許哲男,鄭向宇,趙 維,辛 華,韓振國(guó)*
(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 胸外科,吉林 長(zhǎng)春130033;2.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院 病理生理教研室)
氯通道是分布于細(xì)胞膜上對(duì)氯離子或其他陰離子有通透性的電壓門控氯通道(voltage-gated Cl channel,ClC),哺乳動(dòng)物共有9個(gè)亞型,廣泛存在于機(jī)體的細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜,參與細(xì)胞的多種活動(dòng)和功能調(diào)節(jié)過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)多種腫瘤組織中都存在ClC-2蛋白的過(guò)度表達(dá)和處于磷酸化狀態(tài)。本研究以非小細(xì)胞肺癌為研究對(duì)象,與正常肺組織作為對(duì)比,探討氯離子同通道ClC-2在非小細(xì)胞肺癌及肺部疾病中表達(dá)情況,亦探明氯離子通道ClC-2作為治療非小細(xì)胞肺癌的基因靶位提供有利的依據(jù),為治療該腫瘤提供新的理論根據(jù)及途徑。
1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)分組 正常肺組織為對(duì)照組,肺鱗癌、肺腺癌、肺良性病灶為實(shí)驗(yàn)組。肺良性病灶以肺結(jié)核為主,部分為肺大泡和炎性假瘤。組織標(biāo)本購(gòu)于吉林大學(xué)組織標(biāo)本庫(kù),均收集于吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院胸外科2008.05-2009.08經(jīng)手術(shù)切除后保存的新鮮冷凍組織,提供標(biāo)本的患者術(shù)前未經(jīng)放、化療等系統(tǒng)抗癌治療。
1.1.2 試劑 總RNA提取Trizol試劑盒購(gòu)于Invitrogen公司,PCR試劑購(gòu)自TaKara公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒,核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)品,Taq酶,人ClC-2抗體(購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司)為一抗,辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的人抗體為二抗,丙烯酰胺,甲叉雙丙烯酰胺,M-MuLV RT、5XBuffer,M-MuLV RT Oligo d(T)Primers、購(gòu)自(寶生物,日本),免疫組化超敏Ultrasensitive S-P試劑盒和DAB顯示試劑盒(福州邁新公司),所有抗體均為即用型。
1.1.3 設(shè)備 低溫高速離心機(jī)(久保田,日本),722分光光度計(jì)(上海儀器廠),PCR儀(TAKARA,日本),全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)(Tanon,中國(guó)),電泳儀(Bio-rad,美國(guó)),蛋白質(zhì)電泳裝置及轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(BioBrad,美國(guó))。
1.2 方法
1.2.1 RT-PCR 檢測(cè)ClC-2mRNA的表達(dá) 應(yīng)用Trizol試劑盒,按照試劑盒使用說(shuō)明書(shū)對(duì)肺鱗癌及腺癌;肺良性病灶,正常肺組織分別提取總RNA。以上述所得總RNA為模板、Oligo(dT)為mRNA引物,應(yīng)用SuperScriptⅡ試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以此為模板,用人ClC-2特異性引物對(duì)cDNA進(jìn)行PCR特意擴(kuò)增,詳細(xì)操作步驟參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。ClC-2引物序列
forward5′-AGGCTTCTGTCTGCTTCCA-3′;Reverse5′-TTCCAATGAGTCTGCCAATAC-3′。擴(kuò)增的產(chǎn)物cDNA3′端大小約477bp。獲得RTPCR產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離檢驗(yàn),用以上的方法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。
1.2.2 Western blot檢測(cè)ClC-2蛋白的表達(dá) 按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。采用凝膠成像系統(tǒng)攝像,軟件分析條帶灰度值。
2.1 RT-PCR
利用ClC-2特意引物對(duì)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果顯示在與DL2000DNA marker對(duì)應(yīng)的250-500bp之間非小細(xì)胞肺癌組有一明顯特異片段,肺良性病和正常肺組中其顯示微弱,再與每個(gè)樣品測(cè)得的目的基因含量與本樣品的GAPDH含量相除,得到每個(gè)樣品目的基因的相對(duì)含量,然后才進(jìn)行樣品與樣品之間的比較。結(jié)果表明非小細(xì)胞肺癌ClC-2基因表達(dá)量明顯增加(見(jiàn)圖1)。
圖1 RT-PCR檢測(cè)ClC-2及GAPDH的電泳結(jié)果
2.2 Western Blot
檢測(cè)結(jié)果顯示非小細(xì)胞肺癌組中ClC-2蛋白在98KD出有一條明顯特征帶,ClC-2/β-Actin趨勢(shì)比較,表明非小細(xì)胞肺癌中鱗癌表達(dá)量最高,其次肺腺癌及良性病灶表達(dá)無(wú)明顯差距,相比正常肺組織中ClC-2蛋白表達(dá)量比實(shí)驗(yàn)組降低,每組中氯離子通道ClC-2均有一定的表達(dá)(見(jiàn)圖2)。
圖2 Westemblot檢測(cè)ClC-2蛋白的表達(dá)
ClC屬電壓門控性通道(voltage-gated chloride channels,ClC),在細(xì)胞的容積調(diào)節(jié)、細(xì)胞電位、細(xì)胞器的酸化及pH的調(diào)節(jié)、細(xì)胞的增殖、分化及凋亡,免疫細(xì)胞的募集及激活等多種病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[1,2],近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)電壓門控性氯離子通道在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)異常,且可能在腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、演化、增殖、細(xì)胞周期、侵襲轉(zhuǎn)移及耐藥性等惡性生物學(xué)行為中可能起重要作用[3,4]。
ClC-2是ClC的一員,其分布廣泛,在大腦,腎臟及腸道的表達(dá)相對(duì)較高[5]。ClC通道家族成員的蛋白質(zhì)功能性結(jié)構(gòu)分析表明[6],ClC通道蛋白質(zhì)可能形成二聚體,具有“雙筒槍(double-b-arreled)”通道結(jié)構(gòu)?;蛲蛔兯斐蒀lC型氯離子通道蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)異常,尤其是涉及功能的活性位點(diǎn)發(fā)生變化,是影響ClC型氯離子通道生理功能并發(fā)疾病的一個(gè)主要原因,例如CBS區(qū)域內(nèi)(真核生物ClC蛋白中還有兩個(gè)β-胱硫醚合酶)的點(diǎn)突變會(huì)影響通道的電壓依賴性及ATP結(jié)合,導(dǎo)致一些遺傳性疾病[7,8],另外ClC型氯離子通道的基因缺陷或表達(dá)異常也會(huì)引起相應(yīng)的生理變化或疾病。
電壓門控性氯離子通道影響生物學(xué)行為的機(jī)制可能如下:(1)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度,運(yùn)用氯離子通道阻滯劑作用癌細(xì)胞后,細(xì)胞增殖能力降低,細(xì)胞周期停滯于G0/G1,同時(shí)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度下降,這可能表明氯離子通道調(diào)節(jié)鈣離子濃度,從而間接影響癌細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期[9]。(2)磷酸化調(diào)節(jié)cAMP依賴的激酶(PKA)和蛋白激酶C(PKC),可以刺激或抑制ClC-2的活性,活體外的磷酸化測(cè)定顯示ClC-2可以被M時(shí)相特異同期蛋白依賴性激酶p34cdc2/細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白B(M-phase-specificcyclin-dependent kinase p34cdc2/cyclinB)磷 酸化[10],顯著降低 ClC-2電流。因此 ClC-2第632位絲氨酸-丙氨酸(S632A)突變消除了ClC-2的磷酸化位點(diǎn),從而消除了p34cdc2/cyclinB對(duì)其功能的調(diào)節(jié)作用。(3)細(xì)胞體積調(diào)控機(jī)制,當(dāng)細(xì)胞處在一個(gè)低滲環(huán)境時(shí),水的被動(dòng)流動(dòng)引起細(xì)胞腫脹后水和離子外流,細(xì)胞的體積得以恢復(fù),此過(guò)程稱為細(xì)胞調(diào)節(jié)性體積下降(regulatory volume decrease,RVD),癌細(xì)胞在侵襲遷移過(guò)程中需要體積下降以“擠”過(guò)狹小的組織間隙。調(diào)節(jié)性細(xì)胞容積回縮(RVD),認(rèn)為是當(dāng)細(xì)胞暴露與低滲環(huán)境時(shí),細(xì)胞膨脹,該膨脹會(huì)激活細(xì)胞的調(diào)節(jié)機(jī)制,使已增大的細(xì)胞容積減小并向正常體積轉(zhuǎn)變。RVD被認(rèn)為是細(xì)胞增殖、分化、遷移及細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)的生理功能之一。研究發(fā)現(xiàn)鼻咽癌發(fā)生中,氯通道通過(guò)RVD參與了細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移[11,12]。Soroceanu等分別證實(shí),氯通道阻斷劑能夠抑制腫瘤的侵襲。腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)序貫,復(fù)雜的過(guò)程,包括腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)灶、黏附基底膜和細(xì)胞基質(zhì),并對(duì)其水解破壞,癌細(xì)胞侵入周圍脈管,繼續(xù)生長(zhǎng)形成轉(zhuǎn)移癌,貫穿于整個(gè)過(guò)程,肺癌細(xì)胞的浸潤(rùn)可視為一個(gè)“主動(dòng)”運(yùn)動(dòng)過(guò)程,通過(guò)癌細(xì)胞容積和形狀的改變,具有浸潤(rùn)潛能的癌細(xì)胞來(lái)完成浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移。有研究證實(shí)低滲環(huán)境下,腺癌細(xì)胞可實(shí)現(xiàn)容積的部分恢復(fù),而鱗癌細(xì)胞可調(diào)節(jié)細(xì)胞回復(fù)原有的或甚至更小的容積,表明與正常肺組織相比,肺癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的機(jī)制來(lái)控制細(xì)胞大小以保持其旺盛的生存能力,進(jìn)而使細(xì)胞發(fā)生快速變形以增加其分裂增殖及浸潤(rùn)潛能。
本實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR法和 Western blot法分別在基因和蛋白水平檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌、肺良性病及正常肺組織中ClC-2mRNA及ClC-2通道蛋白的表達(dá)程度,結(jié)果顯示ClC-2基因產(chǎn)物為非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)量明顯高于肺良性病及正常肺組織,提示ClC-2可能與肺癌癌變的原始發(fā)生和進(jìn)展過(guò)程中起到基因調(diào)控作用,與腫瘤發(fā)生、促進(jìn)增長(zhǎng)及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移有關(guān)。ClC-2mRNA特異性表達(dá)升高在基因水平上賦予了肺癌細(xì)胞較強(qiáng)的氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)能力,有利于細(xì)胞大小和形狀的改變,從而導(dǎo)致瘤細(xì)胞易于分裂和侵襲轉(zhuǎn)移。然而蛋白表達(dá)水平上肺良、惡性腫瘤與正常肺組織相比有明顯表達(dá)增加,但良、惡性疾病之間無(wú)顯著差異。這可能提示氯通道作為電壓門控離子通道,廣泛分布于人體的細(xì)胞器及細(xì)胞器膜,調(diào)節(jié)細(xì)胞體積。在肺部疾病發(fā)展過(guò)程中正常細(xì)胞向疾病轉(zhuǎn)變,一系列遺傳信息的改變可能會(huì)影響ClC-2蛋白的表達(dá),或ClC-2蛋白的活性發(fā)生改變,從而導(dǎo)致無(wú)論是非小細(xì)胞肺癌,還是肺良性疾病,均會(huì)增加ClC-2蛋白表達(dá)量。
但ClC-2mNRA及ClC-2蛋白在正常組織和肺部良、惡性疾病中的表達(dá)差異及發(fā)生變異的ClC-2離子通道基因作用于肺惡性腫瘤生成,進(jìn)展的哪個(gè)階段等一系列問(wèn)題必將會(huì)今后研究的重要方向。ClC-2也將成為非小細(xì)胞肺癌及肺部疾病診的斷與治療提供新的基因靶位,對(duì)此,還需要進(jìn)一步研究。
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