張愛平，蔡少麗，楊 鶴，鄭海英，柯崇榕，黃建忠

(福建師范大學工業(yè)微生物教育部工程研究中心生命科學學院福建省現(xiàn)代發(fā)酵技術工程研究中心，福建 福州 350108)

果膠酶(pectinases)是一類含多種酶的復合酶，可用于植物纖維中果膠質(由D-半乳糖醛酸以α-1，4-糖苷鍵連接形成的直鏈狀的聚合物)的分解。已廣泛應用于傳統(tǒng)工業(yè)加工過程中，如果膠提取、酒類澄清、咖啡和茶的發(fā)酵、油的提取、污染果膠的污水處理等［1-2］。果膠酶可按照作用底物(果膠酸、果膠酯和原果膠等)、作用方式(裂解和水解)、作用位點(內切和外切)、作用適宜pH(酸性、中性和堿性)進行分類。堿性果膠酯裂解酶(EC 4.2.2.2.)是指可在堿性條件下水解聚乳糖醛酸α-1，4-糖苷鍵并釋放出可溶性不飽和寡聚乳糖醛酸的一類堿性果膠酶，一般多指聚半乳糖醛酸裂解酶(polygalacturonate lyase，PGL)［3］。堿性果膠酶除廣泛應用于食品(茶葉和咖啡發(fā)酵、榨油、誘導植物抗病的綠色食品生產)、環(huán)境保護(廢水處理)、植物病毒純化、飼料添加劑、洗滌劑以及紙漿漂白等方面，已成為綿織物處理過程中至關重要的生物制劑［4-5］。與傳統(tǒng)的處理棉織纖維的工藝相比，在工藝上和處理效果上都有許多優(yōu)勢。堿性果膠酶主要來源于細菌，早期主要進行野生菌種篩選及酶學特性方面的研究［6］，直至20世紀80年代后才漸漸有將其基因克隆進行異源表達的研究，但都主要集中在大腸埃希菌中表達，產量低，并且需要昂貴的IPTG作為誘導劑，并不太可能用于工業(yè)化生產［7-8］。于是近年來越來越多將其異源表達的研究轉向了技術成熟并利于工業(yè)化生產的畢赤酵母。本研究通過蛋白質工程手段構建了以GAP為啟動子的堿性果膠酶基因工程菌GS115-pGAPZαA-PGL，實現(xiàn)其在畢赤酵母GS115中無需甲醇誘導的表達，在理論上進一步完善了堿性果膠酯裂解酶在畢赤酵母中異源表達的研究，在實際應用中可為其進一步工業(yè)化生產和擴大應用范圍奠定基礎，具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質粒 畢赤酵母EIM-60、大腸埃希菌(E.coli)DH5α、巴斯德畢赤酵母菌株(P.pastoris)GS115、pGAPZαA質粒由本實驗室保存。pMD18T載體購自TaKaRa公司。

1.1.2 酶和試劑 Extaq酶、rTaq酶、限制性內切酶NotⅠ、KpnⅠ、AvrⅡ、T4DNA 連接酶均購自TaKaRa公司，膠回收試劑盒、Agar A、Zeocin均購自上海生工;PGA(polygalacturonic acid)購自Sigma公司;其余試劑均為進口或國產分析純，引物由上海生工合成。

1.1.3 培養(yǎng)基(%) LB培養(yǎng)基:蛋白胨1，氯化鈉1，酵母浸出物0.5;低鹽LB培養(yǎng)基:蛋白胨1，氯化鈉0.5，酵母浸出物0.5;YPD培養(yǎng)基:酵母提取物1，胰蛋白胨2，葡萄糖2。

1.2 方法

1.2.1 PGL基因的獲得 根據(jù)實驗室已有的堿性果膠酶的序列設計引物:P1:5'-TTGCT GAT TTA GGC CAT CAA ACG-3';P2:5'-CGGTTA ATT TAA TTT ACC AGC ACC CG-3'，在P1前添加NotⅠ酶切位點，在P2前添加酶切位點KpnⅠ。用玻璃珠法從實驗室菌株畢赤酵母EIM-60中獲得酵母基因組 DNA［9］，后經聚合酶鏈式反應(PCR)技術獲得目的基因PGL。

1.2.2 畢赤酵母重組表達載體的構建與轉化PCR產物經膠回收試劑盒回收后進行NotⅠ、KpnⅠ雙酶切，與經過相同雙酶切的pGAPZαA過夜連接，轉化大腸埃希菌(E.coli)DH5α，得到重組質粒pGAPZαA-PGL，經AvrⅡ酶切線性化后，電轉化至畢赤酵母GS115中，涂布在含有100 μg/mL的Zeocin+篩選標記的YPD平板上，28℃培養(yǎng)2～5 d至轉化子出現(xiàn)。

1.2.3 重組畢赤酵母工程菌株的篩選和鑒定重組畢赤酵母菌株的鑒定:采用煮-凍-煮法提取酵母基因組 DNA，以此為模板［10］，P1、P2 為引物，進行PCR擴增鑒定。

1.2.4 重組畢赤酵母工程菌株的表達 挑取驗證成功的陽性克隆子于5 mL的YPD液體培養(yǎng)基中，28℃，230 r/min進行一級培養(yǎng)至OD值2～6時取1 mL培養(yǎng)液，重懸于30 mL的YPD中，28℃，230 r/min 振蕩培養(yǎng) 6 d［11］，12000 r/min，5 min，收集上清，即為粗酶液。

1.2.5 重組畢赤酵母表達產物的分析 ①SDSPAGE:取粗酶液80 μL，采用5%濃縮膠及12%分離膠的不連續(xù)垂直平板電泳，考馬斯亮藍G-250染色，進行SDS-PAGE分析重組蛋白的表達情況;②酶活的測定:取粗酶稀釋液20 μL與2 mL的聚半乳糖醛酸混勻，45℃保溫15 min，加入3 mL磷酸溶液混勻終止其反應。反應完畢后，選用1 cm石英比色皿在紫外分光光度計上讀取235 nm時的吸光值。1個標準酶活單位(U)定義為每分鐘使聚半乳糖醛酸裂解產生1 μmol的不飽和聚半乳糖醛酸所需的酶量。酶活計算:

其中:EPGL為堿性果膠酸酯裂解酶酶活:μ/mL;A為235 nm處吸光度值;n為稀釋倍數(shù)。

2 結果與分析

2.1 畢赤酵母基因組的提取

根據(jù)玻璃珠法從實驗室菌株畢赤酵母EIM-60中獲得酵母基因組DNA。

2.2 PGL基因的克隆

經PCR擴增得到的PGL目的片段經測序后為1206 bp，編碼402個氨基酸，相對分子質量約43 ku，等電點為8.4。將PGL序列在NCBI上進行 Blast分析，與枯草芽胞桿菌 B.sutbtilis X74800.1的同源性為100%。

2.3 pGAPZαA-PGL表達載體的構建

純化回收的PGL基因經NotⅠ、KpnⅠ雙酶切后，與經過相同雙酶切的pGAPZαA過夜連接，轉化至大腸埃希菌(E.coli)DH5α，經篩選驗證后得到重組質粒pGAPZαA-PGL，雙酶切和測序結果表明，插入片段在pGAPZαA中有正確的閱讀框。

圖3 pGAPZαA-PGL的PCR鑒定Fig.3 PCR identification of pGAPZαA-PGL M:200 bp DNA marker;1、2:PGL gene

圖4 pGAPZαA-PGL雙酶切驗證Fig.4 Digestion identification of pGAPZαA-PGL M:200 bp DNA marker;1、2:pGAPZαA and PGL gene

2.4 GS115-pGAPZαA-PGL 的篩選和鑒定

pGAPZαA-PGL經AvrⅡ酶切線性化后，電轉化至酵母GS115中，挑取Zeocin+抗性板上的單菌落于3 mL YPD液體培養(yǎng)基中，30℃，230 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，分別進行菌液PCR鑒定及提取重組菌株的基因組DNA進行PCR鑒定，結果表明，目的基因PGL已成功整合到畢赤酵母GS115中。

2.5 GS115-pGAPZαA-PGL表達產物的分析

銀染結果表明，重組PGL實現(xiàn)了在畢赤酵母中的分泌表達，gel pro Analyser軟件分析其表達蛋白的表觀分子量約為44.3 ku(圖7)，通過考馬斯亮藍法蛋白濃度試劑盒測定其蛋白含量為0.430 g/L，通過BandScan軟件分析，目的蛋白占總蛋白的41.4%，即0.178 g/L;酶活測定為1750 U/L。

3 討論

畢赤酵母(Pichia pastoris)是近年來發(fā)展迅速的真核表達系統(tǒng)，具有許多真核表達系統(tǒng)的優(yōu)點［12］。已有眾多文獻報道果膠酶在畢赤酵母中的甲醇誘導表達，但是該表達均以AOX1為啟動子，表達需要以甲醇為誘導物［13-15］。雖然甲醇可嚴格調控和誘導AOX1基因的表達，但甲醇為有毒、易燃物質，操作麻煩，不利于工業(yè)上尤其是食品及其相關領域的生產，因此為進一步完善堿性果膠酯裂解酶基因(PGL)在畢赤酵母中的表達，擴大其應用范圍，本研究采用甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因為啟動子進行PGL的表達。GAP啟動子具有很強的組成型表達能力，以葡萄糖、甘油等無毒物質作為碳源，表達時無需更換碳源，發(fā)酵工藝更為簡單，更適合大規(guī)模的工業(yè)化培養(yǎng)［16］。

本研究將堿性果膠酯裂解酶PGL基因克隆到pGAPZαA中，通過蛋白質工程手段成功實現(xiàn)該重組質粒在畢赤酵母中的非甲醇誘導表達。表達蛋白分子量為44.3 ku，發(fā)酵活力為1750 U/L，并不是很高，原因可能在于發(fā)酵條件未優(yōu)化;畢赤酵母對其所表達的蛋白進行過度修飾;密碼子偏好性，從而限制其蛋白質的翻譯速度;或者整合的拷貝數(shù)過多，導致轉錄水平產生后生調節(jié)，影響重組蛋白的產率等［17-18］。

本研究成功地使堿性果膠酯裂解酶在畢赤酵母中獲得了非甲醇誘導的表達，有一定的活性。酶活和表達量仍有很大的提升空間，今后可通過對其發(fā)酵條件優(yōu)化尋找合適的表達條件，并對重組酶產酶動力學和酶學性質做詳細研究;再通過上罐擴大培養(yǎng)，進一步改造目的基因，密碼子優(yōu)化，定點突變，增加整合拷貝數(shù)等手段使其產量得到進一步提升，以更好地應用于工業(yè)上的生產。

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