楊歡利 毛英姿 諸溢揚(yáng) 陳輝波

全世界大約有15%的育齡夫婦不育，不育夫婦中大約有50%與各種因素導(dǎo)致的男性精子發(fā)生障礙有關(guān)，其中30%的男性精子發(fā)生障礙是由染色體異常和基因突變、缺失等遺傳因素造成的［1］。人類基因組序列分析及大片段功能性遺傳序列檢測證實(shí)人類Y染色體上存在許多精子發(fā)生相關(guān)基因，這些基因缺失或突變是導(dǎo)致男性原發(fā)性不育的遺傳病因［2］。大約有5% ～10%的少精子患者及15% ～20%的無精子患者存在遺傳異常，其中包括Y染色體微缺失及以Klinefelter綜合征為主的染色體異常［3］。近年來隨著睪丸內(nèi)精子獲取術(shù)(TESE)及胞質(zhì)內(nèi)單精子注射技術(shù)(ICSI)應(yīng)用到男性不育的治療中，使一些無精癥及嚴(yán)重少精癥患者獲得了生育的機(jī)會(huì)。然而由于這些技術(shù)越過了自然選擇的過程，具有將父代的遺傳缺陷垂直傳遞給后代的風(fēng)險(xiǎn)。因此，在ICSI前進(jìn)行遺傳檢測顯得尤為重要。本研究通過對無精癥及嚴(yán)重少精癥患者進(jìn)行Y染色體微缺失及細(xì)胞遺傳學(xué)研究，調(diào)查其遺傳異常發(fā)生類型及分布頻率，同時(shí)為ICSI輔助生殖患者提供治療前的遺傳咨詢。

對象與方法

1．對象:選擇2010年3月～2012年3月來浙江省臺州醫(yī)院生殖中心進(jìn)行Y染色體微缺失及細(xì)胞遺傳學(xué)檢測的不育男性及婚檢男性共211人，年齡19～40歲，中位年齡29歲。所有檢測者禁欲2～7天后自慰法留取精液，精液分析參照WHO第5版《人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊》［4］進(jìn)行。根據(jù)精液分析結(jié)果將研究對象分為無精癥及嚴(yán)重少精癥組(＜5×106/ml)和精液正常對照組，其中無精癥患者精液連續(xù)3次檢查并離心檢測均未發(fā)現(xiàn)精子;嚴(yán)重少精子癥患者精液分析3次，濃度均＜5×106/ml，正常對象分析2次結(jié)果都正常。同時(shí)留取檢測者外周血標(biāo)本2ml，一部分血液樣本提取DNA進(jìn)行Y染色體微缺失檢測，另一部分培養(yǎng)用于細(xì)胞遺傳學(xué)分析。

2．試劑:DNA提取試劑盒購自亞能生物，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，Multiplex PCR Assay Kit購自大連寶生物公司，RPMI1640培養(yǎng)基為Sigma公司產(chǎn)品。

3．方法:(1)Y染色體微缺失檢測:取EDTA抗凝的外周血100μl提取DNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測所提DNA的質(zhì)量。根據(jù)目的基因大小及其之間互作效應(yīng)將15個(gè)STS分到4管多重PCR體系中，每管采用性別決定因子(SRY)作為內(nèi)控條帶，其中Ⅰ管為 SY254、SY143、SY242、SY255，Ⅱ管為 SY84、SY239、SY152，Ⅲ管為 SY86、SY127、SY145、SY124，Ⅳ管為SY134、SY82、SY128、SY133。反應(yīng)總體積為 25μl，擴(kuò)增條件為50℃ 10min;95℃ 15min;94℃ 30s，58℃ 60s，72℃ 60s，35 個(gè)循環(huán);72℃延伸10min。取10μl PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用BIO－RAD凝膠成像系統(tǒng)檢測PCR產(chǎn)物條帶的分布，判斷Y染色體是否有缺失及缺失的位點(diǎn)和類型。如果存在位點(diǎn)的缺失，則利用該位點(diǎn)的特異性引物以SRY為內(nèi)參重復(fù)進(jìn)行2次擴(kuò)增，無擴(kuò)增該位點(diǎn)的條帶時(shí)即確定該位點(diǎn)缺失。(2)細(xì)胞遺傳學(xué)檢測:將外周血用RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)72h，在終止培養(yǎng)前3～4h加入秋水仙素，繼續(xù)培養(yǎng)3～4h。將培養(yǎng)的細(xì)胞濁液離心，對分離的細(xì)胞進(jìn)行低滲、固定、胰蛋白酶消化及吉姆薩染色，每個(gè)樣本至少分析20個(gè)分裂相。

4．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS 11．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，組間缺失率差異比較采用卡方檢驗(yàn)，以P＜0．05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．Y染色體微缺失及細(xì)胞遺傳學(xué)異常的分布:在73例無精癥及嚴(yán)重少精癥患者中檢測到7例Y染色體微缺失及7例染色體核型異常，138例精液正常對照組中均未檢測到Y(jié)染色體微缺失及染色體核型異常。無精癥及嚴(yán)重少精癥組Y染色體微缺失率為9.6%(7/73)，染色體核型異常率為9．6%(7/73)，其中Y染色體微缺失涉及AZF的3個(gè)區(qū)域，AZFb缺失率為1．4%，AZFc缺失率為 8．2%，AZFd缺失率為9.6%，AZFa未見缺失，具體見表1。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，無精癥及嚴(yán)重少精癥組與精液正常對照組相比Y染色體微缺失頻率差異極顯著(χ2=10．86，P ＜0．01)。

表1 無精癥及嚴(yán)重少精癥患者Y染色體微缺失類型的分布

細(xì)胞遺傳學(xué)異常涉及到5種核型，具體見表2。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，無精癥及嚴(yán)重少精癥組與精液正常對照組相比染色體核型異常差異極顯著(χ2=10．86，P＜0．01)。

表2 無精癥及嚴(yán)重少精癥患者染色體核型類型分布

2．無精癥及嚴(yán)重少精癥患者Y染色體微缺失與染色體核型比較分析:見表3，Y染色體微缺失在正常和異常染色體核型中都有發(fā)生，其缺失后的表現(xiàn)為無精癥或嚴(yán)重少精癥;其中AZFb位點(diǎn)缺失者都表現(xiàn)為無精癥，AZFc或AZFd位點(diǎn)缺失者表現(xiàn)為無精癥或嚴(yán)重少精癥。通過Y染色體微缺失檢測不能準(zhǔn)確判斷染色體核型是否異常，而僅進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)的核型分析也不能判斷Y染色體微缺失是否發(fā)生，所以，對這些患者應(yīng)進(jìn)行Y染色體微缺失和核型分析兩項(xiàng)檢測。此外，染色體核型異常者表現(xiàn)為無精癥。

表3 無精癥及嚴(yán)重少精癥患者Y染色體微缺失與染色體核型比較分析

3．Y染色體微缺失的多重PCR電泳圖:在所檢測到的7例Y染色體微缺失患者中共有3種類型的缺失，其中5例是AZFc和AZFd聯(lián)合缺失，1例為AZFb、AZFc和AZFd聯(lián)合缺失，1例為AZFd位點(diǎn)單獨(dú)缺失(圖1～圖3)。

討 論

圖3 D位點(diǎn)單獨(dú)缺失電泳圖

在導(dǎo)致男性不育的各種因素中遺傳因素起著關(guān)鍵作用，其中最常見的是Klinefelter綜合征為主的染色體核型異常及Y染色體長臂微缺失［1］。本研究發(fā)現(xiàn)的7例染色體核型異常都導(dǎo)致無精癥，其中3例為Klinefelter綜合征。Tiepolo等［5］首次發(fā)現(xiàn)了 Y染色體長臂1區(qū)1帶存在精子發(fā)生相關(guān)基因，稱為無精子因子(AZF)。隨后研究者將AZF分為AZFa、AZFb、AZFc、AZFd 4個(gè)區(qū)域，AZFa缺失可導(dǎo)致青春期精子發(fā)生阻滯，臨床表現(xiàn)為“唯支持細(xì)胞綜合征”無精子生成［6］;AZFb缺失可導(dǎo)致精子發(fā)生過程阻滯于精母細(xì)胞階段，睪丸內(nèi)僅見精原細(xì)胞和初級精母細(xì)胞，無精子生成;AZFc缺失的臨床表現(xiàn)從正常精子到無精子各種表型［7］;AZFd缺失可導(dǎo)致不同程度的生精障礙形式。本研究共發(fā)現(xiàn)7例Y染色體微缺失，1例為有AZFb位點(diǎn)缺失患者，未檢測到精子;5例為有AZFc位點(diǎn)缺失患者，其中3例有精子;1例為單獨(dú)的AZFd位點(diǎn)缺失，可檢測到精子，各缺失類型檢測到的精子濃度都＜5×106/ml。

目前細(xì)胞遺傳學(xué)分析采用外周血G顯帶分析的方式，這種方法可準(zhǔn)確診斷各染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常，但這種技術(shù)的精確度較低，不能可靠地檢測低于5萬～10萬個(gè)堿基對或更小的基因組片段的缺失、重復(fù)或重排［8］。Y染色體微缺失檢測采用多重PCR的方法，具有簡單、快速、靈敏等特點(diǎn)，檢測片段可達(dá)到1個(gè)堿基對即可對基因水平進(jìn)行檢測。劉曉翌等［9］研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞遺傳學(xué)檢測Y染色體有q12缺失及鄰近部位q11．23缺失的病例卻沒有檢測到AZF位點(diǎn)的缺失，說明細(xì)胞遺傳學(xué)不能反映Y染色體上AZF缺失情況;Y染色體有缺失，不一定有AZF的缺失，染色體核型正常也不排除有AZF的缺失。本研究檢測到1例46，XYq－，Y染色體長臂缺失患者，同時(shí)檢測到AZF的缺失，由于Yq是DNA高度重復(fù)的區(qū)域，只有細(xì)胞遺傳學(xué)檢測到Y(jié)q11大片段或完全缺失時(shí)才會(huì)有AZF的缺失。同時(shí)檢測到另外6例AZF缺失患者，其染色體核型是正常的。所以對無精癥及嚴(yán)重少精癥患者進(jìn)行遺傳診斷時(shí)要同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)分析和Y染色體微缺失檢測。

不育患者染色體核型異常的發(fā)生率與許多因素有關(guān)，其中最重要的是基于病人精子計(jì)數(shù)的選擇標(biāo)準(zhǔn)，特別是無精癥及嚴(yán)重少精癥患者有著較高的發(fā)生率［10］。Akgul等［1］在無精癥患者中檢測到 17．4%及嚴(yán)重少精癥患者中檢測到6.8%的染色體核型異常，而正常精液人群未發(fā)現(xiàn)異常。本研究只在無精癥患者中檢測到染色體核型異常，發(fā)生率為9．6%，與其他研究報(bào)道的8．5% ～14.3%結(jié)果相一致［10～12］。其中Klinefelter綜合征發(fā)生率最高為4．1%與以前報(bào)道的 3．6% ～4．0%的結(jié)果相一致［13，14］。Y 染色體微缺失的發(fā)生率與實(shí)驗(yàn)室選取檢測的STS位點(diǎn)，檢測標(biāo)準(zhǔn)及人群的種族差異，檢測方法及質(zhì)控相關(guān)［15］。本研究只在無精癥及嚴(yán)重少精癥患者中檢測到Y(jié)染色體微缺失，正常對照未見缺失且兩者差異極顯著。Y染色體微缺失發(fā)生率為9．6%，與國內(nèi)外報(bào)道的8．2%～10．8%結(jié)果相一致，其中AZFc、AZFd位點(diǎn)發(fā)生率較高，是熱點(diǎn)缺失區(qū)域［10］。

隨著輔助生殖技術(shù)的應(yīng)用，越來越多的不育患者選擇輔助生殖的方式來獲得后代，特別是一些無精癥及嚴(yán)重少精癥患者只有通過ICSI才能有獲得自己后代的機(jī)會(huì)。由于ICSI操作越過了一些自然選擇屏障，Y染色體微缺失或染色體異常的患者，具有將這些遺傳缺陷垂直傳遞給后代的風(fēng)險(xiǎn)。不育父代將染色體異常傳遞給后代的概率為9．4% ～33．0%。此外，AZFa和AZFb完全缺失患者幾乎不能從睪丸內(nèi)獲得精子［6，7］，只能通過供精來獲得生育。因此，在輔助生殖前進(jìn)行Y染色體微缺失篩查和細(xì)胞遺傳學(xué)檢測可減少不必要的睪丸穿刺取精，降低患者身體、精神上的傷害及減少經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)指導(dǎo)患者選擇可行的生育途徑。對于AZFc和AZFd缺失患者睪丸中凋亡的生殖細(xì)胞的比例顯著增加，導(dǎo)致具有這些位點(diǎn)缺失且可檢測到精子的患者的精子數(shù)目有進(jìn)行性下降的風(fēng)險(xiǎn)，最終可發(fā)展至無精癥。對于這些患者應(yīng)及早治療或精液冷凍保存，避免發(fā)展到有創(chuàng)傷的取精或不能生育的風(fēng)險(xiǎn)。此外，對于這些Y染色體微缺失或染色體異?；颊?，進(jìn)行輔助生殖時(shí)，應(yīng)選擇種植前遺傳學(xué)診斷，避免缺陷傳遞給后代。

總之，Y染色體微缺失及染色體核型異常是導(dǎo)致男性不育的主要的遺傳原因，常導(dǎo)致男性出現(xiàn)無精癥或嚴(yán)重少精癥而不育。因此，為了較好的治療及獲得健康后代，需要進(jìn)行Y染色體微缺失及細(xì)胞遺傳學(xué)檢測，同時(shí)也為輔助生殖提供遺傳咨詢及制定合理的治療方案提供依據(jù)。

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