糖基化反應(yīng)對蛋清蛋白質(zhì)凝膠性的影響

孫 強(qiáng)，遲玉杰*，胥 偉

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

糖基化反應(yīng)對蛋清蛋白質(zhì)凝膠性的影響

孫 強(qiáng)，遲玉杰*，胥 偉

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

為研究糖基化反應(yīng)提高蛋清蛋白質(zhì)凝膠性的機(jī)理，利用氨基酸分析儀、苯酚硫酸法、奧氏黏度計(jì)、靜態(tài)激光散射儀對糖基化蛋清蛋白質(zhì)氨基酸組成、總糖含量、特性黏度、粒徑分布進(jìn)行測定與分析。結(jié)果顯示：糖基化反應(yīng)可使蛋清蛋白質(zhì)的凝膠強(qiáng)度和持水性分別提高91.7%和35.2%，且二者均在反應(yīng)4d后達(dá)到最高值；糖基化處理5d后，蛋清蛋白質(zhì)的賴氨酸含量相對降低28.42%，總糖含量增至2.18%；特性黏度隨反應(yīng)時間的延長增幅較??；糖基化蛋白粒徑分布在0.1～50.0μm之間，糖基化2d內(nèi)，粒徑分布由小粒徑峰向大粒徑峰轉(zhuǎn)變；糖基化2d后，粒徑分布變化不明顯。

糖基化；蛋清蛋白質(zhì)；凝膠強(qiáng)度；粒徑分布

蛋清蛋白質(zhì)(egg white protein，EWP)良好的營養(yǎng)性和多種功能特性使其成為食品工業(yè)中重要的成分配料，被廣泛用于火腿、臘腸、魚糜制品及面類制品的生產(chǎn)中。隨著食品工業(yè)的發(fā)展，對具有更高功能特性的蛋清蛋白質(zhì)的需求極為迫切[1-3]。因此通過各種方法對蛋清蛋白質(zhì)的功能特性進(jìn)行改善具有重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值。

利用糖基化反應(yīng)對蛋清蛋白質(zhì)進(jìn)行糖基化修飾是一種安全廉價(jià)的改性方法，可以顯著改善蛋清蛋白質(zhì)的多種功能性質(zhì)。Kato[4]研究表明經(jīng)糖基化的卵白蛋白乳化性、熱穩(wěn)定性和抗微生物活性都好于未經(jīng)糖基化處理的卵白蛋白；Jafar等[5]利用高甲氧基果膠與蛋清蛋白質(zhì)進(jìn)行接枝反應(yīng)，結(jié)果表明產(chǎn)物的乳化性及乳化穩(wěn)定性都高于未改性的蛋清蛋白質(zhì)；Naotoshi等[6]利用半乳甘露聚糖與蛋清蛋白質(zhì)反應(yīng)，研究顯示改性后的蛋清蛋白質(zhì)的凝膠強(qiáng)度和持水性均好于未經(jīng)處理的蛋清蛋白質(zhì)；于濱等[7]利用葡聚糖對蛋清蛋白質(zhì)進(jìn)行糖基化改性研究，實(shí)驗(yàn)證明糖基化處理后，蛋清粉的凝膠性、熱穩(wěn)定性、乳化性和起泡性都有顯著提高。

雖然前人[4-7]對糖基化改善蛋清蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)進(jìn)行了較為深入的研究，但是很少涉及糖基化提高蛋清蛋白質(zhì)功能性的機(jī)理。蛋清蛋白質(zhì)的凝膠性是一種重要的特性指標(biāo)。研究糖基化反應(yīng)對蛋清蛋白質(zhì)凝膠性的影響，并對改性過程中各組分的變化情況及不同粒徑蛋白分子的分布情況進(jìn)行分析，不僅對進(jìn)一步研究改性機(jī)理具有重要意義，而且對改性蛋清蛋白質(zhì)的生產(chǎn)加工具有重要的指導(dǎo)價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

蛋清粉 市售。

殼聚糖 河北大地生物科技有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

ALC-310電子分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；722-2000型分光光度計(jì) 山東高密彩虹分析儀器有限公司；FDU-1100冷凍干燥機(jī) 日本Eyela公司；L-8800型氨基酸自動分析儀 日本日立公司；BI-200SM靜態(tài)激光散射儀 美國布魯克海文公司；TA-XTplus2質(zhì)構(gòu)儀 英國Stable Mic System公司；奧氏黏度計(jì) 上海隆拓儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 糖基化蛋清蛋白質(zhì)的制備

參考于濱等[7]糖基化蛋清蛋白質(zhì)(glycosylation egg white protein，GEWP)的制備方法，并作部分改動。將殼聚糖與蛋清蛋白質(zhì)以1:9(m/V)的比例充分混合，配制成10g/100mL的混合樣品溶液，冷凍干燥，將制得的混合粉置于裝有飽和KI溶液(相對濕度65%)的密閉容器中，60℃保溫1～5d，即制得不同反應(yīng)時間的糖基化蛋清蛋白質(zhì)。

1.2.2 糖基化蛋清蛋白質(zhì)凝膠強(qiáng)度和凝膠持水性的測定

凝膠制備：將蛋清粉配制成質(zhì)量濃度為10g/100mL的溶液，用0.1mol/L NaOH 或0.1mol/L HCl調(diào)pH值至7.0，然后取20mL該溶液移入直徑32mm體積25mL的燒杯中，用保鮮膜封口，90℃水浴20min，取出后在流水中快速冷卻，4℃靜置24h待測。

凝膠強(qiáng)度測定：根據(jù)Ju等[8]的方法并作部分改動，采用質(zhì)構(gòu)儀進(jìn)行測定，樣品測定在25℃進(jìn)行，儀器條件：采用P0.5探頭，測試前速率5.0mm/s；測試速率2.0mm/s；測試后速率2.0mm/s；下壓距離10mm；引發(fā)力5g。凝膠強(qiáng)度凝膠強(qiáng)度用硬度即探頭下壓過程中的最大感應(yīng)力表示。

凝膠持水性測定：根據(jù)Choi等[9]的方法，取一定質(zhì)量(m1)的凝膠體，切成大小均一的小粒，4000r/min離心20min，取出凝膠體用濾紙將表面水分吸干后稱質(zhì)量(m2)，凝膠體持水性按下式計(jì)算。

式中：m1為離心前凝膠體質(zhì)量/g；m2為離心后凝膠體質(zhì)量/g。

1.2.3 糖基化蛋清蛋白質(zhì)氨基酸含量測定

根據(jù)GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測定》方法進(jìn)行測定[10]。

1.2.4 糖基化蛋清蛋白質(zhì)總糖含量測定

采用苯酚-硫酸法測定。將糖基化蛋清粉配制成1g/100mL的水溶液，然后使用透析袋(截留分子質(zhì)量10000u)透析24h，吸取1mL透析液至試管中，加入6g/100mL苯酚1.0mL混勻，再加5mL濃硫酸，迅速混勻。室溫放置5min，然后在沸水浴中保溫15min，用水冷卻5min，再搖勻，以普通蛋白粉為空白，于490nm波長處測定吸光度，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總糖含量。

1.2.5 糖基化蛋清蛋白質(zhì)特性黏度測定

高分子溶液黏度與分子質(zhì)量及結(jié)構(gòu)符合Mark-Houwink方程[11]，即[η]=kMα(其中k和α是常數(shù)，其值取決于高分子及溶劑的性質(zhì)和溫度等因素)。利用奧氏黏度計(jì)測量黏度，25℃恒溫水浴，液體流過黏度計(jì)毛細(xì)管的時間通過精度為0.01s的電子數(shù)字秒表計(jì)時。每個數(shù)據(jù)點(diǎn)進(jìn)行3次重復(fù)，每2次實(shí)驗(yàn)的差值不大于0.05s，取3次測量的平均值作為最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.6 糖基化蛋清蛋白質(zhì)溶液粒徑分析

參照Schwenke等[12]和Easa等[13-14]的方法，并有所改動。稱取0.2g樣品，溶于20mL 0.1mol/L pH7.6的磷酸緩沖液中，磁力攪拌使其充分溶解，用靜態(tài)激光散射儀測定其粒徑分布。操作條件：介質(zhì)水溶液；掃描角度90°；溫度25℃；波長632.8nm。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

糖基化蛋清蛋白質(zhì)凝膠強(qiáng)度、持水性、特性黏度及總糖含量的測定實(shí)驗(yàn)每組重復(fù)3次，單因子方差分析通過SPSS V18.0的One-way ANOVA程序進(jìn)行分析，定義P＜0.05為差異顯著，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用Origin8.0繪制成圖，圖中誤差線為樣品標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 糖基化對蛋清蛋白質(zhì)凝膠強(qiáng)度和持水性的影響

圖1 糖基化蛋清蛋白質(zhì)凝膠性的變化Fig.1 Change in gel properties of GEWP with reaction time

由圖1可知，殼聚糖-蛋清蛋白質(zhì)糖基化接枝產(chǎn)物的凝膠強(qiáng)度的變化趨勢和持水性的變化趨勢相一致。糖基化處理1d后，凝膠強(qiáng)度和持水性稍有增強(qiáng)，在處理2～4d后，凝膠強(qiáng)度和持水性顯著提高，處理4d后達(dá)到最大值，分別由475.374g/cm2和52.6%提高到911.231g/cm2和71.1%，提高幅度分別達(dá)到91.7%和35.2%，但處理5d后的樣品凝膠強(qiáng)度和持水性開始下降。這可能是由于反應(yīng)開始時，殼聚糖與蛋白質(zhì)受熱逐步結(jié)合使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)部分展開，有利于某些基團(tuán)的暴露，從而使凝膠強(qiáng)度和持水性得到提高。隨著反應(yīng)時間的延長，蛋白質(zhì)與殼聚糖過度結(jié)合，反而使凝膠強(qiáng)度和持水性下降。

2.2 糖基化對蛋清蛋白質(zhì)氨基酸組成的影響

糖基化作用就是碳水化合物以共價(jià)鍵與蛋白質(zhì)分子上的α-或ε-氨基相連接而形成糖基化蛋白的化學(xué)反應(yīng)[15]。糖基化蛋清蛋白質(zhì)氨基酸組成變化對研究糖基化蛋清蛋白質(zhì)凝膠性和持水性的變化十分重要。糖基化前后蛋清蛋白質(zhì)氨基酸組成的變化見表1。糖基化后蛋清蛋白質(zhì)的各種氨基酸均有不同程度的損失，總氨基酸含量由80.02%下降至66.66%，這說明，糖基化作用對蛋清蛋白質(zhì)氨基酸造成了一定損失。尤其是賴氨酸，其含量相對降低了28.42%，顯著高于其他氨基酸損失的平均水平，這與Jafar等[5]的研究一致。造成賴氨酸大量損失的原因可能是賴氨酸的ε-氨基參與了與多糖的糖基化反應(yīng)。賴氨酸的大量損失會降低蛋清蛋白質(zhì)的生物有效性，同時也對其營養(yǎng)價(jià)值造成損害。然而，通過賴氨酸與殼聚糖的接枝反應(yīng)，蛋清蛋白質(zhì)獲得了大量的羥基，強(qiáng)化了蛋白質(zhì)之間的氫鍵作用，同時吸附了更多的水分子，從而增強(qiáng)了蛋清蛋白質(zhì)的凝膠強(qiáng)度和持水性。

2.3 糖基化對蛋清蛋白質(zhì)總糖含量及特性黏度的影響

圖2 糖基化對蛋清蛋白質(zhì)總糖含量和特性黏度的影響Fig.2 Effect of glycosylation on the content of total sugar and intrinsic viscosity of EWP

由圖2 可知，糖基化蛋清蛋白質(zhì)的總糖含量隨著處理時間的延長而不斷增加。反應(yīng)1d后，蛋清蛋白質(zhì)的總糖含量顯著(P＜0.05)增加，而在隨后的處理中增加不明顯，處理3、4、5d樣品總糖含量的增加已不顯著(P＞0.05)，最終總糖含量增至2.18%。這可能是由于處理1d內(nèi)糖基化反應(yīng)進(jìn)行的較快，生成了大量的糖基化蛋白，而隨著反應(yīng)的進(jìn)行，反應(yīng)底物減少，反應(yīng)的速率降低，糖基化蛋白在體系內(nèi)積累的速度也隨之降低。與未作處理的蛋清蛋白質(zhì)相比，糖基化蛋清蛋白質(zhì)的特性黏度都有所上升，并且呈現(xiàn)出隨處理時間延長而逐漸增加的趨勢。根據(jù)Mark-Houwink方程，可以認(rèn)為在一定溫度條件下，糖基化蛋清蛋白質(zhì)的平均分子質(zhì)量隨糖基化反應(yīng)的進(jìn)行不斷增大。這可能是不斷有多糖分子接枝到蛋清蛋白質(zhì)分子上，使糖基化產(chǎn)物的平均分子質(zhì)量不斷增加。此外，糖基化反應(yīng)過程中蛋白質(zhì)分子形態(tài)的改變也可能對增大特性黏度有影響。

2.4 糖基化對蛋清蛋白質(zhì)分子粒徑分布的影響

表1 糖基化對蛋清蛋白質(zhì)氨基酸組成的影響Table 1 Effect of glycosylation on amino acid compositions of EWP

圖3 糖基化蛋清蛋白質(zhì)粒徑分布隨時間的變化Fig.3 Change in particle size distribution of GEWP with reaction time

由圖3可知，相對于未糖基化的蛋清蛋白質(zhì)，糖基化蛋清蛋白質(zhì)的分子粒徑發(fā)生了明顯的變化。糖基化蛋清蛋白質(zhì)的分子粒徑主要分布在0.1～50.0μm范圍內(nèi)。而在此范圍內(nèi)，粒徑的分布有明顯分為小粒徑峰(0.1～1.0μm)和大粒徑峰(1.0～20.0μm)。經(jīng)過1d的糖基化處理，樣品的分子粒徑向較高的范圍內(nèi)轉(zhuǎn)變，大粒徑峰的面積明顯增大。反應(yīng)2d以后這種變化已不明顯。2～5d處理的樣品粒徑分布的峰形已沒有明顯區(qū)別。這說明多糖主要在2d內(nèi)接枝到蛋清蛋白質(zhì)上，這與凝膠強(qiáng)度和持水性以及總糖含量的增加相符。

表2 糖基化蛋清蛋白質(zhì)平均粒徑(D[4,3]和D[3,2])Table 2 Mean particle size of GEWP (D[4,3] and D[3,2])

表2列出了不同處理時間糖基化蛋清蛋白質(zhì)的平均分子直徑。其中D[4,3]表征的是體積的直徑，D[3,2]表征的面積的直徑?？梢钥闯?，隨著糖基化的進(jìn)行D[4,3]不斷增加，而D[3,2]在處理2d后已沒有變化。這可能是因?yàn)槎嗵堑逆溄釉黾恿说扒宓鞍踪|(zhì)的體積，但對蛋清蛋白質(zhì)面積的影響較小。這說明糖基化反應(yīng)引起了蛋清蛋白質(zhì)分子形態(tài)的變化，驗(yàn)證了上述研究中糖基化蛋清蛋白質(zhì)特性黏度的變化。

3 結(jié) 論

利用殼聚糖對蛋清蛋白質(zhì)進(jìn)行糖基化改性，反應(yīng)4d的改性蛋清蛋白質(zhì)的凝膠強(qiáng)度和持水性分別提高了91.7%和35.2%；糖基化蛋清蛋白質(zhì)總氨基酸含量降低了13.36%，其中賴氨酸損失最多，達(dá)到28.42%；總糖含量和特性黏度隨著反應(yīng)時間的延長不斷增加，但反應(yīng)2d以后總糖含量的增加不顯著(P＞0.05)；糖基化蛋清蛋白質(zhì)的分子粒徑主要分布在0.1～50.0μm的范圍內(nèi)，并分為大粒徑峰和小粒徑峰，糖基化蛋清蛋白質(zhì)的粒徑分布逐漸由小粒徑峰向大粒徑峰轉(zhuǎn)變，反應(yīng)2d后粒徑分布變化不再顯著。這不但對進(jìn)一步研究糖基化改性提高蛋清蛋白質(zhì)凝膠性的機(jī)理具有重要意義，同時對改性蛋清粉的加工具有一定的指導(dǎo)價(jià)值。

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Effect of Glycosylation on Gel Properties of Egg White Protein

SUN Qiang，CHI Yu-jie*，XU Wei
(College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

The effect of glycosylation on gel strength and water-holding capacity of egg white protein (EWP) was investigated. The change of amino acid compositions, total sugar content, and intrinsic viscosity as well as particle size distribution were detected by amino acid analyzer, phenol sulfuric acid method, and ostwald viscosimeter as well as static laser light scattering instrument. The results showed that gel strength and water-holding capacity of egg white protein were improved after glycosylation. Both of them reached to the highest value after glycosylation for four days, which revealed the improvement by 91.7% and 35.2%, respectively. The content of lysine in egg white protein exhibited a decrease by 28.42% and the content of total sugar revealed an increase by 2.18% at the fifth day during the glycosylation process. Intrinsic viscosity revealed a slight increase as the extension of treatment time. The particle size of the protein was in the range of 0.1－50.0μm and the conversion from small size protein to large size protein was observed at the first two days, and no significant change was observed during the last four days.

glycosylation；egg white protein；gel strength；particle size distribution

TS253.1

A

1002-6630(2012)05-0049-04

2011-04-06

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30871954)

孫強(qiáng)(1985—)，男，碩士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)。E-mail：swsunqiang@163.com

*通信作者：遲玉杰(1963—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)及農(nóng)產(chǎn)品深加工。E-mail：yjchi@126.com