邱心如，周洪瀾，李亞娟，張麗紅，翟穎仙，王醫(yī)術(shù)＊

（1.吉林大學(xué)a.藥學(xué)院2009級；b.第一醫(yī)院；c.病理生物學(xué)教育部重點實驗室，吉林 長春130021；2.四平市中心人民醫(yī)院）

唾液腺腺樣囊性癌 （salivary adenoid cystic carcinoma，SACC）是最常見的唾液腺惡性腫瘤之一，大約占唾液腺惡性腫瘤的20%［1］。近年來，槲寄生Viscum Coloratum（Kom.）Nakai的抗癌作用受到國內(nèi)外醫(yī)藥學(xué)界的極大重視。在亞洲，韓國對槲寄生抗癌作用的研究較多，他們主要提取槲寄生的外源凝集素（Lectins）作抗癌研究［2，3］。在我國，早在1994年王慶瑞等人就曾經(jīng)報道，槲寄生的總生物堿具有較強的抗腫瘤作用，是槲寄生中有效的抗腫瘤成分之一［4］。Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中起著非常重要的作用［5，6］?；诖?，本實驗主要研究槲寄生堿作用ACC細(xì)胞后，Caspase家族中關(guān)鍵因子Caspase8的表達(dá)情況。

1 材料和方法

1.1 材料

藥物及試劑：槲寄生堿粉末由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥化實驗室制備；新生牛血清購于TBD公司；RPMI1640培養(yǎng)液、胰蛋白酶購于美國Gibco公司；5－氟尿嘧啶購自天津金耀氨基酸公司；ACC細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。Caspases8多克隆抗體購于Cell Signaling公司。

1.2 方法

1.2.1 槲寄生堿的配制 根據(jù)文獻(xiàn)采用稀鹽酸浸提法［1］提取，用 NaOH 將pH 值調(diào)至6.5左右，制成槲寄生堿溶液，濃度為1mg／ml。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) ACC細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FCS的RPMI1640培養(yǎng)液中，培育在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，達(dá)到對數(shù)生長期后，進(jìn)行實驗分組：①對照組：未用槲寄生堿處理的正常生長細(xì)胞；②陽性對照組：采用5-FU處理ACC細(xì)胞；③實驗組：采用槲寄生堿（2.24μg／ml）處理 ACC細(xì)胞。

1.2.3 細(xì)胞爬片 加藥后立即將細(xì)胞（5×104／ml）接種于已經(jīng)鋪好蓋玻片的24孔板內(nèi)，37℃、5%CO2培養(yǎng)24小時后0.1%PBS沖洗，10%中性福爾馬林固定，于－20℃冷藏備用。

1.2.4 caspase8活性的檢測 免疫組織化學(xué)染色采用SP法。

2 結(jié)果

2.1 Caspase8的表達(dá)情況

Caspase8免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，槲寄生堿作用組ACC細(xì)胞胞漿有棕黃色顆粒，呈陽性表達(dá)，并且隨著堿濃度的升高，表達(dá)增強。陽性率高于5-FU組（P＜0.001），未加藥組細(xì)胞胞漿無明顯棕黃色反應(yīng)物（P＜0.001）（結(jié)果見表1，圖1）。

表1 ACC細(xì)胞Caspase8表達(dá)的IOD值（±s）

表1 ACC細(xì)胞Caspase8表達(dá)的IOD值（±s）

各組間比較P＜0.001

組別 劑量（μg／ml） IOD值－ 168818.2±11592.21槲寄生堿組 2.24 723574.7±8007.34 5-FU 組未加藥組111.90 664603.9±8540.64

圖1 ACC細(xì)胞Caspase8的表達(dá)（100×）

3 討論

細(xì)胞的凋亡涉及到一系列基因的激活、表達(dá)及調(diào)控，其過程大體上可以分為三個階段［7］：接受凋亡相關(guān)信號→整合信號，凋亡調(diào)控分子間相互作用→蛋白水解酶（Caspase）激活，進(jìn)入不可逆的連續(xù)反應(yīng)過程。在不同的凋亡途徑當(dāng)中，天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶（cysteinylaspartate specific protease，Caspase）發(fā)揮了關(guān)鍵性作用［8］。文獻(xiàn)顯示，在死亡受體途徑中，細(xì)胞膜上的Fas被激活后，將凋亡信號傳導(dǎo)入胞內(nèi)，自身形成三聚體，通過DD（death domain，死亡結(jié)構(gòu)域）與FADD（Fas associated protein with death domain，F(xiàn)as相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白）結(jié)合，而FADD中含有的 DED（death effected domain，死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域）是Caspase8中CARD（Caspase activation and recruitment domai，Caspase激活募集結(jié)構(gòu)域）的一種，從而使procaspase8自身水解活化，進(jìn)一步去激活Caspase3來促進(jìn)細(xì)胞的凋亡［9］。誘導(dǎo)Caspase8才能實現(xiàn)其凋亡過程。李鋼琴等人在實驗中證實丹皮酚即是通過上調(diào)Fas、Caspase8的表達(dá)來誘導(dǎo)大腸癌HT－29細(xì)胞的凋亡［10］。韓陽等人亦在實驗中證實Caspase8在死亡受體途徑中第一步被激活，進(jìn)而活化下游的Caspase來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［11］。

基于此，本實驗研究的目的是槲寄生堿作用SACC后觀察caspase8表達(dá)情況，結(jié)果顯示Caspase8免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，槲寄生堿作用組ACC細(xì)胞胞漿有棕黃色顆粒，呈陽性表達(dá)，并且隨著堿濃度的升高，表達(dá)增強。陽性率高于5-FU組（P＜0.001），未加藥組細(xì)胞胞漿無明顯棕黃色反應(yīng)物（P＜0.001）。因此，可以認(rèn)為槲寄生堿通過Caspase8誘導(dǎo)ACC細(xì)胞凋亡，槲寄生堿有可能成為一種治療腺樣囊性癌的有效藥物，它的研制與開發(fā)利用，將為人類攻克腫瘤這一頑疾開辟一條新的道路。

［1］Spiro RH.Salivary neoplasms：Overview of a 35-year experience with 2 807patients［J］.Head Neck Surg，1986，8（3）：177.

［2］Taek Joon Yoon，Yung Choon Yoo，Tae Bong Kang，et al.Lectins isolated from Korean mistletoe（Viscum album coloratum）induce apoptosis in tumor cells［J］.Cancer Letters，1999（136）：33.

［3］Taek Joon Yoon，Yung Choon Yoo，Tae Bong Kang，et al.Cellular and humoral adjuvant activity of lectins isolated from Korean mistletoe（Viscum album colaratum）［J］.International Immunopharmacology，1（2001）：881.

［4］王慶端，劉梅筠，王東陽.槲寄生總生物堿的抗腫瘤作用［J］.中國中藥雜志，1994，19（1）：46.

［5］Shintani M，Sangawa A，Yamao N，et al.Immunohistochemical analysis of cell death pathways in gastrointestinal adenocarcinoma［J］.Biomed Res，2011，32（6）：379.

［6］Fang Xiaoyang，Sheng Wei.Studies on Chinese materia medica inducing tumor cells apoptosis［J］.中草藥，2004，4（34）：472.

［7］Eastman A，Rigas JR.Modulation of apoptosis signaling pathways and cell cycle regulation［J］.Semin Oncol，1999，5：7.

［8］Bratton SB，MacFarlane M，Cain K.Protein complexes activate distinct caspase cascades in death receptor and stress-induced apoptosis［J］.Exp Cell Res，2000，256：27.

［9］趙 丹.FADD研究進(jìn)展［J］.國際免疫學(xué)雜志，2006，29（3）：152.

［10］李鋼琴，譚詩云，劉長青，等.Fas／FasL、bcl 2、caspase 8在丹皮酚誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞凋亡中的相互作用及機(jī)制［J］.胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2006，15（2）：194.

［11］韓 陽，官大威，侯震寰，等.caspase-8及其研究進(jìn)展［J］.中國法醫(yī)學(xué)雜志，2006，21（2）：94.