志賀氏菌(Sh.boydii)、黏質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)、產(chǎn)堿普羅威登斯菌(Providencia Ewing)、副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolyticus)、蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)、弗勞地檸檬酸桿菌(Citrobacterpneumonia)、變形桿菌(proteusbacillus vulgaris)、奇異變形桿菌(Proteus m irabilis)、摩爾根氏變形桿菌(Morganella morganii subsp.morganii)各1株。以上菌株均由石家莊市疾病預(yù)防控制中心提供。

1.1.2 儀器與試劑 PCR儀(美國(guó)PE公司);焦磷酸檢測(cè)儀PyroMark ID型(瑞典Biotage公司);GoTaqMasterMix(美國(guó)Promega公司);焦磷酸測(cè)序劑盒PyroGold Reagents、磁珠(瑞典 Biotage公司);DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Trans2K Plus、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Trans2K(北京全式金生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)無乳鏈球菌 sip基因(GenBank:FJ752156.1)、停乳鏈球菌 isp基因(GenBank:CP002215.1)、沙門氏菌 stn 基因(GenBank:L16014.1)和金黃色葡萄球菌 clfa基因(GenBank:FJ808734.1)分別設(shè)計(jì)4對(duì)PCR擴(kuò)增引物和4條焦磷酸測(cè)序引物，詳見表1。

表1 特異性引物Table 1 Specific primers

1.2.2 PCR模板的制備 各菌株復(fù)蘇后，于各自的選擇性液體培養(yǎng)基中37℃過夜振蕩培養(yǎng)。取培養(yǎng)后的菌液各1 mL，13000 r/min離心2 min后棄上清，加入500 μL的1×TE 溶液(pH 8.0)，吹打混勻后沸水浴10 min，冷卻至室溫，13000 r/min離心2 min后取上清，于－20℃保存，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)作為模板使用。

1.2.3 PCR 擴(kuò)增 PCR 反應(yīng)體系(50 μL):2×Go Taq Master Mix 25 μL，上游引物和下游引物各10 pmol，模板1 μL，以無菌去離子水定容至50 μL。PCR反應(yīng)參數(shù):94℃預(yù)變性5 min;94℃變性1 min，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。取反應(yīng)產(chǎn)物5 μL于20 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。所有擴(kuò)增重復(fù)3次。

1.2.4 焦磷酸單鏈模板的制備 ①將PCR產(chǎn)物30 μL轉(zhuǎn)移至96孔PCR板中，在產(chǎn)物中分別加入磁珠 3 μL和結(jié)合緩沖液(Binding Buffer，含 10 mmol/L 的 Tris-HCl，2 mol/L 的 NaCl，1 mmol/L的 EDTA，0.1%的 Tween-20，pH 7.6)47 μL，室溫震蕩混勻10 min;②打開真空泵，將真空預(yù)裝工具(Vacuum Prep Tool)在超純水中清洗30 s，然后轉(zhuǎn)移到96孔PCR板中，抓取磁珠，分別在70%乙醇、變性緩沖液(Denaturation Buffer;0.2 mol/L NaOH)、洗滌緩沖液(Washing Buffer，含 10 mmol/L 的 Tris-Acetate，pH 7.6)中清洗5 ～10 s，最后將其放入96孔測(cè)序板中，該板中預(yù)先加入0.3 μmol/L的測(cè)序引物和退火緩沖液(Annealing Buffer，含 20 mmol/L 的 Tris-Acetate，2 mmol/L 的Mg-Acetate，pH 7.6)共 45 μL，關(guān)閉真空泵，充分震蕩搖動(dòng)以釋放磁珠。

1.2.5 焦磷酸測(cè)序 將放有樣品的96孔測(cè)序板于80℃恒溫箱中放置2 min，自然冷卻至室溫。將酶混合物、底物混合物和4類dNTP(dATPαS、dTTP、dCTP、dGTP)分別加入試劑艙固定位置。設(shè)定程序，將試劑艙和96孔測(cè)序板放入機(jī)箱中進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。所有測(cè)序重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

利用1.2.1中設(shè)計(jì)的PCR擴(kuò)增引物擴(kuò)增各菌株的特異基因片段，經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳后觀測(cè)，使用無乳鏈球菌sip基因特異性引物對(duì)108株無乳鏈球菌PCR擴(kuò)增出的片段長(zhǎng)度均約為142 bp，使用停乳鏈球菌isp基因特異性引物對(duì)100株停乳鏈球菌PCR擴(kuò)增出的片段長(zhǎng)度均約為64 bp，使用沙門氏菌stn基因特異性引物對(duì)136株沙門氏菌PCR擴(kuò)增出的片段長(zhǎng)度均約為107 bp，使用金黃色葡萄球菌clfa基因特異性引物對(duì)203株金黃色葡萄球菌PCR擴(kuò)增出的片段長(zhǎng)度均約為169 bp。3次重復(fù)性擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同。其中部分無乳鏈球菌株的sip基因擴(kuò)增結(jié)果如圖1A所示;部分停乳鏈球菌株的isp基因擴(kuò)增結(jié)果如圖1B所示;部分沙門氏菌株的stn基因擴(kuò)增結(jié)果如圖1C所示;部分金黃色葡萄球菌株的clfa基因擴(kuò)增結(jié)果如圖1D所示。

圖1 4種基因片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果

為檢驗(yàn)使用上述4種基因的特異性引物對(duì)其他菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)是否會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性，分別使用上述4對(duì)特異性引物對(duì)1.1.1中所述所有菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)。其中使用無乳鏈球菌sip基因特異性引物擴(kuò)增的部分結(jié)果顯示，sip基因特異性引物只擴(kuò)增出無乳鏈球菌的大小為142 bp的sip基因片段，而其他菌株未擴(kuò)增出基因片段(如圖2A，部分的16株參照菌株);使用停乳鏈球菌isp基因特異性引物的擴(kuò)增檢測(cè)的部分結(jié)果顯示，isp基因特異性引物只擴(kuò)增出停乳鏈球菌的大小為64 bp的isp基因片段，而其他菌株未擴(kuò)增出基因片段(如圖2B部分的16株參照菌株)。

圖2 部分參照菌株使用4種基因特異性引物擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Detection results of some reference strains by PCR with the four gene fragments specific primers

使用沙門氏菌stn基因特異性引物的擴(kuò)增檢測(cè)的部分結(jié)果顯示，stn基因特異性引物只擴(kuò)增出沙門氏菌的大小為107 bp的stn基因片段，而其他菌株未擴(kuò)增出基因片段(如圖2C部分的16株參照菌株);使用金黃色葡萄球菌clfa基因特異性引物的擴(kuò)增檢測(cè)的部分結(jié)果顯示，clfa基因特異性引物除擴(kuò)增出金黃色葡萄球菌的大小為169 bp的clfa基因片段外，痢疾志賀氏菌和副溶血弧菌分別于DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Trans2K Plus的500 bp和250 bp指示條帶之間出現(xiàn)條帶，而其他菌株未擴(kuò)增出條帶(如圖2D部分的16株參照菌株)。1.1.1中所述的且圖2中不包括的其他菌株的擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果均未檢測(cè)出擴(kuò)增條帶，且3次重復(fù)性擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同，在此未一一列出。

2.2 焦磷酸測(cè)序結(jié)果

圖3 無乳鏈球菌sip基因擴(kuò)增片段焦磷酸測(cè)序結(jié)果Fig.3 Pyrosequencing results of Streptococcus agalactiae sip gene fragment

圖4 停乳鏈球菌isp基因擴(kuò)增片段焦磷酸測(cè)序結(jié)果Fig.4 Pyrosequencing results of S.dysgalactiae isp gene fragment

將2.1中無乳鏈球菌sip基因擴(kuò)增片段、停乳鏈球菌isp基因擴(kuò)增片段、沙門氏菌stn基因擴(kuò)增片段、金黃色葡萄球菌clfa基因擴(kuò)增片段按照1.2.4和1.2.5 所述方法進(jìn)行焦磷酸測(cè)序。無乳鏈球菌sip基因擴(kuò)增片段的焦磷酸測(cè)序結(jié)果為5'-GTTGCTGGTGTTTCTATTTTC-3'(如圖3)，與無乳鏈球菌sip基因序列(GenBank:FJ752156.1)比對(duì)結(jié)果為100%;停乳鏈球菌isp基因擴(kuò)增片段的焦磷酸測(cè)序結(jié)果為5'-TACTGACATCACTGGAAGTGGTAAACG-3'(如圖4)，與停乳鏈球菌isp基因序列(GenBank:CP002215.1)比對(duì)結(jié)果為100%;沙門氏菌stn基因擴(kuò)增片段的焦磷酸測(cè)序結(jié)果為5'-GCTGAAGGAGATTAAAGCG-3'(如圖5)，與沙門氏菌stn基因序列(GenBank:L16014.1)比對(duì)結(jié)果為100%;金黃色葡萄球菌clfa基因擴(kuò)增片段的焦磷酸測(cè)序結(jié)果為5'-AAACCATAATTCAGTTT-3'(如圖6)，與金黃色葡萄球菌clfa基因序列(GenBank:FJ808734.1)比對(duì)結(jié)果為100%。

圖5 沙門氏菌stn基因擴(kuò)增片段焦磷酸測(cè)序結(jié)果Fig.5 Pyrosequencing results of Sa.sp.stn gene fragment

圖6 金黃色葡萄球菌clfa基因擴(kuò)增片段焦磷酸測(cè)序結(jié)果Fig.6 Pyrosequencing results of St.aureus clfa gene fragment

由于圖2D中以金黃色葡萄球菌clfa基因特異性引物進(jìn)行參照菌株擴(kuò)增檢測(cè)時(shí)，痢疾志賀氏菌和副溶血弧菌分別于DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Trans2K Plus的500 bp和250 bp指示條帶之間有基因片段擴(kuò)增出，因此將此二項(xiàng)PCR產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測(cè)序。痢疾志賀氏菌擴(kuò)增片段的焦磷酸測(cè)序結(jié)果無有序信號(hào)測(cè)出(如圖7)，測(cè)序失敗。副溶血弧菌擴(kuò)增片段的焦磷酸測(cè)序結(jié)果同樣無有序信號(hào)測(cè)出(如圖8)，測(cè)序失敗。

圖7 基于clfa基因特異引物對(duì)痢疾志賀氏菌擴(kuò)增出的條帶的焦磷酸測(cè)序結(jié)果Fig.7 Pyrograms obtained by pyrosequencing of the band，which was amplified from Sh.dysenteriae with the specific primers of clfa gene

圖8 基于clfa基因特異引物對(duì)副溶血弧菌擴(kuò)增出的條帶的焦磷酸測(cè)序結(jié)果Fig.8 Pyrograms obtained by pyrosequencing of the band，which was amplified from V.parahaemolyticus with the specific primers of clfa gene

2.3 檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)PCR擴(kuò)增結(jié)果及焦磷酸測(cè)序結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(表2)。

表2 所有菌株的PCR及焦磷酸測(cè)序結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 2 The statistical analysis of PCR and pyrosequencing results of all reference strains

由表2可見，在所有參照菌中，以無乳鏈球菌sip基因特異引物進(jìn)行PCR及焦磷酸測(cè)序，只有無乳鏈球菌(所有的108株)PCR成功擴(kuò)增出條帶并得到正確的焦磷酸測(cè)序結(jié)果，而其他參照菌株P(guān)CR均無條帶擴(kuò)出;以停乳鏈球菌isp基因特異引物進(jìn)行PCR及焦磷酸測(cè)序，只有停乳鏈球菌(所有的100株)PCR成功擴(kuò)增出條帶并得到正確的焦磷酸測(cè)序結(jié)果，而其他參照菌株P(guān)CR均無條帶擴(kuò)出;以沙門氏菌stn基因特異引物進(jìn)行PCR及焦磷酸測(cè)序，只有沙門氏菌(所有的136株)PCR成功擴(kuò)增出條帶并得到正確的焦磷酸測(cè)序結(jié)果，而其他參照菌株P(guān)CR均無條帶擴(kuò)出;以金黃色葡萄球菌clfa基因特異引物進(jìn)行PCR及焦磷酸測(cè)序，只有無乳鏈球菌(所有的203株)PCR成功擴(kuò)增出條帶并得到正確的焦磷酸測(cè)序結(jié)果，痢疾志賀氏菌以及副溶血弧菌PCR成功擴(kuò)增出條帶但焦磷酸測(cè)序失敗，而其他參照菌株P(guān)CR均無條帶擴(kuò)出。

因此可以得出結(jié)論:以無乳鏈球菌sip基因、停乳鏈球菌isp基因、沙門氏菌stn基因和金黃色葡萄球菌clfa基因的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并結(jié)合焦磷酸測(cè)序以快速檢測(cè)無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的方法是正確可行的。

3 討論

本研究建立了應(yīng)用PCR-焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)奶牛乳房炎主要致病菌無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)方法，是國(guó)內(nèi)外首次利用PCR-焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢驗(yàn)?zāi)膛Ｈ榉垦椎亩喾N致病菌。使用該檢驗(yàn)方法對(duì)大量目的菌株和參照菌株檢測(cè)驗(yàn)證后，結(jié)果顯示該方法與微生物學(xué)檢驗(yàn)方法和PCR檢驗(yàn)方法相比，檢驗(yàn)結(jié)果更加準(zhǔn)確、并且縮短了檢驗(yàn)時(shí)間［9］。

本研究在經(jīng)過嚴(yán)格篩選和序列比對(duì)、分析后選取了具有菌種特異性的無乳鏈球菌sip基因、停乳鏈球菌isp基因、沙門氏菌stn基因和金黃色葡萄球菌clfa基因的核苷酸保守區(qū)段，并以此利用焦磷酸測(cè)序儀自帶的引物設(shè)計(jì)軟件(PyroMarkTM ID System、Biotage、Sweden)設(shè)計(jì) PCR 擴(kuò)增引物及焦磷酸測(cè)序引物。

使用設(shè)計(jì)好的4對(duì)引物對(duì)各自目的菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中無乳鏈球菌108株、停乳鏈球菌100株、沙門氏菌136株、金黃色葡萄球菌203株，在優(yōu)化了PCR擴(kuò)增條件后均得到了滿意的擴(kuò)增結(jié)果，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測(cè)序，結(jié)果與原始序列完全一致。此結(jié)果說明上述選取的4種基因分別在各自的種內(nèi)具有較好的保守性。使用上述4對(duì)引物對(duì)參照菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增(具體菌株見表2)，結(jié)果顯示無乳鏈球菌sip基因、停乳鏈球菌isp基因、沙門氏菌stn基因的引物PCR擴(kuò)增結(jié)果全部陰性，僅有金黃色葡萄球菌clfa基因片段引物對(duì)痢疾志賀氏菌和副溶血弧菌擴(kuò)增出假陽(yáng)性條帶，對(duì)其PCR產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測(cè)序，結(jié)果顯示為測(cè)序失敗，沒有得到有意義的焦磷酸結(jié)果。此結(jié)果說明選取的4種基因在種間具有較好的特異性，僅存在于各自的菌種中。綜合對(duì)目的菌株和參照菌株的PCR擴(kuò)增和焦磷酸測(cè)序結(jié)果說明，以無乳鏈球菌sip基因、停乳鏈球菌isp基因、沙門氏菌stn基因和金黃色葡萄球菌clfa基因的特異性引物進(jìn)行PCR-焦磷酸測(cè)序以快速檢測(cè)無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的方法是正確可行的。由于該方法相對(duì)微生物學(xué)檢驗(yàn)方法節(jié)省時(shí)間且結(jié)果可靠，與普通PCR相比可以進(jìn)一步得到待測(cè)菌基因序列，結(jié)果準(zhǔn)確性更高，因此該方法的建立對(duì)奶牛乳房炎致病菌的檢測(cè)提供了一種新的更加快速而準(zhǔn)確的途徑［10］。

［1］李成君，陳德娜，楊睿.奶牛乳房炎病原的分離與鑒定［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2012，(19):105-107.

［2］Brodeur B R，Boyer M，Charlebois I，et al.Identifica-tion of group B streptococcal Sip protein，which elicits cross-protective immunity［J］.Infect Immun，2000，68(10):5610-5618 .

［3］Luna RA，F(xiàn)asciano LR，Jones C，et al.DNA pyrosequencingbased bacterial pathogen identification in a pediatric hospital setting［J］.ClinMicrobio，2007，49(9):2985-2992.

［4］Diggle MA，Clarke SC.Pyrosequencing.sequence typing at the speed of light［J］.Mol Biotechnol，2004，28(2):129-137.

［5］Xue GH，Yu LH，Li ST，et al.Intranasal immunization with GBS surface protein Sip and ScpB induces specific mucosal and systemic immune responses in mice［J］.FEMS Immunol Med Microbiol，2010，58(2):202-210.

［6］胡菊梅，溫嘉琪，鄭曉培，等.奶牛乳房炎病原分離鑒定及其治療方法研究［J］.畜牧獸醫(yī)雜志，2012，31(1):16-19.

［7］李玉，敖日格樂，王純潔，等.臨床型奶牛乳房炎致病菌的分離與鑒定［J］.畜牧與獸醫(yī)，2011，43(3):78-81.

［8］李秀娟，徐保紅，宋紅梅，等.沙門菌PCR-焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)［J］.中國(guó)公共衛(wèi)生，2009，25(8):997-998.

［9］孔雪旺，陳功義.奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)［J］.畜牧獸醫(yī)雜志，2006，(5):19-21.

［10］肖穎，谷維娜，錢明明，等.奶牛隱性乳房炎多重PCR檢測(cè)方法研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，(17):9029-9031.