李興銳，王文睿，張永奎，張 鵬，謝通慧，梁 斌

(四川大學(xué)化工學(xué)院制藥與生物工程系，四川成都 610065)

氮濃度對異養(yǎng)小球藻生長及蛋白質(zhì)含量的影響

李興銳，王文睿，張永奎*，張 鵬，謝通慧，梁 斌

(四川大學(xué)化工學(xué)院制藥與生物工程系，四川成都 610065)

為了提高異養(yǎng)小球藻蛋白質(zhì)含量低的問題，研究了異養(yǎng)小球藻生長及蛋白質(zhì)含量和氮濃度的關(guān)系，探究了分階段調(diào)控氮濃度對異養(yǎng)小球藻生長及蛋白質(zhì)含量的影響。結(jié)果表明，氮濃度在3～15mmol/L范圍內(nèi)，小球藻生物量及蛋白質(zhì)含量隨氮濃度增加而增加，生物量從0.91g/L提高到了3.02g/L，蛋白質(zhì)含量從26.1%提高到了37.4%。分階段培養(yǎng)小球藻，首先在低氮條件下培養(yǎng)至指數(shù)期前期，然后轉(zhuǎn)移至高氮濃度下培養(yǎng)，生物量達(dá)3.04g/L，且蛋白質(zhì)含量提高至53.8%，與自養(yǎng)培養(yǎng)條件下蛋白質(zhì)含量相當(dāng)。

小球藻，氮濃度，生長，蛋白質(zhì)，分階段調(diào)控

小球藻是一種單細(xì)胞綠藻，蛋白質(zhì)含量高，色素、維生素和礦物質(zhì)含量豐富，具有增強(qiáng)免疫、降血脂和抗病原微生物等保健和藥理作用，是優(yōu)良的飼料資源［1］。在發(fā)展“綠色飼料”的時代，合理利用小球藻提高飼料質(zhì)量和動物產(chǎn)品質(zhì)量，具有較大的意義。近幾年，微藻異養(yǎng)培養(yǎng)是微藻生物技術(shù)的研究熱點(diǎn)，通過異養(yǎng)培養(yǎng)細(xì)胞密度大幅度提高，不受光限制，且已實(shí)現(xiàn)生物反應(yīng)器高密度培養(yǎng)［2－3］。然而異養(yǎng)培養(yǎng)雖然細(xì)胞密度大幅度提高，但和自養(yǎng)相比，異養(yǎng)培養(yǎng)的小球藻蛋白質(zhì)含量降低不少。一般自養(yǎng)培養(yǎng)的小球藻蛋白質(zhì)含量在50%左右［4］，異養(yǎng)培養(yǎng)蛋白質(zhì)含量僅有約30%。本文根據(jù)藻類對營養(yǎng)物質(zhì)存在奢侈性吸收現(xiàn)象［5］，采用分階段調(diào)控氮濃度的方法提高異養(yǎng)小球藻蛋白質(zhì)含量。首先，在低氮條件下培養(yǎng)小球藻至指數(shù)生長期，然后在高氮含量條件下誘導(dǎo)藻細(xì)胞對氮元素的吸收，提高異養(yǎng)蛋白質(zhì)含量。這種培養(yǎng)方式既可獲得較高的小球藻生物量，又可使蛋白質(zhì)含量大幅提高，在此研究領(lǐng)域尚未發(fā)現(xiàn)有研究報道。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小球藻(Chlorella vulgaris) 為前期從云南滇池水樣中篩選所得［6］，簡寫為C.vulgaris;SE培養(yǎng)基 培養(yǎng)成分為:NaNO3250mg，K2HPO4·3H2O 75mg，MgSO4·7H2O 75mg，CaCl2·2H2O 25mg，KH2PO4175mg，NaCl 25mg，土壤提取液40mL，F(xiàn)eCl3·6H2O 5mg，F(xiàn)e－EDTA 1mL，A5液1mL，蒸餾水958mL。

LS－B35L－I立式壓力蒸汽滅菌器 江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司;SW－CJ－1BU潔凈工作臺 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;HZQ－C空氣浴振蕩器 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司;UV－1800紫外/可見分光光度計 上海美譜達(dá)儀器有限公司;KXU202－2A恒溫干燥器 上?？莆鰧?shí)驗(yàn)儀器廠;AR2140分析天平 奧豪斯國際貿(mào)易有限公司; TDL－5－A臺式中速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法

依實(shí)驗(yàn)設(shè)計，在含有10g/L葡萄糖的無氮SE培養(yǎng)基中加入適量氮源，在120℃下滅菌20min。在超凈臺上以10%(V/V)接種量將種子液接種于新鮮培養(yǎng)液中。置于轉(zhuǎn)速為150r/min，溫度為25℃的搖瓶中暗培養(yǎng)9d。

根據(jù)藻類對營養(yǎng)物質(zhì)存在奢侈性吸收原理，采用不同的培養(yǎng)階段來提高小球藻蛋白質(zhì)含量。首先讓小球藻在低氮條件下生長至指數(shù)期，然后收集藻細(xì)胞并轉(zhuǎn)入氮充足的培養(yǎng)基中再培養(yǎng)。

1.2.2 生物量的測定 分光光度法。用分光光度計在波長680nm下測定光密度(OD680)以示小球藻的生長量。

細(xì)胞干重法:取一定體積培養(yǎng)后的藻液，10000r/min離心5min，用蒸餾水洗滌三次，置于恒溫干燥箱中60℃烘至恒重。以g干藻體/L藻液表示生物量。

1.2.3 蛋白質(zhì)的測定 將干燥至恒重的藻體研磨成粉，采用凱氏定氮法測定小球藻細(xì)胞中的蛋白質(zhì)含量［7］。

蛋白質(zhì)產(chǎn)量=蛋白質(zhì)含量×生物量

2 結(jié)果與討論

2.1 不同氮濃度對小球藻生長及蛋白質(zhì)含量的影響

含有10g/L葡萄糖的無氮SE培養(yǎng)基中加入硝酸鈉，使氮元素濃度分別為3、9、12、15、18、24mmol/L。如圖1所示，3～15mmol/L范圍內(nèi)，小球藻的生物量隨著培養(yǎng)液中氮濃度的增加有明顯的提高，從0.91g/L提高到了3.02g/L;而高氮濃度24mmol/L則略顯抑制小球藻的生長。說明氮濃度對小球藻生長有影響。圖2是在氮濃度為15mmol/L條件下小球藻在不同時期蛋白質(zhì)的含量變化圖。進(jìn)入指數(shù)期后小球藻的蛋白質(zhì)含量逐漸增加，指數(shù)期末期(培養(yǎng)第7d)小球藻蛋白質(zhì)含量達(dá)到最大。進(jìn)入穩(wěn)定期后(培養(yǎng)第9d)小球藻蛋白質(zhì)含量降低到30.3%。說明小球藻在指數(shù)期大量積累蛋白質(zhì)。如圖3所示，增加氮濃度，小球藻蛋白質(zhì)含量有明顯增加。氮濃度大于15mmol/L時，蛋白質(zhì)含量略顯下降。15mmol/L時蛋白質(zhì)含量能達(dá)到37.4%，產(chǎn)量達(dá)到1.09g/L。說明氮濃度對小球藻蛋白質(zhì)積累亦有影響。圖1～圖3表明，蛋白質(zhì)的積累和細(xì)胞生長有關(guān)，氮濃度對小球藻生長及蛋白質(zhì)含量的影響作用基本一致。有學(xué)者研究表明小球藻的相對生長速度取決于細(xì)胞的蛋白質(zhì)含量［8］。雖然15mmol/L較3mmol/L時蛋白質(zhì)含量提高了30.2%，但是仍然明顯低于自養(yǎng)小球藻的蛋白質(zhì)水平。

2.2 分階段調(diào)控氮濃度對小球藻蛋白質(zhì)含量的影響

圖1 不同氮濃度下小球藻的生長曲線Fig.1 Growth curves of Chlorella vulgaris under different nitrogen concentrations

圖2 15mmol/L氮濃度下小球藻在不同生長時期的蛋白質(zhì)含量Fig.2 Protein content of Chlorella vulgaris in different growth phase under nitrogen concentrations of 15mmol/L

圖3 不同氮元素濃度對小球藻蛋白質(zhì)含量的影響Fig.3 Effect of different nitrogen concentrations on protein content of Chlorella vulgaris

由于氮濃度對小球藻生長及蛋白質(zhì)含量的影響作用基本一致，同時小球藻存在對營養(yǎng)物質(zhì)的奢侈性吸收，因此可以使小球藻在低氮濃度3mmol/L下生長至指數(shù)期前期即在培養(yǎng)過程的第3d，然后在無菌操作條件下離心、收集藻細(xì)胞。將新鮮的藻細(xì)胞打散后立即轉(zhuǎn)移至高氮濃度的培養(yǎng)基中，各培養(yǎng)基中的氮元素濃度分別為9、12、15、18mmol/L。待小球藻生長至指數(shù)期末期時，收集藻體，測定其蛋白質(zhì)含量。分階段調(diào)控氮濃度對小球藻蛋白質(zhì)含量影響如表1所示，分階段調(diào)控后各濃度下獲得的小球藻蛋白質(zhì)含量分別為44.2%、47.1%、50.0%、53.8%。此法既可獲得較高的生物量(最高生物量為3.04g/L)，又可顯著提高小球藻蛋白質(zhì)含量，且已達(dá)到自養(yǎng)小球藻的蛋白質(zhì)水平。將其轉(zhuǎn)入15mmol/L時，提高率為33.7%(對照組的蛋白質(zhì)含量為37.4%)，18mmol/L時的提高作用更為顯著，提高率為44.6%，此時的蛋白質(zhì)產(chǎn)量也最高1.62g/L。

目前，在解決異養(yǎng)小球藻蛋白質(zhì)含量低的問題上，很多學(xué)者致力于植物生長調(diào)節(jié)劑對小球藻的生長及蛋白質(zhì)含量的影響。劉世名等研究發(fā)現(xiàn)植物生長調(diào)節(jié)劑PP333處理后的小球藻蛋白質(zhì)含量明顯提高［9］。焉翠蔚等研究表明多效唑處理后的海洋微藻葉綠素a和蛋白質(zhì)含量均有所提高［10］。雖然植物生長調(diào)節(jié)劑可以提高蛋白質(zhì)含量，但是具有低毒高效的作用，對小球藻的生長具有抑制作用［11］，而分階段調(diào)控氮濃度即不會抑制小球藻的生長，且可明顯提高蛋白質(zhì)含量。

表1 分階段調(diào)控氮濃度對小球藻生長及蛋白質(zhì)含量的影響Table 1 Effects of regulating nitrogen concentrations at two stages on the growth and protein content Chlorella vulgaris

3 結(jié)論

異養(yǎng)培養(yǎng)的小球藻在指數(shù)期末期蛋白質(zhì)含量最高，到達(dá)穩(wěn)定期后蛋白質(zhì)含量會降低。氮濃度對小球藻生長及蛋白質(zhì)含量的影響作用基本一致，一定范圍內(nèi)小球藻生物量及蛋白質(zhì)含量隨氮濃度的增加而增加。分階段調(diào)控氮濃度即可獲得高生物量，又可將小球藻蛋白質(zhì)含量由37.4%提高至53.8%，達(dá)到自養(yǎng)小球藻蛋白質(zhì)含量水平，能有效解決異養(yǎng)蛋白質(zhì)含量低的問題。

［1］王新德，張海英，王明偉.藻類—一種優(yōu)良的飼料資源［J］.養(yǎng)殖技術(shù)顧問，2009(2):48.

［2］Chen Feng.High cell density culture of microalgae in heterotrophic growth［J］.Trends in Biotechnology，1996，14(6): 421－426.

［3］Ip PF，Chen Feng.Production of astaxanthin by the green microagaChlorellazofingienis in the dark［J］.Process Biochemistry，2005，40(2):733－738.

［4］楊帥，許倩倩，王子敬，等.多效唑?qū)Ξ愷B(yǎng)小球藻USTB－01生長和蛋白質(zhì)含量的效應(yīng)［J］.現(xiàn)代化工，2009，29:160－162.

［5］Suttle CA，Harrison PJ.Rapid ammonium up take by freshwater phytoplankton［J］.Journal of Phycology，1988，24(1): 13－16.

［6］王立柱，溫皓程，鄒渝，等.產(chǎn)油微藻的分離、篩選及自養(yǎng)培養(yǎng)氮源、碳源的優(yōu)化［J］.微生物學(xué)通報，2010，37(3): 336－341.

［7］GB5009.5－2010食品中蛋白質(zhì)的測定［S］.中華人民共和衛(wèi)生部，2010.

［8］Fogg GE.藻類的新陳代謝［M］.北京:科學(xué)出版社，1962: 90－96.

［9］劉世名，陳靠山，梁世中，等.PP33用于藻類培養(yǎng)影響異養(yǎng)小球藻的生長及蛋白質(zhì)含量［J］.生物技術(shù)，2003，13(1): 23－25.

［10］焉翠蔚，肖宜華，朱巖松，等.多效唑?qū)煞N海洋微藻生長和抗氧化酶活性的影響［J］.中國海洋大學(xué)學(xué)報，2008，3 (2):291－296.

［11］呂富，林偉峰，石祥根，等.NAA對小球藻生長及葉綠素和蛋白質(zhì)含量的影響［J］.鹽城工學(xué)院學(xué)報，2006，12(2): 42－45.

Effect of nitrogen concentrations on growth and protein content of heterotrophic microalgae

LI Xing－rui，WANG Wen－rui，ZHANG Yong－kui*，ZHANG Peng，XIE Tong－h(huán)ui，LIANG Bin
(Department of Pharmaceutical and Biological Engineering，Sichuan University，Chengdu 610065，China)

In order to improve the problem of low protein content of heterotrophic Chlorella vulgaris，the effects of nitrogen concentrations on growth and protein content of Chlorella vulgaris were studied.The regulations of nitrogen concentrations in different phases on the growth and protein content of Chlorella vulgaris were also studied.The results showed that protein content of Chlorella vulgaris was increased from 26.1%to 37.4%with the increase of initial nitrogen concentration from 12 to 15mmol/L.The control strategy was that firstly let Chlorella vulgaris grow under low nitrogen concentration to its exponential phase，and then transfered it to high nitrogen concentration.So we could obtaine both high biomass 3.04g/L and high protein content of 53.8%，which reaches the protein level of Chlorella vulgaris in autotrophic culture.

microalgae;nitrogen concentrations;growth;protein;regulations in phases

TS254.1

A

1002－0306(2012)08－0222－03

2011－04－13 *通訊聯(lián)系人

李興銳(1987－)，女，碩士研究生，研究方向:食品微生物。

閔恩澤最高科學(xué)技術(shù)獎研究基金。