黃天明，趙飛蘭，莫發(fā)榮，晁耐霞，謝小薰，羅國容

（廣西醫(yī)科大學(xué) 組 織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，廣西 南 寧530021）

本課題組應(yīng)用SEREX（serological analysis of recombinant cDNA expression libraries）技術(shù)，從廣西人肝細(xì)胞癌（HCC）的cDNA文庫中篩選出一系列 HCC相關(guān)的抗原基因［1，2］，其中編號(hào)為 HCC－27－9－3的基因序列與kinectin的N末端同源，且初步檢測表明，其抗體在HCC病人中有較高的特異性和陽性率［3］。本研究在對此kinectin基因進(jìn)行了體外重組、克隆及表達(dá)的基礎(chǔ)上［4］對其誘導(dǎo)及純化條件進(jìn)行了優(yōu)化，并檢測了所得MBP－kinectin融合蛋白致敏DC及刺激自體T淋巴細(xì)胞增殖的能力，為其開發(fā)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 HCC－27－9－3重組噬菌粒為本室自存；大腸桿菌DH5α和 TB1，質(zhì)粒p MAL－C2，Amylose resin親和層析柱，RPMI1640培養(yǎng)液，胎牛血清（FCS），F(xiàn)icoll分離液（1.077 g／ml），T細(xì)胞尼龍毛柱，脂多糖（LPS），重組人rhGM－CSF、rhIL－4、IL－12、IFN－γ，ELISA檢測試劑盒，MTT，IPTG，X－gal，Taq酶，d NTP，Bam HI，HindIII，XmnI，T4DNA 連接酶，DNA marker，PEG8000，小分子量膠回收試劑盒，其余化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純；SDS－PAGE由3%濃縮膠和12%分離膠組成，蛋白定量分析用BIO－RAD公司的Quantity One凝膠分析軟件，引物均由上海生工合成，蛋白的飛行質(zhì)譜測序分析送復(fù)旦大學(xué)進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 用PCR擴(kuò)增HCC－27－9－3重組噬菌粒中的kinectin目的基因片斷并將其插入p MAL－C2載體質(zhì)粒中，先轉(zhuǎn)入DH5α菌，經(jīng)藍(lán)白斑實(shí)驗(yàn)、PCR法、酶切法及DNA測序篩選出正確的重組子后，再轉(zhuǎn)入TB1表達(dá)宿主菌。

1.2.2 目的基因在宿主菌中的誘導(dǎo)表達(dá) 將轉(zhuǎn)有正確重組質(zhì)粒的TB1工程菌置于LB－Amp＋板中培養(yǎng)過夜后，挑單克隆至3 ml LB－Amp＋培養(yǎng)液中，37℃恒溫振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4，取1 ml留作誘導(dǎo)前對照，余加入IPTG至終濃度0.5 mmol／L，繼續(xù)誘導(dǎo)3個(gè)小時(shí)，8 000 r／min離心10 min，棄上清，收集菌體，每克菌體沉淀加入15 ml過柱緩沖液，置冰浴中，超聲波破菌3個(gè)周期（每個(gè)周期20次，每次3 s，間歇4 s），4℃12 000 r／min離心30 min，分別收集上清液及沉淀，SDS－PAGE電泳鑒定。

1.2.3 誘導(dǎo)條件的優(yōu)化 將上述的單克隆培養(yǎng)液37℃振蕩培養(yǎng)過夜后，按1∶100比例分別轉(zhuǎn)種到含10 ml LB－Amp＋培養(yǎng)液的大離心管中，分別按以下方法依次對誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化。（1）37℃分別培養(yǎng)1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h后，加入終濃度1 mmol／L的IPTG，轉(zhuǎn)至37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h；（2）37℃培養(yǎng)2 h后（前面實(shí)驗(yàn)表明此為較佳IPTG加入時(shí)機(jī)），加入終濃度為1 mmol／L的IPTG，分別在37℃、34℃和30℃繼續(xù)誘導(dǎo)3個(gè)h；（3）37℃培養(yǎng)2 h后，加入終濃度為1 mmol／L的IPTG，將溫度降至34℃（前面實(shí)驗(yàn)表明此為較佳誘導(dǎo)溫度），分別繼續(xù)誘導(dǎo)1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h；（4）37℃培養(yǎng)2 h后，分別加入IPTG至終濃度0.2、0.5、0.8、1.0、2.0和3.0 mmol／L。隨后降低溫度至34℃繼續(xù)培養(yǎng)3 h（前面實(shí)驗(yàn)表明此為較佳誘導(dǎo)時(shí)間）。收集上述誘導(dǎo)產(chǎn)物并超聲破菌后，取上清和（或）沉淀分別走12%SDS－PAGE電泳，Quantity one軟件進(jìn)行定量分析比較。

1.2.4 融合蛋白的分離純化 方法按New England Biolabs公司的說明書進(jìn)行。然而我們發(fā)現(xiàn)，這種方法獲得的融合蛋白含有較多的雜帶，估計(jì)為蛋白質(zhì)降解的產(chǎn)物。為此，我們對誘導(dǎo)及純化條件進(jìn)行了改進(jìn)，以抑制細(xì)菌蛋白酶的水解作用。具體如下：誘導(dǎo)時(shí)在培養(yǎng)液中加入0.2%的葡萄糖，破菌時(shí)加入1 mmol／L的PMSF，在冰浴中破菌，在4℃的環(huán)境中過柱洗脫。

最后將收集的蛋白洗脫液用SDS－PAGE電泳鑒定，并送測序。所得融合蛋白保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 DC的制備與致敏 取健康人外周血50 ml并常規(guī)法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），用RPMI1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，吸出未貼壁細(xì)胞（供分離T淋巴細(xì)胞用），留下貼壁細(xì)胞，加入含100 ng／ml rh GM－CSF、50 ng／ml rhIL－4 及 10%FCS 的 RPMI1640 培養(yǎng)液，隔日半對量換液，同時(shí)加細(xì)胞因子（首次濃度的1／2），收集培養(yǎng)7 d的細(xì)胞，用光鏡及電鏡進(jìn)行鑒定。將所得DC分為3組，分別加入20 mg的MBP－kinectin和20 mg的MBP蛋白共培養(yǎng)，還有一組為空白對照。培養(yǎng)3 d后收集各組上清液，按試劑盒說明書用ELISA方法檢測IL－12和IFN－γ含量。

1.2.6 自體T淋巴細(xì)胞增殖能力觀察 上述吸出的未貼壁細(xì)胞過T細(xì)胞尼龍毛柱后即得純化的T淋巴細(xì)胞。將細(xì)胞稀釋為1×105／ml，并分為3組，加入96孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，均設(shè)空白對照孔，然后分別加入上述的3組DC共孵育，每孔總量為200 μl。37℃、5%CO2培養(yǎng)96 h后每孔加入 MTT 20 μl，培養(yǎng)4 h，離心棄上清，加入DMSO 150μl／孔，輕微振蕩，10 min后檢測各孔光密度（OD）值。T淋巴細(xì)胞增殖能力以刺激指數(shù)（SI）表示，SI＝實(shí)驗(yàn)孔OD值／空白對照孔OD值。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0軟件，組間比較用方差分析，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)藍(lán)白斑實(shí)驗(yàn)、PCR鑒定及酶切鑒定后，送基因測序，結(jié)果表明，所插入目的基因序列及讀碼框架完全正確。

2.2 目的基因在宿主菌中的誘導(dǎo)表達(dá) 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入 TB1宿主菌，并經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，SDSPAGE電泳顯示，在66.2 k Da marker下方可見一誘導(dǎo)條帶（圖1），而未誘導(dǎo)的對照則未見有此條帶。

Quantity one凝膠分析軟件分析結(jié)果提示，目的蛋白分子量約為62.374 k Da，與 MBP－Kinectin理論分子量的61 k Da大致相符（圖2）。目的蛋白約占菌體蛋白總量的12.9%（圖3）。

2.3 誘導(dǎo)條件的優(yōu)化 不同時(shí)機(jī)加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)的產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖4。圖中，A為marker，B、C、D、E、F、G、H 分別為第1、2、3、4、5、6、7個(gè)小時(shí)后加入IPTG誘導(dǎo)的產(chǎn)物，I為DH5α工程菌于第2個(gè)小時(shí)加入IPTG誘導(dǎo)的對照，J為空白TB1菌于第2個(gè)小時(shí)加入IPTG誘導(dǎo)的對照。由圖可見，TB1工程菌在37℃振蕩培養(yǎng)兩個(gè)小時(shí)后加入IPTG，誘導(dǎo)效果較好。經(jīng)OD值檢測，此時(shí)細(xì)菌的OD值約為0.4左右。

34℃條件下，誘導(dǎo)時(shí)間長短與目的蛋白表達(dá)百分含量的關(guān)系如圖5所示。由圖可見，在誘導(dǎo)的前3個(gè)小時(shí)，可溶性目的蛋白的百分含量并無顯著差異，但隨后則會(huì)急劇下降。

圖1 誘導(dǎo)與未誘導(dǎo)產(chǎn)物的比較

圖2 目的蛋白的分子量 估算

圖3 目的蛋白條帶的光密度 分析

圖4 不同時(shí)間加入IPTG誘導(dǎo) 的產(chǎn)物電泳圖

目的蛋白表達(dá)百分含量與IPTG濃度的關(guān)系如圖6所示。由圖可見，當(dāng)IPTG濃度在0.2－3.0 mmol／L之間變化時(shí)，可溶性目的蛋白的百分含量隨IPTG濃度變化的改變并不是很明顯。

2.4 融合蛋白的分離純化 按說明書方法將上清液過柱純化后，SDS－PAGE電泳結(jié)果如圖7（左）所示：圖中 A為 marker；B、C、D、E、F、G、H、I分別為第1、2、3、4、5、6、7、8管蛋白洗脫收集液；J為過柱穿透液；。由圖可見，在目的條帶的周圍出現(xiàn)了較多的雜帶。這些雜帶蛋白的分子量主要介于36.0 k Da－66.2 k Da之間（即大致介于 MBP與 MBPKinectin之間），圖7（右）為經(jīng)過方法改良后收集的過柱洗脫液電泳圖，圖中A為marker，B為過柱穿透液，C、D、E、F、G、H 分別為第3、4、5、6、7管蛋白洗脫收集液。由圖可見，蛋白雜帶較前明顯減少了。

將純化后的融合蛋白送質(zhì)譜測序分析，結(jié)果表明：1）重組蛋白的氨基酸序列完全正確；2）純化產(chǎn)物中存在有一些融合蛋白的降解片斷。

2.5 各組上清液中IL－12和IFN－γ含量的比較經(jīng)共孵化后，各組上清液中IL－12和IFN－γ的含量分別為：MBP－kinectin組：（615.32±7.93）pg／ml、（544.28±7.17）pg／ml；MBP 組：（382.13±5.21）pg／ml、（308.46±6.44）pg／ml；空白對照組：（299.40±10.22）pg／ml、（228.03±6.70）pg／ml。MBP－kinectin組均高于MBP組和空白對照組，且三組相比，P均＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.6 各組T淋巴細(xì)胞增殖能力比較 MBP－kinectin組SI為53.14±0.62，MBP組為22.14±0.31，對照組為10.86±0.65。MBP－kinectin組高于MBP組和空白對照組，且三組相比，P均＜0.001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

kinectin是一種與囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的膜受體蛋白，其最早發(fā)現(xiàn)定位于雞胚腦細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，主要參與了細(xì)胞內(nèi)囊泡的轉(zhuǎn)運(yùn)［5］。后來，kinectin還陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)與一些細(xì)胞內(nèi)的功能及信號(hào)蛋白相關(guān)，如整合素、Rho家族蛋白、EF1復(fù)合體等。這些蛋白在細(xì)胞的分裂、分化及骨架構(gòu)建中都發(fā)揮著極其重要的作用，可能與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)［6－8］。本課題組羅國容等［2］用SEREX技術(shù)在肝癌患者血清中檢測到了抗kinectin抗體。前期研究表明，其在肝癌患者中有較高的特異性和陽性率，提示，kinectin有可能用于對肝癌的免疫治療。用基因工程方法獲取大量的kinectin蛋白是對其進(jìn)行深入研究的前提和基礎(chǔ)。

圖5 誘導(dǎo)時(shí)間和目的蛋白表達(dá)

圖6 IPTG濃度和蛋白表達(dá)百分 含量的關(guān)系圖

圖7 過柱洗脫收集液電泳圖

p MAL－C2載體系統(tǒng)是一種較好的抗原蛋白表達(dá)體系，影響重組質(zhì)粒表達(dá)的因素有以下幾方面［9］：1）溫度是進(jìn)行重組蛋白表達(dá)的基本平臺(tái)，其主要通過影響蛋白質(zhì)的合成速度、包涵體的形成概率及細(xì)菌蛋白酶對目的蛋白的水解活性來影響誘導(dǎo)效果。適宜的溫度應(yīng)兼顧蛋白的產(chǎn)量及可溶性蛋白的比例。本實(shí)驗(yàn)中，工程菌在34℃誘導(dǎo)時(shí)的目的蛋白產(chǎn)量較高；且34℃誘導(dǎo)時(shí)，可溶性目的蛋白含量可達(dá)菌體可溶性蛋白總量的17.8%，也遠(yuǎn)高于37℃時(shí)的13.3%。2）誘導(dǎo)時(shí)間長短也是影響重組蛋白表達(dá)的一個(gè)重要因素。誘導(dǎo)時(shí)間過短，蛋白表達(dá)量較少；但如果時(shí)間過長，則蛋白可能會(huì)被細(xì)菌蛋白酶降解。本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)工程菌誘導(dǎo)1－3 h時(shí)，目的蛋白表達(dá)的百分含量無顯著差異，但考慮到誘導(dǎo)時(shí)間較長時(shí)，菌體蛋白的總表達(dá)量會(huì)增多，目的蛋白的絕對量也較多，故選取3 h為較理想的誘導(dǎo)時(shí)間。3）IPTG的濃度對目的蛋白產(chǎn)量的影響也很大。IPTG濃度過低，可能會(huì)使誘導(dǎo)效應(yīng)降低；但其濃度過高，則可能會(huì)對宿主菌產(chǎn)生強(qiáng)烈的毒性作用而抑制細(xì)菌的生長繁殖，從而使蛋白產(chǎn)量降低。然而本實(shí)驗(yàn)中：當(dāng)IPTG濃度在0.2－3.0 mmol／L之間變化時(shí)，目的蛋白的百分含量并無明顯差異，但通過加測菌液的OD值發(fā)現(xiàn)，當(dāng)IPTG濃度為0.5 mmol／L時(shí)，OD值最高，可達(dá)1.6左右。從經(jīng)濟(jì)角度出發(fā)，并考慮蛋白的總產(chǎn)量，選用0.5 mmol／L濃度的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)似為最妥。4）IPTG的加入時(shí)機(jī)是影響蛋白表達(dá)的另一個(gè)重要因素。在液體培養(yǎng)基中，細(xì)菌的生長通常包括遲緩期、對數(shù)生長期、穩(wěn)定期和衰亡期四個(gè)階段。在對數(shù)生長期時(shí)，細(xì)菌的OD值通常為0.3－0.6，此時(shí)細(xì)菌的生長最活躍，蛋白的合成速度也最快；此時(shí)加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，效果最好。本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)TB1菌37℃振蕩培養(yǎng)2個(gè)小時(shí)后，其OD值為0.4左右，約相當(dāng)于對數(shù)生長初期，此時(shí)加入IPTG誘導(dǎo)即可獲得較高誘導(dǎo)表達(dá)效率。

經(jīng)純化后的蛋白，會(huì)出現(xiàn)一些雜帶。通過分析，我們認(rèn)為，雜帶蛋白可能是MBP－kinectin融合蛋白的kinectin部分發(fā)生了降解（MBP蛋白非常穩(wěn)定，不易降解），從而產(chǎn)生的分子量介于MBP和MBP－kinectin之間的降解產(chǎn)物。用獲得的MBP－kinectin融合蛋白與DC共培養(yǎng)，可使DC產(chǎn)生較高水平的IL－12和IFN－γ，而IL－12是促進(jìn)Th1分化最主要的細(xì)胞因子。用MTT法檢測T淋巴細(xì)胞的增殖情況也證實(shí)，用MBP－kinectin致敏的DC確實(shí)能有效的刺激T淋巴細(xì)胞的增殖。這也為我們在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用MBP－kinectin致敏DC誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞進(jìn)行殺傷提供了可靠的理論依據(jù)。

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