普洱茶渥堆樣品及生茶和熟茶中鍵合態(tài)糖苷變化研究

谷勛剛，姚成程，趙雪豐，寧井銘，張正竹

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部茶葉生物化學(xué)與生物技術(shù)重點實驗室，安徽合肥 230036）

普洱茶渥堆樣品及生茶和熟茶中鍵合態(tài)糖苷變化研究

谷勛剛，姚成程，趙雪豐，寧井銘，張正竹

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部茶葉生物化學(xué)與生物技術(shù)重點實驗室，安徽合肥 230036）

采用GC-ECD內(nèi)標定量法分析了普洱茶渥堆過程中鍵合態(tài)糖苷的變化以及不同儲藏年份的生茶和熟茶中含量分布。分析結(jié)果表明，渥堆過程促進糖苷的分解，隨著時間的延長，以此為基礎(chǔ)的香氣釋放潛力逐漸降低，酶解和濕熱作用是潛在的驅(qū)動力。生茶中糖苷的含量比熟茶高一個數(shù)量級以上，以糖苷為基礎(chǔ)的生茶釋放香氣的潛力遠大于熟茶。

鍵合態(tài)糖苷，GC-ECD，普洱茶，渥堆，衍生化

鍵合態(tài)糖苷類物質(zhì)是茶樹葉片中重要的次生代謝產(chǎn)物，由揮發(fā)性的苷元和水溶性的糖配基通過氧鍵結(jié)合而成[1-2]。通過相關(guān)酶的酶解，苷元能夠很容易地釋放出來，提供相應(yīng)的香氣[3-4]。茶樹在正常生長的過程中，糖苷及對應(yīng)的酶在不同的細胞器中，無法進行酶解反應(yīng)，但當(dāng)葉片受到病蟲害侵染時糖苷與酶有接觸的機會，分解釋放出相應(yīng)的苷元[5]。這些揮發(fā)性的成分具有抑制或驅(qū)散病害蟲的作用，因此研究者認為糖苷具有抵抗疾病的能力[6-7]。對茶葉加工而言，苷元一般是優(yōu)質(zhì)的香氣成分，如苯甲醇、氧化芳樟醇、芳樟醇、苯乙醇、己烯醇等表現(xiàn)出花香氣味，是茶葉香氣的內(nèi)質(zhì)體現(xiàn)[8]。因此人們認為糖苷是茶葉重要的“香氣前體物”。普洱茶以云南大葉種為原料經(jīng)過渥堆、后發(fā)酵、壓制成型等工藝制成，其中渥堆是普洱茶品質(zhì)形成的關(guān)鍵步驟[9]。大葉種茶中內(nèi)容物質(zhì)豐富，其中“香氣前體物”蘊藏量相對更大，在渥堆的過程中糖苷和相應(yīng)的酶有機會接觸，促進苷元的釋放，提供相應(yīng)的茶香。此外渥堆過程中霉菌參與及濕熱條件也可能導(dǎo)致糖苷的水解[10]，釋放出相應(yīng)的苷元。外界環(huán)境條件的改變影響了糖苷在普洱茶樣品中的含量與分配，調(diào)查普洱茶渥堆過程中糖苷的變化對渥堆程度的確定及香氣成分的釋放具有重要意義。本文在前期的工作基礎(chǔ)上[11]，采用N-甲基-雙三氟乙酰胺衍生技術(shù)結(jié)合GC-ECD定量方法，考察了普洱茶渥堆過程中糖苷的變化規(guī)律，同時對比分析了不同年份普洱生茶和熟茶中糖苷的含量，以期為普洱茶渥堆過程中條件的優(yōu)化及后發(fā)酵的最佳時間確定提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

普洱茶渥堆樣品 取自云南勐海茶廠生產(chǎn)車間，在普洱茶堆的相同部位采集8批樣品，每次取樣間隔時間一周。入堆溫度45℃，至起堆依次變化至55℃；含水率由45%逐漸變化至35%。采集的樣品快速晾干，經(jīng)40℃烘箱內(nèi)平衡6h、研磨、過30～60目篩；實驗所用05、06及07年的普洱生茶和熟茶 取自勐海茶廠倉庫，其拼配所選原料相同；N-甲基-雙-三氟乙酰胺（MBTFA）；苯氧醇-β-D-葡萄糖苷 St. Louis，MO，USA；順-3-己烯醇-β-D-葡萄糖苷、苯甲醇-β-D-葡萄糖苷、氧化芳樟醇葡萄糖苷、苯乙醇-β-D-葡萄糖苷、香葉醇-β-D-葡萄糖苷、苯甲醇櫻草糖苷 中山大學(xué)藥物學(xué)院；無水吡啶 Deerfield，IL，USA。

HP6890氣相色譜儀，配分流/不分流進樣口、石英毛細管柱（DB-5，Supelco，Bellefonte，PA，USA；30m×0.25mm×0.25μm）、電子捕獲檢測器。

1.2 鍵合態(tài)糖苷標準物的衍生反應(yīng)

取400μL的單標或混合標樣，加入到0.5m L的衍生瓶內(nèi)，氮氣保護下加入30μL的MBTFA，密封搖勻后，在60℃的溫度范圍下衍生40m in，冷卻至室溫后取2μL進樣分析。

1.3 樣品制備

取1.0000g粉碎的普洱茶樣品，加入內(nèi)標物質(zhì)苯氧-β-D-葡萄糖苷并混合均勻，液氮保護下用10m L的甲醇超聲提取10min，離心過濾后，殘渣繼續(xù)重復(fù)超聲提取兩次，合并三次甲醇提取溶液，減壓低溫濃縮至干，然后用5m L的水溶解，用XAD-2大孔樹脂凈化柱（5g，500×1cm ID）去除多酚類、糖類等物質(zhì)。XAD-2大孔樹脂凈化柱預(yù)先依次用20m L水、20m L甲醇、10m L水平衡后，將提取液加到凈化柱上。先用5m L的水淋洗凈化柱，棄去流出液，再用30m L甲醇洗脫，收集甲醇流出液，濃縮至近干后再低溫減壓濃縮，去除可能存在的水分。得到的無水糖苷在氮氣保護下用400μL無水吡啶溶解，再加入30μL的MBTFA，密封搖勻后，在60℃的溫度范圍下衍生40m in，冷卻至室溫后取2μL進樣分析。

1.4 GC-ECD條件

載氣為高純氮氣，恒壓分離模式，柱頭壓12.26kPa；分流/不分流進樣口溫度280℃；分流進樣，分流比5∶1，進樣量2μL；ECD檢測器溫度300℃；升溫程序：初始溫度150℃，保持2m in；以4℃/m in升至210℃并保持2m in；然后以5℃/m in升至280℃，保持7m in。

2 結(jié)果與討論

2.1 鍵合態(tài)糖苷分析方法的確定

鍵合態(tài)糖苷是茶葉中重要的“香氣前體物”，在茶葉中含量較低[12]、具有較好的水溶性，適合用HPLC法測定。但HPLC法靈敏度不高，并且有些糖苷紫外吸收的摩爾消光系數(shù)很小，很難準確定量。一般而言，GC法靈敏度比HPLC法高，分離效果好，對鍵合態(tài)糖苷的測定，需要經(jīng)過衍生化過程以增加糖苷的揮發(fā)性，然后才能測定，因此采用GC法測定糖苷，衍生化過程是必要的。由于普洱茶鍵合態(tài)糖苷的絕對含量低、種類復(fù)雜，即使是經(jīng)過衍生化后用GC-FID直接測定，有些痕量成分在色譜圖上仍然不能辨認。解決這種不足的方法至少包括以下兩種：a.在樣品制備時采用大量待測樣進行提取實驗，提取液經(jīng)凈化、濃縮等手段處理后再衍生、GC-FID測定；b.采用更靈敏的GC檢測器進行測定。若采用前者，用大量樣品進行提取實驗，在凈化階段去除含量高的茶多酚很繁瑣，有時會導(dǎo)致目標成分的損失。為此我們選擇了后者，采用了更靈敏的檢查方法，用N-甲基雙三氟乙酰胺（MBTFA）試劑對糖苷進行衍生，在糖苷衍生產(chǎn)物的分子中引入了電負性大的氟元素，能夠用靈敏度更高的GC-ECD法測定，大大地增加了分析的靈敏度。

2.2 鍵合態(tài)糖苷標準物的分離分析

幾種標準樣品，包括順-3-己烯醇-β-D-葡萄糖苷、苯氧醇-β-D-葡萄糖苷、苯甲醇-β-D-葡萄糖苷、苯乙醇-β-D-葡萄糖苷、氧化芳樟醇葡萄糖苷、香葉醇-β-D-葡萄糖苷、苯甲醇櫻草糖苷，經(jīng)MBTFA衍生后，用GC-ECD分離與鑒定，得到的色譜圖見圖1。由圖1可見，目標成分能夠有效分離和準確鑒定。由于我們前期的實驗結(jié)果已證實普洱茶中不含苯氧基葡萄糖苷，可以以該化合物為內(nèi)標，計算其他鍵合態(tài)糖苷相關(guān)因子，用內(nèi)標法對茶葉中的鍵合態(tài)糖苷進行定量分析，與外標法比較，增加了分析的準確度[13]。

圖1 標準糖苷色譜圖Fig.1 Chromatogram of standard glycoside

因為糖苷標準物質(zhì)很難購置，多數(shù)需要根據(jù)需要在實驗室內(nèi)合成，所以在我們的研究中，僅能定量分析普洱茶中有限的幾種糖苷。深入研究糖苷的變化及其對普洱茶品質(zhì)的影響，還需要根據(jù)鑒定的結(jié)果，合成或分離出相應(yīng)的糖苷，進而開展定向的研究。普洱茶中潛在未知糖苷，本實驗定量分析中相關(guān)因子取1進行處理。

2.3 渥堆樣品中糖苷的變化研究

勐海茶廠取回的渥堆樣品，經(jīng)提取、凈化、衍生后，用GC-ECD對糖苷進行了分離與鑒定，色譜圖如圖2所示。由圖2可見，單糖苷如順-3-己烯醇-β-D-葡萄糖苷、苯氧醇-β-D-葡萄糖苷、苯甲醇-β-D-葡萄糖苷、苯乙醇-β-D-葡萄糖苷、香葉醇-β-D-葡萄糖苷等，色譜峰保留時間在20～40min之間。ND1和ND2兩個未知峰也在此范圍內(nèi)，根據(jù)色譜分離的基本原理以及普洱茶樣品成分組成，推測ND1和ND2可能是單糖苷或單糖，具體是何種成分需要進一步證實。苯甲醇櫻草糖苷為二糖苷，其保留時間在50～70min之間，因此認為ND3～ND9是潛在的二糖苷，集中出現(xiàn)在色譜圖中的50～70min保留時間范圍內(nèi)，本研究將它們列在了二糖苷的范圍內(nèi)。ND6是一種含量占優(yōu)勢的二糖苷，研究茶葉中糖苷的含量和性質(zhì)，此糖苷不可忽視。

圖2 第一次翻堆樣品色譜圖Fig.2 Chromatogram of the first pile-turned sample

表1為不同翻堆樣品中糖苷含量，隨著渥堆時間的延長，ND3～ND5色譜峰趨向于不可分辨，原因是此三種物質(zhì)在渥堆過程中逐漸分解而導(dǎo)致含量降低，因此表中未將此三個潛在的未知糖苷列在表內(nèi)。已知糖苷中，毛茶的含量較高，入堆后隨著時間的延長，單糖苷的含量基本上依次降低，表明糖苷隨翻堆次數(shù)增加趨于分解，產(chǎn)生的游離態(tài)香氣構(gòu)成了普洱茶品質(zhì)的物質(zhì)基礎(chǔ)，糖苷分解的量越多，釋放進入到茶葉基質(zhì)中的香氣成分量也越多。表1的結(jié)果證明以糖苷為物質(zhì)基礎(chǔ)的“香氣前體物”釋放香氣的潛力會逐漸降低，渥堆過程中酶解、濕熱水解是可能的驅(qū)動力[9]。未知糖苷中，如ND6～ND9，它們的含量也很高，在渥堆過程中表現(xiàn)為同樣的降低趨勢。根據(jù)色譜性質(zhì)分析，因為保留時間靠后，結(jié)合我們酶解的實驗結(jié)果，芳樟醇糖苷、香葉醇糖苷在普洱茶中含量很高（數(shù)據(jù)未在本文中列出），它們極有可能是芳樟醇或香葉醇的二糖苷或者不同二糖苷的異構(gòu)體。由表1可見，糖苷的變化從入堆開始至起堆止，其總量總體上趨于下降，所以以糖苷為物質(zhì)基礎(chǔ)的香氣前體物釋放香氣的潛力隨渥堆時間的延長會逐漸降低。

2.4 普洱生茶和熟茶中鍵合態(tài)糖苷的研究

表2為普洱生茶和熟茶中糖苷的含量。雖然配制方法相同，但不同年份采集茶葉的內(nèi)質(zhì)還是有一定的區(qū)別。表2顯示生茶糖苷含量高于熟茶至少一個數(shù)量級，顯然不完全是茶葉基質(zhì)不同導(dǎo)致的，渥堆過程是糖苷分解主要動力。渥堆時由于糖苷鍵斷裂，產(chǎn)生了揮發(fā)性的苷元和相應(yīng)的水溶性物質(zhì)，水溶性差的苷元擴散至基質(zhì)中，其中一些可能被高含量的脂肪酸、植醇等保持[14]，依然保持苷元的香氣屬性；揮發(fā)度更高的成分可能直接擴散出去，對普洱茶香味的沒有貢獻。事實上本文探討的這些苷元具有花果香的屬性[15]，而一般普洱茶的香味表現(xiàn)為陳香[8]，顯然陳香物質(zhì)的含量較高，掩蓋了花果香的香型。生茶糖苷含量較高，在貯藏過程受微生物等的作用緩慢地進行固態(tài)發(fā)酵[9]，其中的糖苷也緩慢的分解，釋放相應(yīng)的苷元。表2中顯示06年的普洱生茶中“總糖苷”的含量為2480μg·g-1，遠高于05年的含量，可能與后發(fā)酵過程有關(guān)；而07年普洱生茶“總糖苷”的含量反而更低，我們認為主要是基質(zhì)不同導(dǎo)致的。以此看來，生茶中糖苷含量高、固態(tài)發(fā)酵分解緩慢，以糖苷為基礎(chǔ)的香氣釋放的速率也很慢。

表1 普洱茶渥堆過程中糖苷的變化（μg·g-1）*Table 1 The change of contentof glycosides during pile-fermentation process of Pu-erh teas（μg·g-1）*

表2 普洱熟茶和生茶中糖苷含量（μg·g-1）*Table 2 The contentof glycoside in Pu-erh ripe and raw tea sample（μg·g-1）*

3 結(jié)論

采用內(nèi)標法定量分析了普洱茶渥堆過程中糖苷含量的變化，開辟了糖苷研究新方法。渥堆時糖苷釋放香氣的潛力隨時間延長而逐漸降低，酶解和濕熱作用導(dǎo)致了糖苷的分解并釋放相應(yīng)的苷元，為普洱茶提供香味。同時對比研究了普洱生茶和熟茶中糖苷的含量，總體而言，生茶中糖苷的含量比熟茶中至少高一個數(shù)量級，表明渥堆是促使糖苷分解的主要過程，生茶為未發(fā)酵的普洱茶，以糖苷為物質(zhì)基礎(chǔ)的釋放潛力遠大于熟茶。

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Study on the change of glycosides in pile-fermentation sam p les and raw，ripe of Pu-erh tea

GU Xun-gang，YAO Cheng-cheng，ZHAO Xue-feng，NING Jing-m ing，ZHANG Zheng-zhu
（Key Lab of Tea Biochemistry&Biotechnology，Ministry of Agriculture，AnhuiAgricultural University，Hefei230036，China）

GC-ECD method was emp loyed to quantitatively analyze the change of g lycosides in Pu-erh tea samp les during p ile-fermentative p rocedure，and of the distribution in Pu-erh raw and ripe teas which were stored for different years.The result showed that pile-fermentative p rocess could accelerate deg radation rate of the g lycosides，based on which the aroma-released potentials would be deg reased w ith the p rolonging of the p ile-fermentation time，and enzyme-hyd rolyzed and wet heat actions p rovided a potential d riving force for deg radation of the g lycosides.The content of the g lycosides in Pu-erh raw teas were ten-times higher than that in ripe teas，that intricate the aroma-released potentials in Pu-erh raw teas were much stronger than those in ripe teas.

g lycosides；GC-ECD；Pu-erh tea；p ile-fermentation；derivation

TS272

A

1002-0306（2012）22-0137-04

2012－05－18

谷勛剛，男，博士后，副教授，主要從事茶葉加工及生物化學(xué)研究。

全國茶葉產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目；國家支撐項目（2007BAD58B04）。