劉小會，淡松松，秦?zé)?，高學(xué)娟，劉朗夏

（暨南大學(xué)生命與健康工程研究院，廣州510632）

PCNA蛋白突變體的真核表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定＊

劉小會，淡松松，秦?zé)ǎ邔W(xué)娟△，劉朗夏

（暨南大學(xué)生命與健康工程研究院，廣州510632）

目的 構(gòu)建帶FLAG標(biāo)簽的細(xì)胞增殖核抗原（PCNA）蛋白Y211A、Y211D突變型重組質(zhì)粒，真核表達(dá)及鑒定。方法 以FLAG－PCNA野生型基因?yàn)槟０?，運(yùn)用PCR定點(diǎn)突變技術(shù)擴(kuò)增出帶突變位點(diǎn)的基因序列，將其插入真核表達(dá)載體pCMVN－FLAG，進(jìn)行雙酶切實(shí)驗(yàn)和測序驗(yàn)證。然后，利用脂質(zhì)體將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，Western blotting鑒定融合蛋白的表達(dá)。結(jié)果 FLAG－PCNA（Y211A）、FLAG－PCNA（Y211D）重組質(zhì)粒測序結(jié)果正確，獲得PCNA蛋白突變體。結(jié)論 成功構(gòu)建了帶FLAG標(biāo)簽的PCNA蛋白Y211A、Y211D真核表達(dá)載體，驗(yàn)證了突變型PCNA融合蛋白的表達(dá)，為PCNA蛋白功能的深入研究奠定了基礎(chǔ)。

PCNA蛋白；突變體；真核表達(dá)

細(xì)胞增殖核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）是一種在增殖細(xì)胞中合成或表達(dá)的核抗原，相對分子質(zhì)量約為36×103，是真核細(xì)胞DNA聚合酶δ的輔助因子，與DNA合成和細(xì)胞增殖相關(guān)，是近年來認(rèn)為更能有效評估腫瘤細(xì)胞增殖活性的重要標(biāo)志物，也是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一［1－3］。

許多文獻(xiàn)曾報道，表皮生長因子受體（epithelial growth factor receptor，EGFR）在細(xì)胞增殖與腫瘤分化中發(fā)揮著重要作用。Shao－Chun Wang博士報道EGFR可以磷酸化PCNA上的Y211位點(diǎn)，減少PCNA的降解，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖、參與DNA損傷修復(fù)［4－6］。本研究運(yùn)用PCR定點(diǎn)突變技術(shù)將211位酪氨酸堿基TAC分別突變成丙氨酸堿基GCC、天冬氨酸堿基GAC，以獲得突變型PCNA蛋白基因。將構(gòu)建的pCMV－NFLAG－PCNA Y211A和Y211D重組質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)染至293T真核細(xì)胞，對表達(dá)的融合蛋白進(jìn)行鑒定，為進(jìn)一步探討PCNA蛋白在腫瘤細(xì)胞中的生物學(xué)作用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備 凝膠掃描成像系統(tǒng)、垂直電泳槽、梯度PCR儀均購自美國Bio－Rad公司。

1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI，T4連接酶，DNA marker及PCR擴(kuò)增試劑盒均購自TaKaRa公司；質(zhì)粒小提、凝膠回收試劑盒購自天根生物技術(shù)公司。標(biāo)準(zhǔn)低分子量蛋白購自Pharmacia公司。PCR引物由英俊公司合成。GST融合蛋白純化樹脂購自GE Healthcare公司。轉(zhuǎn)染試劑GenEscortTMⅡ購自Wisegen公司。RIPA裂解液購自碧云天生物技術(shù)公司。FLAG一抗購自Sigma公司。鼠源二抗購自Biorule公司。

1.3 質(zhì)粒與菌株、細(xì)胞株 質(zhì)粒pCMV－N－FLAG－PCNA、真核表達(dá)載體pCMV－N－FLAG及大腸桿菌DH5α均為本實(shí)驗(yàn)室所保存。

1.4 方法

1.4.1 目的基因的獲得以及重組質(zhì)粒的構(gòu)建驗(yàn)證 根據(jù)GeneBank檢索到的PCNA基因序列，設(shè)計擴(kuò)增其全長序列的引物；根據(jù)pCMV－N－FLAG空載的多克隆位點(diǎn)圖譜，在引物的5′端引入限制性內(nèi)切酶BamHI，3′端引入限制性內(nèi)切酶XhoI識別序列；結(jié)合實(shí)驗(yàn)要求，設(shè)計帶突變堿基位點(diǎn)的引物，F(xiàn)LAGPCNA全長引物、突變體引物序列如表1所示。以pCMV－NFLAG－PCNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，先擴(kuò)增帶有突變位點(diǎn)的前、后兩端DNA序列，反應(yīng)條件為：94℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃延伸30s，30個循環(huán)，72℃5min，擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為633bp和153bp，用1%瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定及膠回收純化。然后，將前后兩段序列互為引物和模板，進(jìn)行拼接，反應(yīng)條件：94℃2min，94℃30s，60℃30s，72℃延伸30s，7個循環(huán)。緊接著，全長基因上、下游引物加入到反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：94℃ 30s，63.2℃ 30s，72℃延伸1min，30個循環(huán)，擴(kuò)增帶突變位點(diǎn)、786bp的全長基因，1%瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定及膠回收純化。隨后，將BamHI和XhoI雙酶切的PCR產(chǎn)物，插入到雙酶切處理后的pCMV－N－FLAG空載體中，進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，酶切驗(yàn)證后，送至上海英俊生物技術(shù)公司進(jìn)行測序。

表1 構(gòu)建FLAG－PCNA突變體重組質(zhì)粒的上下游引物設(shè)計

1.4.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 人胚腎T細(xì)胞293T細(xì)胞用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每2～3天傳代一次，用0.25%胰酶消化傳代。六孔板中，每孔接種5×105，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。野生型和突變型重組質(zhì)粒分別與轉(zhuǎn)染試劑GenEscortTMⅡ以2μg∶4μL比例，用DMEM稀釋混勻，室溫靜置孵育30min后，將復(fù)合物加之細(xì)胞中，4～6h后，更換成含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h。

1.4.3 細(xì)胞裂解及Western blotting鑒定表達(dá)蛋白 轉(zhuǎn)染收取的細(xì)胞用PBS清洗2～3次之后，用RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑）進(jìn)行裂解和BCA法蛋白濃度測定。取30μg蛋白進(jìn)行SDS－PAGE電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜后，用1×TBST洗膜3次，10分/次，5%脫脂奶粉室溫封閉1h。然后，用鼠源FLAG單克隆抗體（1∶2 000），4℃，孵育過夜。次日，1×TBST洗膜3次后，鼠二抗（1∶2 000）室溫孵育30min，經(jīng)1×TBST洗膜3次后，ECL曝光顯影。

2 結(jié) 果

2.1 目的基因片段的擴(kuò)增 利用PCR從模板質(zhì)粒pCMV－NFLAG－PCNA（Wt）上擴(kuò)增出帶突變位點(diǎn)的FLAG－PCNA Y211A和Y211D基因前、后兩段DNA序列，大小分別為633bp和153bp（圖1A）。隨后將其拼接，PCR擴(kuò)增出帶突變位點(diǎn)的全長基因序列，大小為786bp（圖1B），均與預(yù)期DNA片段大小相符。

圖1 FLAG－PCNA Y211A和Y211D基因的PCR結(jié)果

圖2 重組質(zhì)粒的DNA測序結(jié)果

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定 突變型重組質(zhì)粒連接轉(zhuǎn)化后，分別挑取3個單克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，質(zhì)粒提取后分別用BamHI和XhoI進(jìn)行雙酶切鑒定。瓊脂糖凝膠電泳可見大小786bp的目的條帶，表明目的基因已經(jīng)成功插入pCMV－N－FLAG載體中（圖1C、D）。比較DNA測序報告箭頭所指位點(diǎn)，表明211位的酪氨酸堿基TAC，已分別突變成丙氨酸（GCC，A）和天冬氨酸堿基（GAC，D）（圖2）。證明突變型FLAG－PCNA Y211A和Y211D質(zhì)粒已成功構(gòu)建。

圖3 Western blotting驗(yàn)證分析融合蛋白的表達(dá)

2.3 Western blotting鑒定融合蛋白 野生型和突變型重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過293T細(xì)胞，經(jīng)Western blotting用FALG抗體孵育驗(yàn)證后，發(fā)現(xiàn)突變型PCNA蛋白同野生型PCNA蛋白均可以正常表達(dá)，蛋白大小與預(yù)期相符，結(jié)果見圖3。

3 討 論

PCNA蛋白的異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，它幾乎存在于所有迅速增殖的細(xì)胞核中，它的出現(xiàn)明顯與細(xì)胞增殖有關(guān)，其在靜止細(xì)胞中含量很低，從G1末期開始增加，在S期達(dá)到高峰，是評價細(xì)胞增殖狀態(tài)的重要指標(biāo)，同時還是鑒別某些良性腫瘤和惡性腫瘤的指標(biāo)和預(yù)后評估指標(biāo)［3，7］。蛋白質(zhì)磷酸化修飾是PCNA半衰期調(diào)節(jié)的主要機(jī)制。文獻(xiàn)報道PCNA蛋白上的Y211磷酸化后，可顯著增強(qiáng)細(xì)胞增殖，降低乳腺癌等惡性腫瘤患者生存率［4－6］。本研究將211位的酪氨酸分別突變成天冬氨酸以模擬該位點(diǎn)的磷酸化，突變成為丙氨酸以阻斷該位點(diǎn)的磷酸化［8－11］，構(gòu)建 pCMV－N－FLAG－PCNA Y211A 和Y211D真核表達(dá)載體后，轉(zhuǎn)染至293T真核細(xì)胞并鑒定融合蛋白的表達(dá)，為進(jìn)一步研究PCNA的生理功能打下基礎(chǔ)。

在構(gòu)建Y211A、Y211D重組質(zhì)粒過程中，本研究采用了突變位點(diǎn)周圍序列重疊拼接的策略，分別構(gòu)建了突變位點(diǎn)前段和后段的DNA序列，隨后利用PCR、兩端DNA序列互為模板引物進(jìn)行拼接。為了保證突變目的基因產(chǎn)物能夠有效擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)前作者利用全長基因的引物，設(shè)置了梯度PCR反應(yīng)，找到了63.2℃反應(yīng)效率相對較高的退火溫度。

293T細(xì)胞因具備理想的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，所以是蛋白表達(dá)和功能研究中常用到的細(xì)胞株。同一張膜上，經(jīng)DAB底物顯色后，相對于內(nèi)參β－actin，作者發(fā)現(xiàn)目的蛋白有較高的表達(dá)量。文獻(xiàn)中報道，作者利用蛋白合成抑制劑處理、結(jié)合Y211F突變體發(fā)現(xiàn)，Y211位點(diǎn)的磷酸化有助于PCNA蛋白的降解，在初步的蛋白表達(dá)中尚未看到明顯的變化；再者，由于PCNA在細(xì)胞中存在DNA結(jié)合和游離兩種形式，而DNA結(jié)合形式不易被分離，同內(nèi)源PCNA蛋白的影響調(diào)節(jié)有可能是造成這種變化不明顯的原因［12－15］。

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Construction and identification of eukaryotic expression vector for mutant PCNA＊

Liu Xiaohui，Dan Songsong，Qin Huanhuan，Gao Xuejuan△，Liu Langxia
（Institutes of Life and Health Engineering，Ji′nan University，Guangzhou，Guangdong510632，China）

Objective To construct and express FLAG－PCNA gene mutant in 293Tcells.Methods Mutant FLAG－PCNA cDNA was amplified by PCR site－directed mutagenesis with FLAG－PCNA gene as template，and inserted into the eukaryotic expression vector pCMV－N－FLAG.The recombinant vector was then transfected into human embryonic kidney（HEK）293Tcells.The cells were harvested after 48hto identify the expression of plasmids by western blot.Results Sequences of recombinant plasmid were correct，and the mutants of PCNA were obtained.Conclusion Eukaryotic plasmids of mutant PCNA were obtained，and the expression of mutant PCNA protein was identified，which lay a foundation for further research of PCNA protein.

PCNA；mutant；eukaryotic expression

10.3969/j.issn.1671－8348.2012.12.019

A

1671－8348（2012）12－1194－03

國家973重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃資助項目（2011CB910701）；國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金資助項目（31000628）；暨南大學(xué)引進(jìn)優(yōu)秀人才科研啟動基金資助項目（50624001）；廣東省高等學(xué)校高層次人才資助項目（50524006）?！?/p>

，E－mail：tgaoxj@jnu.edu.cn。

2011－12－12

2012－01－09）