二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)優(yōu)化藥?；ㄇ嗨靥崛」に?/h1>
2012-10-28 01:46:26周蓓蓓程江華鄔德軒丁之恩閆曉明
食品科學(xué) 2012年8期
楊 松，周蓓蓓，程江華，鄔德軒，丁之恩,*，閆曉明,*
(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品學(xué)院，安徽 合肥 230036；2.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，安徽 合肥 230031)
二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)優(yōu)化藥?；ㄇ嗨靥崛」に?/p>
楊 松1,2，周蓓蓓2，程江華2，鄔德軒1，丁之恩1,*，閆曉明2,*
(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品學(xué)院，安徽 合肥 230036；2.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，安徽 合肥 230031)
在超聲波輔助條件下，采用四元二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)研究乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、時(shí)間、溫度4個(gè)因素對藥?；ㄇ嗨靥崛⌒实挠绊懀肈PS7.05軟件分析得出4個(gè)因素的回歸方程。結(jié)果表明，超聲波輔助提取最佳工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)范圍52.46%～55.93%、提取液料比范圍39.51:1～42.43:1(mL/g)、提取時(shí)間范圍27.77～32.23min、提取溫度范圍50.18～52.4℃，在此工藝條件下花青素提取效率均能達(dá)到67%以上。
藥桑；花青素；正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)；提取；優(yōu)化
新疆藥桑屬于半栽種的野生桑資源，藥桑在植物學(xué)分類上屬桑科，桑屬，黑桑種(Morus nigra Linn.)，新疆藥桑是我國唯一的黑桑種，也是一種在自然界極其罕見的具有22組染色體的22倍體桑樹種質(zhì)資源[1-2]。藥桑作為珍稀的藥食兼用桑屬品種資源，近年來引起了國內(nèi)外桑樹學(xué)科以及藥學(xué)、營養(yǎng)學(xué)專家的廣泛關(guān)注，開展了對藥桑生物活性成分及藥理作用的相關(guān)研究[3-5]。
合成色素穩(wěn)定性高，著色力強(qiáng)且成本低廉，但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)很多曾允許使用的人工合成食用色素對人體造成程度不一的損害。而天然色素具有安全、無毒、資源豐富的優(yōu)點(diǎn)，并具有一定營養(yǎng)和藥理作用，故天然色素市場日益擴(kuò)大[6]?；ㄇ嗨厥翘烊簧刂袘?yīng)用極其廣泛的一類色素，屬于多酚類化合物?；ㄇ嗨夭坏珴甚r亮，還具有很強(qiáng)的抗氧化活性，能夠減少冠心病、癌癥和腦血管疾病的發(fā)病機(jī)率[7-9]。因此，優(yōu)化花青素提取工藝，對花青素產(chǎn)品的開發(fā)具有重要的意義。
二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)是正交回歸試驗(yàn)設(shè)計(jì)的一種，它既能分析各處理因子的影響，又能建立定量的數(shù)學(xué)模型，屬更高級的試驗(yàn)設(shè)計(jì)技術(shù)[10-11]。
本研究在對6個(gè)提取條件進(jìn)行單因素考察基礎(chǔ)上，采用二次正交旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)法優(yōu)化花青素提取工藝參數(shù)，提高花青素提取率。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
桑椹：新疆藥桑品種，新疆維吾爾自治區(qū)和田蠶?？茖W(xué)研究所提供。
無水乙醇、濃鹽酸、氯化鉀、醋酸鈉均為分析純。
1.2 儀器與設(shè)備
SP-75紫外-可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；FS-450超聲波處理器 上海生析超聲儀器有限公司；真空干燥箱 上海實(shí)驗(yàn)儀器總廠；DFT-100多功能中藥粉碎機(jī) 溫嶺市大德中藥機(jī)械有限公司；FA2104電子天平 海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；FD-1CE真空冷凍干燥機(jī) 北京德天佑科技發(fā)展有限公司。
1.3 方法
1.3.1 桑椹花青素提取流程
1.3.2 桑椹花青素含量測定及提取率計(jì)算[12-15]
桑椹干粉中花青素含量的測定：精確稱取2.000g桑椹干粉，置于錐形瓶中，加入80mL酸性乙醇在超聲波輔助條件下提取，重復(fù)提取數(shù)次，直至提取液無色，提取液按pH示差法測定桑椹干粉花青素含量。
pH示差法操作如下：準(zhǔn)確移取2份1mL待測提取液分別置于10mL離心管中，再分別加入8mL pH1.0和pH4.5的緩沖液于離心管中。達(dá)平衡后，分別在520nm和700nm波長處測定吸光度。花青素含量計(jì)算公式如下：
式中：ΔA為吸光度差，ΔA＝(A520nm,pH1.0－A700nm,pH1.0)－(A520nm,pH4.5－A700nm,pH4.5)；ε為矢車菊花素-3-葡萄糖苷的消光系數(shù)，26900(L/(mol·cm))；DF為稀釋倍數(shù)；MW為矢車菊花素-3-葡萄糖苷的摩爾質(zhì)量，449.2g/moL；L為光程，1c m。
1.3.3 單因素試驗(yàn)
精確稱取1.000g桑椹干粉，加入一定體積的提取試劑。按不同的試驗(yàn)設(shè)計(jì)條件提取花青素，對提取溶液、提取液體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間、提取液料比和超聲波功率進(jìn)行單因素試驗(yàn)，重復(fù)3次，取平均值。
1.3.4 二次正交旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)
在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇合適的單因素，設(shè)計(jì)4因素4水平的二次正交旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)，以提取率為考察指標(biāo)，確定最優(yōu)提取工藝參數(shù)。
2 結(jié)果與分析
2.1 單因素試驗(yàn)
2.1.1 提取試劑對花青素提取率的影響
圖1 提取試劑對提取率的影響Fig.1 Effect of extraction solvent type on extraction efficiency
在提取溫度50℃、提取時(shí)間30min、液料比30:1(mL/g)、超聲波功率300W條件下，不同提取試劑對提取率的影響。如圖1所示，酸性乙醇的提取效果最好。花青素屬于黃酮類物質(zhì)，根據(jù)“相似相溶”原理，可溶于水、甲醇、乙醇等極性溶劑，并且在與其極性最相近的溶液中溶解性最好。此外，花青素在弱酸性條件下性質(zhì)穩(wěn)定，結(jié)構(gòu)不易發(fā)生改變，而在中性和弱堿性條件下性質(zhì)相對不穩(wěn)定。因此，本實(shí)驗(yàn)以酸性乙醇作為提取溶劑。
2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對花青素提取率的影響
圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對花青素提取率的影響Fig.2 Effect of alcohol concentration on extraction efficiency
在酸性乙醇為提取試劑(其他條件如2.1.1節(jié))下，不同體積分?jǐn)?shù)乙醇對提取率的影響如由圖2所示，提取率隨著酸性乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大先不斷增高至最高點(diǎn)后降低。當(dāng)酸性乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，提取率最大。乙醇浸提使花青素溶入乙醇溶液，乙醇溶液的極性隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高而變小，當(dāng)溶劑極性和花青素極性最相近時(shí)，花青素在溶劑中溶解性最好，則花青素提取率最高。
2.1.3 提取溫度對花青素提取率的影響
圖3 提取溫度對花青素提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction efficiency
圖3表示不同溫度對花青素提取率的影響(50%酸性乙醇為提取試劑，其他條件如2.1.1節(jié))。由圖3可知，溫度較低時(shí)，桑椹花青素提取率隨著提取溫度的升高而增長。當(dāng)提取溫度為50℃時(shí)，提取率最大。但是繼續(xù)升高溫度后提取率反而下降，這可能與花色苷物質(zhì)耐熱性較差，在高溫下易發(fā)生結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而褪色有關(guān)。因此過高的溫度(＞50℃)會對桑椹花青素的色價(jià)及穩(wěn)定性有造成一定影響。而低溫條件(＜50℃)下提取率較低，造成資源的浪費(fèi)。
2.1.4 超聲波功率對花青素提取率的影響
圖4 超聲波功率對提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on extraction efficiency
圖4表示不同超聲波功率對花青素提取率的影響(50%酸性乙醇為提取試劑，其他條件如2.1.1節(jié))。由圖4可知，超聲波功率在100～500W時(shí)，花青素提取率隨著超聲波功率的提高而提高。當(dāng)超聲波功率達(dá)到300W時(shí)，繼續(xù)提高超聲波功率，提取率無顯著增長。超聲波的提取機(jī)理主要是超聲波在提取溶液中產(chǎn)生的“空化效應(yīng)”和機(jī)械作用：超聲波一方面可有效地破碎桑椹的細(xì)胞壁，使花青素呈游離狀態(tài)并溶入乙醇中，另一方面可加速乙醇的分子運(yùn)動(dòng)，使乙醇和花青素中快速接觸，相互溶合、混合。當(dāng)超聲波功率較低時(shí)，破碎力度不夠，使得花青素不能快速的融入乙醇中，所以提取率較低。但超聲波功率過高時(shí)，環(huán)境噪音過大，且提取率沒有顯著提高，因此，考慮節(jié)能環(huán)保等因素，故選用300W作為提取功率。
2.1.5 提取時(shí)間對花青素提取率的影響
圖5 提取時(shí)間對提取率的影響Fig.5 Effect of extraction time on extraction efficiency
圖5表示不同的提取時(shí)間對花青素提取率的影響(50%酸性乙醇為提取試劑，其他條件如2.1.1節(jié))。從圖5可見，提取時(shí)間在10～50min時(shí)，花青素提取率隨著提取時(shí)間的延長先提高后降低。當(dāng)提取時(shí)間為20min時(shí)，提取率最大。提取時(shí)間為10min時(shí)，由于提取時(shí)間較短導(dǎo)致桑椹細(xì)胞中花青素?zé)o法得到完全的釋放，使得提取效果不理想。但是當(dāng)提取時(shí)間超過30min時(shí)，由于提取時(shí)間過長，導(dǎo)致花青素的結(jié)構(gòu)可能受到超聲作用的破壞而使提取率下降。
2.1.6 液料比對花青素提取率的影響
圖6 液料比對花青素提取率的影響Fig.6 Effect of solid-to-liquid ratio on extraction efficiency
圖6表示在不同的液料比對花青素提取率的影響(50%酸性乙醇為提取試劑，其他條件如2.1.1節(jié))。由圖6可見，液料比在10:1～30:1(mL/g)時(shí)，花青素提取率隨著液料比的增加而提高，這與提取液料比過低，桑椹中花青素?zé)o法被乙醇溶液完全浸提出來有關(guān)。在液料比達(dá)到30:1(mL/g)后，花青素提取效率無顯著升高。因此選定30:1(mL/g)為最佳液料比。
2.2 二次正交旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)
2.2.1 二次正交旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果
表1 二次正交旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal rotation combination design
表2 藥?；ㄇ嗨靥崛《握恍D(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Orthogonal rotation combination design scheme and results
根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以花青素提取液中花青素含量為考察目標(biāo)，設(shè)計(jì)4因素4水平的二次正交旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)。確定提乙醇體積分?jǐn)?shù)(X1)、提取液料比(X2)、提取時(shí)間(X3)、提取溫度(X4)的零水平分別為50%、30:1(mL/g)、30min、50℃，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1、2。
2.2.2 回歸模型建立與檢驗(yàn)
采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對表2中的結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)式逐步回歸分析，得到花青素提取效率(Y)和乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取液料比、提取時(shí)間和提取溫度的回歸模型：
表3 試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of the experimental results of orthogonal rotation combination design
由表3可見，回歸方程的矢擬性檢驗(yàn)F1＝0.79616＜F0.05(10,11)＝ 2.85 及 F0.01(10,11)＝ 4.54，F(xiàn)2＝ 6.17132 ＞F0.01(14,21)＝3.07及F0.05(14,21)＝2.20，說明模型的預(yù)測準(zhǔn)確，模型成立，可用于描述花青素提取效率隨提取液料比、提取時(shí)間、提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)變化的規(guī)律。
在α＝0.05顯著水平上剔除不顯著項(xiàng)后，簡化的回歸方程：
2.2.3 主效應(yīng)分析
P值即概率，反映某一事件發(fā)生的可能性大小。各因素的P值可以反映出各因素對試驗(yàn)指標(biāo)的重要性，P值越小，表明該因素對試驗(yàn)結(jié)果影響越大，即重要性越大[16]。由表3可見，4個(gè)試驗(yàn)因素對花青素提取率影響大小依次為提取液料比＞提取溫度＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取時(shí)間。
2.2.4 單因素效應(yīng)分析
將得到的回歸方程中的四個(gè)因素任意三個(gè)固定在零水平，得：
把4個(gè)因子的取值固定在－2、－1.6、－1.2、－0.8、－0.4、0、0.4、0.8、1.2、1.6、2水平，根據(jù)上述方程，計(jì)算出各因子在11個(gè)不同水平上花青素提取效率(Y)，并以此作圖，結(jié)果見圖7。
圖7 各單因素與花青素提取效率的關(guān)系Fig.7 Relationship between each variable and extraction efficiency of anthocyanidin
由圖7可見，在各因子處于－2～2這一水平區(qū)間時(shí)，提取液料比與花青素提取率的關(guān)系最接近線性條件，表明提取液料比對花青素提取效率的影響最顯著，另外提取液料比的升高有利于花青素提取率的增大。而乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間和提取溫度與花青素提取率的關(guān)系曲線呈拋物線狀，表明這3個(gè)因素不能無限制的升高，超過一定范圍便會使花青素提取率降低。尤其是提取溫度的升高會顯著降低花青素提取率。此外，圖7中各因素變化趨勢與前面單因素試驗(yàn)結(jié)果基本吻合。
2.2.5 提取參數(shù)優(yōu)化
為了得出最佳的提取參數(shù)，通常對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行頻數(shù)分析。選取了提取效率大于67%的155個(gè)方案進(jìn)行頻數(shù)分析，得到95%的置信區(qū)間，如表4所示。
由表4可知，花青素提取最佳工藝參數(shù)范圍為：乙醇體積分?jǐn)?shù)52.46%～55.93%、提取液料比39.51:1～42.43:1(mL/g)、提取時(shí)間27.77～32.23min、提取溫度50.18～52.4℃，在此參數(shù)范圍內(nèi)，花青素提取效率均大于67%。
表4 各變量取值頻率分布Table 4 Probability distribution of each variable
2.2.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)
從優(yōu)化提取參數(shù)范圍內(nèi)隨機(jī)選擇3個(gè)組合進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表5。
表5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of validation experiments
由表5可見，3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)平均理論值為71.66%，平均實(shí)際值為71.18%，兩者僅相差0.48%，可見實(shí)際值與理論值基本吻合，且均在67%以上。由此可知，采用本實(shí)驗(yàn)的工藝參數(shù)，可獲得67%以上的花青素提取效率。
3 結(jié) 論
根據(jù)二次正交旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，花青素提取效率影響大小的因素依次為提取料液比＞提取溫度＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取時(shí)間，且花青素提取最佳工藝參數(shù)范圍為乙醇體積分?jǐn)?shù)52.46%～55.93%、提取料液比39.51:1～42.43:1(mL/g)、提取時(shí)間27.77～32.23min、提取溫度50.18～52.4℃，在此參數(shù)范圍內(nèi)，花青素提取效率均大于67%。最后進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果與預(yù)測值基本吻合。因此本研究為提取桑椹花青素提供了較好的提取方案。
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Optimization of Anthocyanidin Extraction from Black Mulberry (Morus nigra L.) by Quadratic Orthogonal Rotation Combination Design
YANG Song1,2，ZHOU Bei-bei2，CHENG Jiang-hua2，WU De-xuan1，Ding Zhi-en1,*，YAN Xiao-ming2,*
(1. College of Tea and Food, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China；
2. Institute of Agro-food Science and Technology, Anhui Academy of Agricultural Sciences, Hefei 230031, China)
A quadratic orthogonal rotation combination design was used to explore the effects of ethanol concentration,material-to-liquid ratio, extraction time and extraction temperature on extraction rate of anthocyanidin from black mulberry(Morus nigra L.) by ultrasonic-assisted extraction. A regression equation was established using DPS7.05 software. The optimal extraction conditions were found to be 52.46%－55.93% ethanol as extraction solvent at a liquid-to-material ratio of 39.51:1－42.43:1 (mL/g) for 27.77－32.23 min of extraction at 50.18－52.4 ℃. Under these conditions, the extraction rate of anthocyanidin was more than 67%.
black mulberry；anthocyanidin；orthogonal rotation combination design；extraction；optimization
TS202.3
A
1002-6630(2012)08-0033-06
2011-11-11
安徽省科技廳項(xiàng)目(100807030300)；安徽省財(cái)政廳項(xiàng)目
楊松(1986—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。E-mail：ys985826@163.com
*通信作者：丁之恩(1954—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。E-mail：dingze78@ahau.edu.cn
閆曉明(1963—)，男，研究員，本科，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。E-mail：582511625@qq.com
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楊 松，周蓓蓓，程江華，鄔德軒，丁之恩,*，閆曉明,*
(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品學(xué)院，安徽 合肥 230036；2.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，安徽 合肥 230031)
二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)優(yōu)化藥?；ㄇ嗨靥崛」に?/p>
楊 松1,2，周蓓蓓2，程江華2，鄔德軒1，丁之恩1,*，閆曉明2,*
(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品學(xué)院，安徽 合肥 230036；2.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，安徽 合肥 230031)
在超聲波輔助條件下，采用四元二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)研究乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、時(shí)間、溫度4個(gè)因素對藥?；ㄇ嗨靥崛⌒实挠绊懀肈PS7.05軟件分析得出4個(gè)因素的回歸方程。結(jié)果表明，超聲波輔助提取最佳工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)范圍52.46%～55.93%、提取液料比范圍39.51:1～42.43:1(mL/g)、提取時(shí)間范圍27.77～32.23min、提取溫度范圍50.18～52.4℃，在此工藝條件下花青素提取效率均能達(dá)到67%以上。
藥桑；花青素；正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)；提取；優(yōu)化
新疆藥桑屬于半栽種的野生桑資源，藥桑在植物學(xué)分類上屬桑科，桑屬，黑桑種(Morus nigra Linn.)，新疆藥桑是我國唯一的黑桑種，也是一種在自然界極其罕見的具有22組染色體的22倍體桑樹種質(zhì)資源[1-2]。藥桑作為珍稀的藥食兼用桑屬品種資源，近年來引起了國內(nèi)外桑樹學(xué)科以及藥學(xué)、營養(yǎng)學(xué)專家的廣泛關(guān)注，開展了對藥桑生物活性成分及藥理作用的相關(guān)研究[3-5]。
合成色素穩(wěn)定性高，著色力強(qiáng)且成本低廉，但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)很多曾允許使用的人工合成食用色素對人體造成程度不一的損害。而天然色素具有安全、無毒、資源豐富的優(yōu)點(diǎn)，并具有一定營養(yǎng)和藥理作用，故天然色素市場日益擴(kuò)大[6]?；ㄇ嗨厥翘烊簧刂袘?yīng)用極其廣泛的一類色素，屬于多酚類化合物?；ㄇ嗨夭坏珴甚r亮，還具有很強(qiáng)的抗氧化活性，能夠減少冠心病、癌癥和腦血管疾病的發(fā)病機(jī)率[7-9]。因此，優(yōu)化花青素提取工藝，對花青素產(chǎn)品的開發(fā)具有重要的意義。
二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)是正交回歸試驗(yàn)設(shè)計(jì)的一種，它既能分析各處理因子的影響，又能建立定量的數(shù)學(xué)模型，屬更高級的試驗(yàn)設(shè)計(jì)技術(shù)[10-11]。
本研究在對6個(gè)提取條件進(jìn)行單因素考察基礎(chǔ)上，采用二次正交旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)法優(yōu)化花青素提取工藝參數(shù)，提高花青素提取率。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
桑椹：新疆藥桑品種，新疆維吾爾自治區(qū)和田蠶?？茖W(xué)研究所提供。
無水乙醇、濃鹽酸、氯化鉀、醋酸鈉均為分析純。
1.2 儀器與設(shè)備
SP-75紫外-可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；FS-450超聲波處理器 上海生析超聲儀器有限公司；真空干燥箱 上海實(shí)驗(yàn)儀器總廠；DFT-100多功能中藥粉碎機(jī) 溫嶺市大德中藥機(jī)械有限公司；FA2104電子天平 海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；FD-1CE真空冷凍干燥機(jī) 北京德天佑科技發(fā)展有限公司。
1.3 方法
1.3.1 桑椹花青素提取流程
1.3.2 桑椹花青素含量測定及提取率計(jì)算[12-15]
桑椹干粉中花青素含量的測定：精確稱取2.000g桑椹干粉，置于錐形瓶中，加入80mL酸性乙醇在超聲波輔助條件下提取，重復(fù)提取數(shù)次，直至提取液無色，提取液按pH示差法測定桑椹干粉花青素含量。
pH示差法操作如下：準(zhǔn)確移取2份1mL待測提取液分別置于10mL離心管中，再分別加入8mL pH1.0和pH4.5的緩沖液于離心管中。達(dá)平衡后，分別在520nm和700nm波長處測定吸光度。花青素含量計(jì)算公式如下：
式中：ΔA為吸光度差，ΔA＝(A520nm,pH1.0－A700nm,pH1.0)－(A520nm,pH4.5－A700nm,pH4.5)；ε為矢車菊花素-3-葡萄糖苷的消光系數(shù)，26900(L/(mol·cm))；DF為稀釋倍數(shù)；MW為矢車菊花素-3-葡萄糖苷的摩爾質(zhì)量，449.2g/moL；L為光程，1c m。
1.3.3 單因素試驗(yàn)
精確稱取1.000g桑椹干粉，加入一定體積的提取試劑。按不同的試驗(yàn)設(shè)計(jì)條件提取花青素，對提取溶液、提取液體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間、提取液料比和超聲波功率進(jìn)行單因素試驗(yàn)，重復(fù)3次，取平均值。
1.3.4 二次正交旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)
在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇合適的單因素，設(shè)計(jì)4因素4水平的二次正交旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)，以提取率為考察指標(biāo)，確定最優(yōu)提取工藝參數(shù)。
2 結(jié)果與分析
2.1 單因素試驗(yàn)
2.1.1 提取試劑對花青素提取率的影響
圖1 提取試劑對提取率的影響Fig.1 Effect of extraction solvent type on extraction efficiency
在提取溫度50℃、提取時(shí)間30min、液料比30:1(mL/g)、超聲波功率300W條件下，不同提取試劑對提取率的影響。如圖1所示，酸性乙醇的提取效果最好。花青素屬于黃酮類物質(zhì)，根據(jù)“相似相溶”原理，可溶于水、甲醇、乙醇等極性溶劑，并且在與其極性最相近的溶液中溶解性最好。此外，花青素在弱酸性條件下性質(zhì)穩(wěn)定，結(jié)構(gòu)不易發(fā)生改變，而在中性和弱堿性條件下性質(zhì)相對不穩(wěn)定。因此，本實(shí)驗(yàn)以酸性乙醇作為提取溶劑。
2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對花青素提取率的影響
圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對花青素提取率的影響Fig.2 Effect of alcohol concentration on extraction efficiency
在酸性乙醇為提取試劑(其他條件如2.1.1節(jié))下，不同體積分?jǐn)?shù)乙醇對提取率的影響如由圖2所示，提取率隨著酸性乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大先不斷增高至最高點(diǎn)后降低。當(dāng)酸性乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，提取率最大。乙醇浸提使花青素溶入乙醇溶液，乙醇溶液的極性隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高而變小，當(dāng)溶劑極性和花青素極性最相近時(shí)，花青素在溶劑中溶解性最好，則花青素提取率最高。
2.1.3 提取溫度對花青素提取率的影響
圖3 提取溫度對花青素提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction efficiency
圖3表示不同溫度對花青素提取率的影響(50%酸性乙醇為提取試劑，其他條件如2.1.1節(jié))。由圖3可知，溫度較低時(shí)，桑椹花青素提取率隨著提取溫度的升高而增長。當(dāng)提取溫度為50℃時(shí)，提取率最大。但是繼續(xù)升高溫度后提取率反而下降，這可能與花色苷物質(zhì)耐熱性較差，在高溫下易發(fā)生結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而褪色有關(guān)。因此過高的溫度(＞50℃)會對桑椹花青素的色價(jià)及穩(wěn)定性有造成一定影響。而低溫條件(＜50℃)下提取率較低，造成資源的浪費(fèi)。
2.1.4 超聲波功率對花青素提取率的影響
圖4 超聲波功率對提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on extraction efficiency
圖4表示不同超聲波功率對花青素提取率的影響(50%酸性乙醇為提取試劑，其他條件如2.1.1節(jié))。由圖4可知，超聲波功率在100～500W時(shí)，花青素提取率隨著超聲波功率的提高而提高。當(dāng)超聲波功率達(dá)到300W時(shí)，繼續(xù)提高超聲波功率，提取率無顯著增長。超聲波的提取機(jī)理主要是超聲波在提取溶液中產(chǎn)生的“空化效應(yīng)”和機(jī)械作用：超聲波一方面可有效地破碎桑椹的細(xì)胞壁，使花青素呈游離狀態(tài)并溶入乙醇中，另一方面可加速乙醇的分子運(yùn)動(dòng)，使乙醇和花青素中快速接觸，相互溶合、混合。當(dāng)超聲波功率較低時(shí)，破碎力度不夠，使得花青素不能快速的融入乙醇中，所以提取率較低。但超聲波功率過高時(shí)，環(huán)境噪音過大，且提取率沒有顯著提高，因此，考慮節(jié)能環(huán)保等因素，故選用300W作為提取功率。
2.1.5 提取時(shí)間對花青素提取率的影響
圖5 提取時(shí)間對提取率的影響Fig.5 Effect of extraction time on extraction efficiency
圖5表示不同的提取時(shí)間對花青素提取率的影響(50%酸性乙醇為提取試劑，其他條件如2.1.1節(jié))。從圖5可見，提取時(shí)間在10～50min時(shí)，花青素提取率隨著提取時(shí)間的延長先提高后降低。當(dāng)提取時(shí)間為20min時(shí)，提取率最大。提取時(shí)間為10min時(shí)，由于提取時(shí)間較短導(dǎo)致桑椹細(xì)胞中花青素?zé)o法得到完全的釋放，使得提取效果不理想。但是當(dāng)提取時(shí)間超過30min時(shí)，由于提取時(shí)間過長，導(dǎo)致花青素的結(jié)構(gòu)可能受到超聲作用的破壞而使提取率下降。
2.1.6 液料比對花青素提取率的影響
圖6 液料比對花青素提取率的影響Fig.6 Effect of solid-to-liquid ratio on extraction efficiency
圖6表示在不同的液料比對花青素提取率的影響(50%酸性乙醇為提取試劑，其他條件如2.1.1節(jié))。由圖6可見，液料比在10:1～30:1(mL/g)時(shí)，花青素提取率隨著液料比的增加而提高，這與提取液料比過低，桑椹中花青素?zé)o法被乙醇溶液完全浸提出來有關(guān)。在液料比達(dá)到30:1(mL/g)后，花青素提取效率無顯著升高。因此選定30:1(mL/g)為最佳液料比。
2.2 二次正交旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)
2.2.1 二次正交旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果
表1 二次正交旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal rotation combination design
表2 藥?；ㄇ嗨靥崛《握恍D(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Orthogonal rotation combination design scheme and results
根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以花青素提取液中花青素含量為考察目標(biāo)，設(shè)計(jì)4因素4水平的二次正交旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)。確定提乙醇體積分?jǐn)?shù)(X1)、提取液料比(X2)、提取時(shí)間(X3)、提取溫度(X4)的零水平分別為50%、30:1(mL/g)、30min、50℃，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1、2。
2.2.2 回歸模型建立與檢驗(yàn)
采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對表2中的結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)式逐步回歸分析，得到花青素提取效率(Y)和乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取液料比、提取時(shí)間和提取溫度的回歸模型：
表3 試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of the experimental results of orthogonal rotation combination design
由表3可見，回歸方程的矢擬性檢驗(yàn)F1＝0.79616＜F0.05(10,11)＝ 2.85 及 F0.01(10,11)＝ 4.54，F(xiàn)2＝ 6.17132 ＞F0.01(14,21)＝3.07及F0.05(14,21)＝2.20，說明模型的預(yù)測準(zhǔn)確，模型成立，可用于描述花青素提取效率隨提取液料比、提取時(shí)間、提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)變化的規(guī)律。
在α＝0.05顯著水平上剔除不顯著項(xiàng)后，簡化的回歸方程：
2.2.3 主效應(yīng)分析
P值即概率，反映某一事件發(fā)生的可能性大小。各因素的P值可以反映出各因素對試驗(yàn)指標(biāo)的重要性，P值越小，表明該因素對試驗(yàn)結(jié)果影響越大，即重要性越大[16]。由表3可見，4個(gè)試驗(yàn)因素對花青素提取率影響大小依次為提取液料比＞提取溫度＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取時(shí)間。
2.2.4 單因素效應(yīng)分析
將得到的回歸方程中的四個(gè)因素任意三個(gè)固定在零水平，得：
把4個(gè)因子的取值固定在－2、－1.6、－1.2、－0.8、－0.4、0、0.4、0.8、1.2、1.6、2水平，根據(jù)上述方程，計(jì)算出各因子在11個(gè)不同水平上花青素提取效率(Y)，并以此作圖，結(jié)果見圖7。
圖7 各單因素與花青素提取效率的關(guān)系Fig.7 Relationship between each variable and extraction efficiency of anthocyanidin
由圖7可見，在各因子處于－2～2這一水平區(qū)間時(shí)，提取液料比與花青素提取率的關(guān)系最接近線性條件，表明提取液料比對花青素提取效率的影響最顯著，另外提取液料比的升高有利于花青素提取率的增大。而乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間和提取溫度與花青素提取率的關(guān)系曲線呈拋物線狀，表明這3個(gè)因素不能無限制的升高，超過一定范圍便會使花青素提取率降低。尤其是提取溫度的升高會顯著降低花青素提取率。此外，圖7中各因素變化趨勢與前面單因素試驗(yàn)結(jié)果基本吻合。
2.2.5 提取參數(shù)優(yōu)化
為了得出最佳的提取參數(shù)，通常對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行頻數(shù)分析。選取了提取效率大于67%的155個(gè)方案進(jìn)行頻數(shù)分析，得到95%的置信區(qū)間，如表4所示。
由表4可知，花青素提取最佳工藝參數(shù)范圍為：乙醇體積分?jǐn)?shù)52.46%～55.93%、提取液料比39.51:1～42.43:1(mL/g)、提取時(shí)間27.77～32.23min、提取溫度50.18～52.4℃，在此參數(shù)范圍內(nèi)，花青素提取效率均大于67%。
表4 各變量取值頻率分布Table 4 Probability distribution of each variable
2.2.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)
從優(yōu)化提取參數(shù)范圍內(nèi)隨機(jī)選擇3個(gè)組合進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表5。
表5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of validation experiments
由表5可見，3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)平均理論值為71.66%，平均實(shí)際值為71.18%，兩者僅相差0.48%，可見實(shí)際值與理論值基本吻合，且均在67%以上。由此可知，采用本實(shí)驗(yàn)的工藝參數(shù)，可獲得67%以上的花青素提取效率。
3 結(jié) 論
根據(jù)二次正交旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，花青素提取效率影響大小的因素依次為提取料液比＞提取溫度＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取時(shí)間，且花青素提取最佳工藝參數(shù)范圍為乙醇體積分?jǐn)?shù)52.46%～55.93%、提取料液比39.51:1～42.43:1(mL/g)、提取時(shí)間27.77～32.23min、提取溫度50.18～52.4℃，在此參數(shù)范圍內(nèi)，花青素提取效率均大于67%。最后進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果與預(yù)測值基本吻合。因此本研究為提取桑椹花青素提供了較好的提取方案。
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Optimization of Anthocyanidin Extraction from Black Mulberry (Morus nigra L.) by Quadratic Orthogonal Rotation Combination Design
YANG Song1,2，ZHOU Bei-bei2，CHENG Jiang-hua2，WU De-xuan1，Ding Zhi-en1,*，YAN Xiao-ming2,*
(1. College of Tea and Food, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China；
2. Institute of Agro-food Science and Technology, Anhui Academy of Agricultural Sciences, Hefei 230031, China)
A quadratic orthogonal rotation combination design was used to explore the effects of ethanol concentration,material-to-liquid ratio, extraction time and extraction temperature on extraction rate of anthocyanidin from black mulberry(Morus nigra L.) by ultrasonic-assisted extraction. A regression equation was established using DPS7.05 software. The optimal extraction conditions were found to be 52.46%－55.93% ethanol as extraction solvent at a liquid-to-material ratio of 39.51:1－42.43:1 (mL/g) for 27.77－32.23 min of extraction at 50.18－52.4 ℃. Under these conditions, the extraction rate of anthocyanidin was more than 67%.
black mulberry；anthocyanidin；orthogonal rotation combination design；extraction；optimization
TS202.3
A
1002-6630(2012)08-0033-06
2011-11-11
安徽省科技廳項(xiàng)目(100807030300)；安徽省財(cái)政廳項(xiàng)目
楊松(1986—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。E-mail：ys985826@163.com
*通信作者：丁之恩(1954—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。E-mail：dingze78@ahau.edu.cn
閆曉明(1963—)，男，研究員，本科，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。E-mail：582511625@qq.com
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