生鮮牛乳中過氧化氫的電極檢測

孔維琴，陳志偉*，高廣恒，周萬里，朱思榮，史建國，趙建飛

(1.山東理工大學(xué)化學(xué)與工程學(xué)院，山東 淄博 255049；2.山東理工大學(xué)分析測試中心，山東 淄博 255049；3.山東省科學(xué)院生物研究所，山東 濟(jì)南 250014；4.石家莊君樂寶乳業(yè)有限公司，河北 石家莊 050221)

生鮮牛乳中過氧化氫的電極檢測

孔維琴1，陳志偉2,*，高廣恒3，周萬里3，朱思榮3，史建國3，趙建飛4

(1.山東理工大學(xué)化學(xué)與工程學(xué)院，山東 淄博 255049；2.山東理工大學(xué)分析測試中心，山東 淄博 255049；3.山東省科學(xué)院生物研究所，山東 濟(jì)南 250014；4.石家莊君樂寶乳業(yè)有限公司，河北 石家莊 050221)

優(yōu)化生鮮牛乳中過氧化氫電極檢測的工作條件，研究樣品處理方法對檢測結(jié)果的影響，重點(diǎn)比較電極法與過氧化氫試紙條法和淀粉-碘化鉀法的檢出率及誤判率，驗(yàn)證生鮮牛乳中過氧化氫的電極檢測法的可靠性。結(jié)果表明：在0～10mg/L和10～80mg/L范圍內(nèi)電極法的檢出率為分別為100%和93.33%，誤判率為7.14%和7.89%。試紙條法和淀粉-碘化鉀法的檢出率分別為0%和83.33%，誤判率分別為100%和20%。與過氧化氫試紙條法和淀粉-碘化鉀法相比，電極法能夠?qū)ιr牛乳中過氧化氫進(jìn)行定量檢測并具有較好的可靠性，有利于實(shí)現(xiàn)生鮮牛乳中過氧化氫的快速現(xiàn)場檢測。

生鮮牛乳；過氧化氫；電極法；檢測

過氧化氫是一種強(qiáng)氧化劑，具有消毒、殺菌和漂白等功能，被廣泛應(yīng)用于乳品[1]、水發(fā)產(chǎn)品[2]及魚類干貨[3]等食品的保鮮防腐和無菌包裝。研究表明，生鮮牛乳中殘留過量過氧化氫會影響其中αs-酪蛋白、牛血清蛋白等[4]蛋白質(zhì)的性質(zhì)，降低生鮮牛乳的營養(yǎng)價(jià)值，而且具有致癌、加速衰老、誘導(dǎo)心血管疾病等毒副作用[5]。為了保障乳品安全，減少過量使用或?yàn)E用過氧化氫所引起的中毒事件[6]，建立一種準(zhǔn)確快速檢測生鮮牛乳中過氧化氫的方法很有必要。

早在1957年，美國官方分析化學(xué)師協(xié)會(association of analytical communities，AOAC)曾公布利用二氧化鈦(TiO2)與硫酸制成的顯色劑可以定性判斷生鮮牛乳中是否存在過氧化氫(AOAC Offical method 957.08 hydrogen peroxide in milk)。1967年Amin等[7]提出分光光度法，Gilliland[8]提出酶法，F(xiàn)errier等[9]提出四氯化鈦法檢測生鮮牛乳中過氧化氫。Abbas等[10]采用基于Fenton反應(yīng)的熒光法對生鮮牛乳中過氧化氫進(jìn)行檢測。GB/T 23499—2009《食品中殘留過氧化氫的測定方法》[11]中推薦采用碘量法和鈦鹽比色法[12]測定食品中過氧化氫含量，但對蛋白含量高的液體樣品需添加除蛋白試劑進(jìn)行樣品前處理。此外還有過氧化氫試紙條法和淀粉-碘化鉀法。本實(shí)驗(yàn)采用電極法檢測生鮮牛乳中過氧化氫，能有效克服現(xiàn)有方法操作繁瑣、靈敏度差和成本高的缺點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)簡便、快速、準(zhǔn)確地檢測生鮮牛乳中殘留過氧化氫的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生鮮牛乳 蒙牛乳業(yè)泰安有限責(zé)任公司和石家莊君樂寶乳業(yè)有限公司；過氧化氫試紙條(110011 Peroxide Test) 德國默克(Merck)集團(tuán)；草酸鈉(工作基準(zhǔn)試劑) 天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；高錳酸鉀(分析純) 萊陽市康德化工有限公司；30g/100mL H2O2(分析純) 萊陽經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)精細(xì)化工廠；淀粉-碘化鉀溶液；硫酸(1+15)：量取10mL濃硫酸，放入150mL水中；0.2mol/L的Na2HPO4溶液；0.2mol/L的NaH2PO4溶液。

1.2 儀器與設(shè)備

SBA-50C電極 山東省科學(xué)院生物研究所；PHS-3C型pH計(jì) 上海精密儀器有限公司；CT15RT高速冷凍離心機(jī) 上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司；FA1604分析天平 上海天平儀器廠；SK5200LH超聲波清洗機(jī)上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司；DHG-9240A恒溫干燥箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 配制溶液

0.1mol/L的高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液：參考文獻(xiàn)[13]的方法配制和標(biāo)定。標(biāo)定30% H2O2：參考文獻(xiàn)[14]的方法稱量和測定。配制質(zhì)量濃度為10mg/L的過氧化氫標(biāo)準(zhǔn)溶液，同時配制過氧化氫質(zhì)量濃度為1、2、4、5、6、8、10mg/L的生鮮牛乳樣品溶液。

1.3.2 儀器定標(biāo)

首先，將電極的清洗時間、反應(yīng)時間和等待時間分別設(shè)置為50、30s和5s，定標(biāo)值為10。然后開機(jī)，用進(jìn)樣針準(zhǔn)確吸取30μL過氧化氫標(biāo)準(zhǔn)溶液，待進(jìn)樣燈閃爍時迅速注入反應(yīng)池，數(shù)據(jù)穩(wěn)定后讀取數(shù)據(jù)。重復(fù)上述操作，直至定標(biāo)指示燈停止閃爍，表明定標(biāo)成功。

1.3.3 測定樣品

定標(biāo)后，用清洗干凈的進(jìn)樣針準(zhǔn)確吸取30μL樣品溶液進(jìn)樣，其余步驟同1.3.2節(jié)操作。每個樣品重復(fù)進(jìn)樣3次，取3次數(shù)據(jù)的平均值為最終測定值。并以樣品質(zhì)量濃度/(mg/L)為X軸，測定值/(mg/L)為Y軸作數(shù)據(jù)曲線。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

利用統(tǒng)計(jì)學(xué)SPSS(statistical product and service solution)16.0軟件中的Explore程序，得到顯著水平為0.05時過氧化氫質(zhì)量濃度為5mg/L的生鮮牛乳樣品的電極測定值的置信區(qū)間，并以此作為統(tǒng)計(jì)判斷依據(jù)。利用統(tǒng)計(jì)學(xué)SPSS 16.0軟件中的Crosstabs程序進(jìn)行列聯(lián)表檢驗(yàn)，判斷電極法與過氧化氫試紙條法和淀粉-碘化鉀法之間是否存在顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)化電極工作條件

2.1.1 清洗時間的選擇

在不改變其他電極參數(shù)的前提下，將清洗時間分別設(shè)置為50、100s和150s，然后測定同一批次生鮮牛乳配制的過氧化氫質(zhì)量濃度為0、5、10mg/L的3個樣品，考察清洗時間對生鮮牛乳樣品測定結(jié)果的影響。結(jié)果表明，同一樣品在不同清洗時間下的測定值相同，即對電極清洗50s能滿足實(shí)驗(yàn)對電極清潔程度的需要。因此清洗時間選擇50s。

2.1.2 緩沖液pH值的選擇

在不改變其他電極參數(shù)的前提下，分別采用pH值為6.5、6.7、6.9、7.1、7.3、7.5的0.02mol/L磷酸鹽緩沖液作為電極緩沖液，然后測定同一批次生鮮牛乳配制的過氧化氫質(zhì)量濃度為0、2、4、6、8、10mg/L的6個樣品，考察緩沖液pH值對生鮮牛乳樣品測定結(jié)果的影響。同時與緩沖劑(pH7.25)條件下測定的結(jié)果對比。結(jié)果(圖1)表明，pH值為7.25時測定得到的數(shù)據(jù)曲線斜率最大，即在相同的濃度梯度內(nèi)，在該pH值條件下，電極對電流信號最敏感，得到的測定值最可靠，因此緩沖液pH值選擇7.25。

圖1 緩沖液pH值對生鮮牛乳測定的影響Fig.1 Effect of buffer pH on the detection of hydrogen peroxide in raw whole milk

2.2 不同樣品處理方法對測定的影響

2.2.1 煮沸對生鮮牛乳測定的影響

選用同一批次的生鮮牛乳配制過氧化氫質(zhì)量濃度為0、1、5、10mg/L的4個樣品，然后在優(yōu)化的電極工作條件下對煮沸處理前后的樣品分別進(jìn)行測定，考察煮沸對電極測定結(jié)果的影響。結(jié)果表明，煮沸后的測定值較煮沸前降低0.6～1mg/L。這可能是因?yàn)橹蠓惺沟蒙r牛乳內(nèi)部的保鮮平衡體系被打破，部分過氧化氫分解造成的。

2.2.2 脫脂對生鮮牛乳測定的影響

選用同一批次的生鮮牛乳配制過氧化氫質(zhì)量濃度為0、1、5、10mg/L的4個樣品，然后在優(yōu)化的電極工作條件下分別對脫脂處理(20℃，8000r/min，10min)前后的樣品進(jìn)行測定，考察脫脂對電極測定結(jié)果的影響，結(jié)果見表1。由表1可知，生鮮牛乳和脫脂牛乳的電極測定值完全相同。因此，脂肪對電極測定生鮮牛乳樣品中過氧化氫不存在干擾。

表1 生鮮牛乳與脫脂牛乳的電極測定結(jié)果Table 1 Results obtained for detection of hydrogen peroxide in raw whole milk and skim milk using the electrode method

2.2.3 稀釋對測定的影響

圖2 稀釋對生鮮牛乳測定的影響Fig.2 Effect of dilution ratio on the detection of hydrogen peroxide in raw whole milk

選用同一批次的生鮮牛乳配制過氧化氫質(zhì)量濃度為0、1、5、1mg/L的4個樣品，然后在優(yōu)化的電極工作條件下，將配制好的生鮮牛乳樣品分別稀釋0倍、1倍和5倍后進(jìn)行測定，考察稀釋前后電極測定結(jié)果的變化。結(jié)果(圖2)表明，測定值隨稀釋倍數(shù)近似成倍數(shù)減少，并且曲線下降趨勢趨于平緩。因此，稀釋并不能提高電極測定生鮮牛乳樣品的靈敏度。

2.3 與其他方法的比較

隨機(jī)選取21個批次的生鮮牛乳配制21個過氧化氫質(zhì)量濃度為5mg/L的樣品，利用電極法對21個生鮮牛乳樣品進(jìn)行測定。隨機(jī)選取8個批次的生鮮牛乳配制過氧化氫質(zhì)量濃度為0、6、7、8、9、10mg/L的生鮮牛乳樣品，考察電極法與過氧化氫試紙條法的測定結(jié)果。隨機(jī)選取6個批次的生鮮牛乳配制過氧化氫質(zhì)量濃度為10、20、50、60、80mg/L的生鮮牛乳樣品，考察電極法與淀粉-碘化鉀法的測定結(jié)果，結(jié)果見表2、3(電極測定值以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”的形式表示)。

依據(jù)GB 23499—2009《食品中殘留過氧化氫的測定方法》中碘量法和鈦鹽比色法的檢出限，將質(zhì)量濃度大于5mg/L的生鮮牛乳樣品作為研究對象，并定義檢出率和誤判率的計(jì)算公式如下：

表2 電極法和過氧化氫試紙條法的測定結(jié)果(n=8)Table 2 Comparative results obtained for detection of hydrogen peroxide in raw whole milk using the electrode method and paper indicator test(n=8)

表3 電極法和淀粉-碘化鉀法的測定結(jié)果(n=6)Table 3 Comparative results obtained for detection of hydrogen peroxide in raw whole milk using the electrode method and starch-potassium iodide method (n=6)

利用SPSS 16.0軟件對來自21個批次過氧化氫質(zhì)量濃度為5mg/L的生鮮牛乳樣品的電極測定值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，刪除離群值后得到5mg/L的電極測定值在置信度為95%時的置信區(qū)間是(2.47，2.85)。由2.1節(jié)和2.2節(jié)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在0～10mg/L范圍內(nèi)生鮮牛乳樣品的電極測定值隨著過氧化氫質(zhì)量濃度的增加而減少，因此判定電極測定值低于2.47的樣品質(zhì)量濃度均大于5mg/L。在10～80mg/L范圍內(nèi)，判定電極測定值超出95%置信區(qū)間(2.47，2.85)的樣品質(zhì)量濃度均大于5mg/L。

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：電極法在0～10mg/L和10～80mg/L范圍內(nèi)的檢出率分別為100%和93.33%，誤判率分別為7.14%和7.89%。試紙條法和淀粉-碘化鉀法的檢出率分別為0%和83.33%，誤判率分別為100%和20%。電極法檢出率為比試紙條法和淀粉-碘化鉀法分別高100%和10%，而7%左右的誤判率較之這兩種方法明顯偏低。依據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)卡方檢驗(yàn)知識，利用SPSS 16.0軟件的Crosstabs程序統(tǒng)計(jì)可知，顯著水平為0.05時電極法與過氧化氫試紙條法之間存在顯著性差異(x2＝72.053，P＜0.05)，而電極法與淀粉-碘化鉀法之間差異不顯著(x2＝0.647，P＞0.05)。

3 結(jié) 論

電極法測定生鮮牛乳中過氧化氫的工作條件和樣品處理方法非常簡單。電極檢測時可以將樣品直接注入反應(yīng)池，無須對樣品進(jìn)行處理，最大程度保留了殘留的過氧化氫，使測定結(jié)果更準(zhǔn)確可靠。電極檢測的最佳清洗時間50s、最佳反應(yīng)時間30s、最適pH7.25，能滿足生鮮牛乳中過氧化氫現(xiàn)場檢測的要求。與過氧化氫試紙條法和淀粉-碘化鉀法相比，電極法成功地實(shí)現(xiàn)了生鮮牛乳中過氧化氫的快速、準(zhǔn)確、低成本檢測，為生鮮牛乳中過氧化氫的限量分析提供一種新方法。

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Electrode Detection of Hydrogen Peroxide in Raw Whole Milk

KONG Wei-qin1，CHEN Zhi-wei2,*，GAO Guang-heng3，ZHOU Wan-li3，ZHU Si-rong3，SHI Jian-guo3，ZHAO Jian-fei4
(1. School of Chemical Engineering, Shandong University of Technology, Zibo 255049, China；2. Analytical and Testing Center, Shandong University of Technology, Zibo 255049, China；3. Biology Institute, Shandong Academy of Sciences, Jinan 250014, China；4. Shijiazhuang Junlebao Dairy Co. Ltd., Shijiazhuang 050221, China)

An analytical method for determining hydrogen peroxide in raw whole milk was developed using a platinum-silver electrode. Electrode working conditions and sample pretreatment were optimized. The results obtained for the positive rate and false positive rate of hydrogen peroxide by the proposed electrode method, hydrogen peroxide test strip method and starchpotassium iodide method were compared to validate the reliability of the electrode method. The electrode method provided detection rates of 100% and 93.33% and false detection rates of 7.14% and 7.89% for hydrogen peroxide in the ranges of 0－10 mg/L and 10－80 mg/L, respectively; in contrast, detection rates of 0% and 83.33% and false detection rates of 100% and 20% were obtained using the hydrogen peroxide test strip method and the starch-potassium iodide method, respectively. In conclusion, the electrode method allows reliable, rapid, on-the-spot quantitative detection of hydrogen peroxide in raw milk.

raw whole milk；hydrogen peroxide；electrode method；detection

TS202.3

A

1002-6630(2012)18-0177-04

2011-07-09

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31071538)；山東省科學(xué)儀器設(shè)備技術(shù)攻關(guān)項(xiàng)目(2008GG2TC01011-5)；山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家科研獎勵基金項(xiàng)目(2007BS06021)

孔維琴(1986—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)閼?yīng)用化學(xué)。E-mail：kongweiqin1986@163.com

*通信作者：陳志偉(1972—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)及分析測試。E-mail：chen@sdut.edu.cn