響應(yīng)面法優(yōu)化豐年蟲卵殼脫乙酰度殼聚糖提取工藝

黃曉燕，張建新*，王 欣，彭鑫華，聶 路

(西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

響應(yīng)面法優(yōu)化豐年蟲卵殼脫乙酰度殼聚糖提取工藝

黃曉燕，張建新*，王 欣，彭鑫華，聶 路

(西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

以豐年蟲卵殼制備的甲殼素為原料，通過單因素試驗和響應(yīng)面設(shè)計法，確定豐年蟲卵殼殼聚糖微波輔助提取技術(shù)的最佳工藝條件為微波時間33.4min、乙醇浸泡時間86min、堿液質(zhì)量分數(shù)57.27%。按此工藝條件提取可獲得脫乙酰度為84.12%的豐年蟲殼聚糖。

殼聚糖；豐年蟲；響應(yīng)面；微波；脫乙酰度

豐年蟲(Chirocephalus diaphanous)，又名仙女蝦(fairy shrimp)，主要存在于海水及鹽湖水中[1]。對豐年蟲研究表明其營養(yǎng)價值豐富[2-3]，且卵殼中含有豐富的甲殼素，但是對其卵殼的利用不是很充分。殼聚糖是甲殼素的脫乙?；a(chǎn)物，比較甲殼素，溶解性更好，應(yīng)用范圍更廣。殼聚糖及其衍生物具有減肥、去脂、抗菌、增強免疫、降低血壓等作用[4-7]，因此殼聚糖在食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價值。微波法具有降能耗，減污染，省時間和原料等優(yōu)勢[8-11]。本實驗在堿液和有機溶劑結(jié)合條件下，同時進行微波輔助分段處理，使得甲殼素充分脫乙?；苽漭^高脫乙酰度[12]殼聚糖，通過響應(yīng)曲面法設(shè)計試驗，探求微波提取脫乙酰度較高的殼聚糖的最佳工藝條件，為豐年蟲卵殼的利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豐年蟲卵殼 陜西豐源生物科技有限公司；豐年蟲甲殼素 實驗室自制；N-乙酰-D-氨基葡萄糖(含量＞99%) 沃爾森生物技術(shù)有限公司；95%乙醇、NaOH、HCl、冰醋酸均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

P70D20T-J-D3型微波爐 格蘭仕微波爐電器有限公司；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；KDC-40型低速離心機 科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；FA2004型分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；101-Z型電熱鼓風(fēng)干燥箱 北京科偉永興儀器有限公司；UV-2550型紫外分光光度計日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 豐年蟲卵殼殼聚糖生產(chǎn)工藝流程

豐年蟲甲殼素→乙醇浸泡→加入NaOH溶液后微波一段時間→離心→濾渣洗至中性→體積分數(shù)10% HAc溶液攪拌1h →過濾→濾液中加入質(zhì)量分數(shù)10%氫氧化鈉溶液調(diào)至中性使殼聚糖析出→離心，沉淀洗至中性→干燥→殼聚糖純品

1.3.2 殼聚糖脫乙酰度的測定

采用紫外光譜法測定脫乙酰度，具體操作方法參見文獻[13]。

1.3.3 單因素試驗設(shè)計

取2g豐年蟲甲殼素放于150mL三角瓶中，按照1.3.1節(jié)工藝脫乙酰制備殼聚糖。選取乙醇浸泡時間、NaOH質(zhì)量分數(shù)、微波提取時間、微波功率為試驗因素，以脫乙酰度為試驗指標進行單因素試驗(基本條件為乙醇浸泡時間1h、NaOH質(zhì)量分數(shù)50%、微波提取時間20min、微波功率462W)。

1.3.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計

依據(jù)單因素試驗的結(jié)果，采用中心組合試驗設(shè)計，以脫乙酰度為響應(yīng)值，對微波提取時間、乙醇浸泡時間、NaOH質(zhì)量分數(shù)進一步優(yōu)化，因素水平見表1。

表1 中心組合試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of central composite design

2 結(jié)果與分析

2.1 不同因素對殼聚糖脫乙酰度的影響

2.1.1 乙醇浸泡時間

圖1 乙醇浸泡時間對殼聚糖脫乙酰度的影響Fig.1 Effect of ethanol soaking time on deacetylation degree of chitosan

由圖1可知，隨著乙醇浸泡時間的延長，甲殼素晶體束漸漸打開有利于堿滲入到甲殼素的內(nèi)部，與乙酰基發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)物的脫乙酰度值隨之變大，在1.5h時達到最大，再延長浸泡時間脫乙酰度值變化不大。試驗選擇乙醇浸泡時間為1.5h。

2.1.2 NaOH質(zhì)量分數(shù)

圖2 NaOH質(zhì)量分數(shù)對殼聚糖脫乙酰度的影響Fig.2 Effect of NaOH mass fraction on deacetylation degree of chitosan

由圖2可知，隨著堿液質(zhì)量分數(shù)的增大，脫乙酰度值逐漸升高，55%后上升不明顯。這是由于在堿液介質(zhì)中，OH－進攻酰氨基中的羰基，形成過渡態(tài)到C＝O雙鍵打開，是一個可逆過程，而過渡態(tài)上乙?；碾x去是瞬間的[14]。堿液質(zhì)量分數(shù)低時，脫乙?；磻?yīng)只在甲殼素表面進行，隨著堿液質(zhì)量分數(shù)增大，擴散到甲殼素內(nèi)部的OH－增多，但也造成脫落的乙酰基增多而影響擴散，這個復(fù)雜的過程有待于深入研究。試驗選擇NaOH質(zhì)量分數(shù)55%。

2.1.3 微波提取時間

圖3 微波時間對殼聚糖脫乙酰度的影響Fig.3 Effect of microwave treatment time on deacetylation degree of chitosan

由圖3可知，隨著微波時間的延長，脫乙酰度值增大，到25min時達到最大，之后變化緩和。微波對甲殼素脫乙酰反應(yīng)有一定的“非熱效應(yīng)”[15]，在加熱的同時，破壞了甲殼素分子鏈中的氫鍵，促進分子鏈分散和NaOH溶液滲入。微波處理10min時，由于微波加熱升溫快，甲殼素表面出現(xiàn)結(jié)塊，所以試驗中采取二次分段微波，即每10min時停止微波，將三角瓶振蕩至結(jié)塊被打散，制得脫乙酰度高的殼聚糖。試驗選擇微波提取時間25min。

2.1.4 微波功率

由圖4可知，脫乙酰度值的變化隨著功率的增大而不斷增大，理論上微波功率越大越好，但是在試驗中，功率太大，升溫太快而極易導(dǎo)致殼聚糖降解，故試驗中選取462W為最佳微波功率。

圖4 微波功率對殼聚糖脫乙酰度的影響Fig.4 Effect of microwave power on deacetylation degree of chitosan

2.2 微波輔助提取較高脫乙酰度殼聚糖工藝的響應(yīng)面分析

2.2.1 模型的建立與顯著性檢驗

表2 中心組合試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Central composite design scheme and results for response surface analysis

中心組合試驗設(shè)計與結(jié)果見表2，應(yīng)用Design Expert 7.0.0軟件對各因素進行多元回歸擬合分析，得回歸方程：

表3 響應(yīng)面試驗結(jié)果方差分析Table 3 Analysis of variances for the experimental results of central composite design

中心組合試驗方差分析結(jié)果見表3，對應(yīng)F表值[16]可知，整體模型P值為0.0004＜0.0001，該二次方程模型達到極顯著水平，可以應(yīng)用于工藝條件的優(yōu)化。失擬項P＝0.1627＞0.05，不顯著，說明擬合程度良好，未知因素對試驗結(jié)果干擾很小，說明該模型合適。各因素中NaOH質(zhì)量分數(shù)影響極顯著，乙醇浸泡時間影響顯著，微波時間影響不顯著，按照對脫乙酰度的影響排序：NaOH質(zhì)量分數(shù)＞乙醇浸泡時間＞微波時間。模型的決定系數(shù)R2為0.8821，說明該模型滿足88.21%的樣品空間。因此可以用該模型方程來分析和預(yù)測不同提取條件下殼聚糖的脫乙酰度值的變化。

根據(jù)回歸方程，做出響應(yīng)曲面圖(圖5)。從圖5a可以看出，當NaOH質(zhì)量分數(shù)一定時，在乙醇浸泡時間與微波時間的交互作用下存在一個脫乙酰度的最大值。當乙醇浸泡時間小于1.5h時，隨著微波時間的延長，殼聚糖脫乙酰度逐漸延長；當乙醇浸泡時間接近于最大值時，隨著微波時間的延長，殼聚糖脫乙酰度平緩的變化且有所下降，因為到反應(yīng)后期脫下來的乙?；鶗璧K甲殼素顆粒外部脫乙酰的速率。當微波時間一定時，脫乙酰度隨著乙醇浸泡時間的延長先升高后又降低，在大于1.92h時變化平緩，因為后來隨著乙醇的揮發(fā)會導(dǎo)致一部分甲殼素的氫鍵重新結(jié)合，使得堿液作用受阻，影響脫乙酰程度。

圖5 各兩因素交互作用對殼聚糖脫乙酰度影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plots showing the effects of pairwise interactions among different factors on deacetylation degree of chitosan

從圖5b可以看出，當乙醇浸泡時間一定時，NaOH質(zhì)量分數(shù)與微波時間的交互作用對脫乙酰度的影響。微波時間趨于最小值時，隨著NaOH質(zhì)量分數(shù)的增加，脫乙酰度呈現(xiàn)上升趨勢，且大于55%之后變化趨勢平緩；微波時間趨于最大值時，隨著NaOH質(zhì)量分數(shù)的增加，脫乙酰度呈現(xiàn)先上升后平緩下降趨勢，在55%達到最大值。NaOH質(zhì)量分數(shù)在一定范圍內(nèi)，殼聚糖的脫乙酰度在隨微波時間的延長而提高；當NaOH質(zhì)量分數(shù)大于59.21%時，隨微波時間的延長，殼聚糖的脫乙酰度逐漸趨于平緩，變化不明顯，影響不顯著。因為進入甲殼素的OH－是有限的，隨著微波時間延長，導(dǎo)致脫落下來的乙酰基內(nèi)外積累，影響反應(yīng)的進行。

從圖5c可以看出，當NaOH質(zhì)量分數(shù)一定時，殼聚糖的脫乙酰度隨著乙醇浸泡時間的升高，當浸泡時間大于1.5h時，增加趨于平緩。而當乙醇浸泡時間趨于最小值時，脫乙酰度隨著NaOH質(zhì)量分數(shù)增大而逐漸增加，即NaOH質(zhì)量分數(shù)越大，較優(yōu)的乙醇浸泡時間是越短的；當乙醇浸泡時間趨于最大值時，脫乙酰度隨著NaOH質(zhì)量分數(shù)增大而平緩降低。因為乙醇的揮發(fā)導(dǎo)致部分打破的氫鍵重新結(jié)合，不利于堿液作用，導(dǎo)致脫乙酰程度下降。

2.2.2 最佳工藝條件的確定與驗證實驗

通過Design Expert 7.0.0軟件在自變量范圍為[－1.682,1.682]內(nèi)，進行二次回歸模型的預(yù)測，得到2個最佳條件的方案，結(jié)合實際情況，選取微波輔助提取高脫乙酰度的殼聚糖的最佳工藝條件為微波提取時間33.41min、乙醇浸泡時間1.44h、堿液質(zhì)量分數(shù)57.27%，預(yù)測響應(yīng)值脫乙酰度為84.97%?？紤]操作的方便性，將提取工藝參數(shù)修正為微波提取時間33.4min、乙醇浸泡時間86min、堿液質(zhì)量分數(shù)57.27%，進行驗證實驗，分段微波處理，實際測得的脫乙酰度值84.12%，與理論值的偏差約為1.0%，說明響應(yīng)面法所得優(yōu)化提取工藝參數(shù)準確可靠。

3 結(jié) 論

在提取殼聚糖的過程中，各因素脫乙酰度的影響排序為：NaOH質(zhì)量分數(shù)＞乙醇浸泡時間＞微波時間。通過單因素試驗和應(yīng)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化微波提取較高脫乙酰度殼聚糖的工藝，得出最佳工藝條件為微波時間33.4min、乙醇浸泡時間86min、堿液質(zhì)量分數(shù)57.27%，在最適提取條件下脫乙酰度值可達到84.12%。并得到殼聚糖的脫乙酰度與各因素變量的二次方程模型，該模型回歸極顯著，對試驗擬合較好，經(jīng)檢驗證明該模型合理可靠，有一定實際應(yīng)用價值。

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Optimization of Extraction Process for Highly Deacetylated Chitosan from Chirocephalus diaphanous Eggshell by Response Surface Methodology

HUANG Xiao-yan，ZHANG Jian-xin*，WANG Xin，PENG Xin-hua，NIE Lu
(College of Food Science and Engineering, Northwest A＆F University, Yangling 712100, China)

One-factor-at-a-time method and response surface methodology were used to optimize the microwave-assisted extraction of highly deacetylated chitosan from Chirocephalus diaphanous eggshell. The optimal extraction conditions for achieving maximum degree of deacetylation of chitosan were as follows: microwave treatment time 33.4 min, ethanol soaking time 86 min, NaOH concentration 57.27%. Under these conditions, chitosan with a degree of deacetylation of 84.12% was obtained from Chirocephalus diaphanous eggshell.

chitosan；Chirocephalus diaphanous；response surface methodology；microwave；degree of deacetylation

TS245.9

A

1002-6630(2012)08-0085-04

2011-03-24

國家級大學(xué)生創(chuàng)新項目(2010A19)

黃曉燕(1985—)，女，碩士研究生，研究方向為食品營養(yǎng)與安全。E-mail：hxy4302040@163.com

*通信作者：張建新(1959—)，男，教授，碩士，研究方向為食品營養(yǎng)安全與標準化。E-mail：zhangjx59@foxmail.com