曹 劍，王永安，魏 壯，劉浩宇，尹維田

（1.赤峰市醫(yī)院，內(nèi)蒙古 赤峰024000；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院）

本文對(duì)坐骨神經(jīng)損傷BALB／c小鼠應(yīng)用苦參堿，通過(guò)對(duì)坐骨神經(jīng)相應(yīng)脊髓節(jié)段gap-43的測(cè)定和神經(jīng)LFB染色的觀(guān)察，探討苦參堿對(duì)周?chē)窠?jīng)損傷后的修復(fù)和再生方面的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

健康成年雄性BALB／c小鼠160只（體重25±2g，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）單側(cè)坐骨神經(jīng)離斷后，常溫飼養(yǎng)，普通飲食，自由飲水。隨機(jī)分為生理鹽水空白對(duì)照組、高劑量給藥組、中劑量給藥組和低劑量給藥組，其中實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物又根據(jù)術(shù)后存活時(shí)間隨機(jī)分為12h，24h，3d，5d、7d、2 w，4w，8w組，以上各組每組10只動(dòng)物。

1.2 動(dòng)物模型制備

坐骨神經(jīng)損傷模型的制作：BALB／c小鼠經(jīng)1%硫噴妥鈉100mg／kg腹腔麻醉，俯臥位固定，無(wú)菌條件下單側(cè)下肢股后部縱切口約2cm，梨狀肌下暴露坐骨神經(jīng)，用玻璃分針鈍性小心分離坐骨神經(jīng)主干和周?chē)M織，在坐骨結(jié)節(jié)下0.5cm處完全離斷坐骨神經(jīng)，以11／0顯微縫線(xiàn)12倍顯微鏡下吻合坐骨神經(jīng)，分層縫合肌肉和皮膚。

1.3 給藥方法和劑量

采取灌胃方法給藥。參照臨床應(yīng)用苦參堿原藥劑量，等效換算為腹腔注射用劑量［1］，將此數(shù)值作為給藥的中等劑量，并以等比數(shù)列量確定高低劑量組用量。最終各組給藥量為，高劑量組10mg／kg／d，中劑量組5mg／kg／d，低劑量組2.5mg／kg／d，取相應(yīng)劑苦參堿以生理鹽水溶解后腹腔注射。對(duì)照組給予同等體積生理鹽水。連續(xù)給藥至處死。

1.5 取材及標(biāo)本制備

取每組動(dòng)物5只分別在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)用1%硫噴妥鈉100mg／kg腹腔麻醉后，采用脊柱后方正中切口咬骨鉗咬開(kāi)椎管，切取損傷側(cè)L4－L6段的脊髓，標(biāo)記后迅速浸置于液氮中備用。

取每組另外5只在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)切取坐骨神經(jīng)自吻合口（包括吻合口在內(nèi)）向遠(yuǎn)端0.6－0.7cm神經(jīng)干，10%中性甲醛固定標(biāo)本72小時(shí)以上，經(jīng)酒精逐級(jí)脫水后石蠟包埋。

1.6 檢測(cè)方法

1.6.1 Real-time PCR 法檢測(cè) 首先進(jìn)行引物的合成，用 Beacon designer 7軟件設(shè)計(jì) gap-43、以GAPDH為引物（表1），經(jīng)檢索Blast驗(yàn)證特異性。分別取各時(shí)間點(diǎn)的L4－6脊髓節(jié)段組織，采用Trizol試劑提取總RNA，以提取的總RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄制備cDNA庫(kù)。以cDNA庫(kù)為模板，PCR擴(kuò)增L4－6脊髓節(jié)段組織的gap-43，每個(gè)反應(yīng)體系中均加入GAPDH的一對(duì)引物作為PCR擴(kuò)增的內(nèi)參，反應(yīng)條件：95℃30s－58℃60s－72℃60s40個(gè)循環(huán)。

1.6.2 髓鞘固蘭染色 切取坐骨神經(jīng)自吻合口（包括吻合口在內(nèi)）向遠(yuǎn)端0.6－0.7cm神經(jīng)干，10%中性甲醛固定標(biāo)本72小時(shí)以上，經(jīng)酒精逐級(jí)脫水后石蠟包埋，制片行HE染色。觀(guān)察神經(jīng)的基本結(jié)構(gòu)及有無(wú)細(xì)胞增生、炎細(xì)胞浸潤(rùn)等改變，初步篩選特染對(duì)象。切片脫蠟后，用LFB液60℃浸泡12小時(shí)；95%酒精浸泡5min；加入0.05%碳酸鋰15s；而后70%酒精洗滌完畢蒸餾水洗滌，脫水透明封片。

表1 Beacon designer 7軟件設(shè)計(jì)GAP43、GAPDH引物

2 結(jié)果

2.1 Realtime-PCR分析結(jié)果

Gap-43mRNA在正常大鼠坐骨神經(jīng)組織少量表達(dá)，當(dāng)坐骨神經(jīng)損傷后，相應(yīng)脊髓節(jié)段組織gap－43mRNA的含量上升，從損傷后12h開(kāi)始到5d呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，各組間差異性明顯，其中高中劑量組的增多量明顯低于低劑量和對(duì)照組。見(jiàn)圖1。2w后gap-43在高中劑量組呈持續(xù)表達(dá)。其中，中劑量組明顯促進(jìn)了gap-43的表達(dá)。

圖1 各時(shí)間點(diǎn)gap-43的mRNA表達(dá)

2.2 LFB染色結(jié)果

LFB染色后，髓鞘呈天藍(lán)色，軸突不著色，背景為白色。術(shù)后8周染色結(jié)果見(jiàn)圖2。高、中劑量組髓鞘形狀規(guī)則，厚度較為均一，輪廓明顯且周邊纖維組織增生不明顯；低劑量組髓鞘形狀及厚度較不規(guī)則，但輪廓尚明顯，束間可見(jiàn)纖維結(jié)締組織增生；對(duì)照組鞘形狀更加不規(guī)則，纖維結(jié)締組織增生明顯。

圖2 造模后各劑量組髓鞘固藍(lán)染色結(jié)果

綜合以上兩組指標(biāo)的檢測(cè)，不同時(shí)相小鼠L4－6脊髓節(jié)段組織中g(shù)ap-43mRNA的變化，以及髓鞘LFB染色的趨勢(shì)具有一致性。

3 討論

苦參堿是廣泛存在于豆科植物苦參（sophora flavescents Ait）、苦豆子（S.alopecuroides L）及廣豆根（S.subprostrate chunet T.Chenk）等中草藥中的有效成份。近年來(lái)對(duì)苦參堿的研究較為廣泛，它的化學(xué)式為C15H24N20，屬于四環(huán)的喹嗪啶類(lèi)，分子骨架可看作2個(gè)喹嗪啶環(huán)的雜體?？鄥A具有多種藥理作用，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)可引發(fā)中樞神經(jīng)麻痹，可防治腦水腫和鎮(zhèn)靜、降溫作用；對(duì)心血管系統(tǒng)，可增強(qiáng)心肌收縮力，抗心律失常、抗動(dòng)脈粥樣硬化；對(duì)消化系統(tǒng)，可防治肝炎、抗肝纖維化，利膽、止瀉，保護(hù)胃腸黏膜；對(duì)呼吸系統(tǒng)，具有祛痰平喘作用。此外，還有抗病毒、抗寄生蟲(chóng)、抗炎、免疫調(diào)節(jié)及抗瘢痕形成等作用［2－4］。而對(duì)其促進(jìn)神經(jīng)損傷后修復(fù)的研究較少。生長(zhǎng)相關(guān)蛋白gap-43是一種胞膜磷酸蛋白質(zhì)，是膜快速轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，與神經(jīng)元生長(zhǎng)發(fā)育、突觸形成及神經(jīng)可塑性密切相關(guān)［5］。在膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中，G蛋白作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子和放大器處于核心地位，gap-43可調(diào)控G蛋白［6］。這種作用是通過(guò)gap－43的可結(jié)合到膜內(nèi)表面的氨基末端完成的，作為純化的蛋白質(zhì)，gap-43起一個(gè)鳥(niǎo)苷酸釋放蛋白的作用。它可提高從G0蛋白釋放GDP、提高GTP激酶活性及與GTP的結(jié)合［7］。我們的研究發(fā)現(xiàn)：Realtime PCR的檢驗(yàn)結(jié)果表明坐骨神經(jīng)損傷后，相應(yīng)脊髓節(jié)段的gap-43被激活并大量表達(dá)，應(yīng)用苦參堿后高中劑量組的gap-43表達(dá)明顯高于低劑量組及對(duì)照組，并與2周后持續(xù)表達(dá)。坐骨神經(jīng)損傷后應(yīng)用苦參堿可以對(duì)gap-43的活化起到持續(xù)促進(jìn)作用，促進(jìn)了神經(jīng)的再生。

［1］de Oliveira Luiz FC，Edwards Howell GM，Velozo Eudes S，Nesbitt M.Vibrational spectroscopic study of brazilin and brazilein，the main constituents of brazilwood from Brazil［J］.Vib Spectrosc，2002，28：243.

［2］Kim JK.Illustrated natural drugs encyclopedia［M］.Seoul；Namsandang Publishers；1989：79.

［3］黃繼漢，黃曉暉，陳志揚(yáng)，等.藥理試驗(yàn)中動(dòng)物間和動(dòng)物與人體間的等效劑量換算［J］.中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2004，9（9）：1069.

［4］劉 梅，劉雪英，程建峰.苦參堿的藥理進(jìn)展［J］.中國(guó)中藥雜志，2003，28（9）：801.

［5］Benowitz L I，Routtenberg A.GAP-43：an intrinsic determinant of neuronal development and plasticity［J］.Trends Neurosci，1997，20 （2）：84.

［6］Fishman MC.GAP243：Putting constraints on neuronal plasticity［J］.Perspective in developmental neurobiology，1996，4：193.

［7］Dani JW，Armstrong DM，Benowitz L I.Mapping the development of the rat brain by GAP-43Immunocytochemistry［J］.Neuroscience，1991，40（1）：277.