傅若秋，孟德勝，盧來(lái)春，余孟君，歐陽(yáng)冰，鞠 樺

(1.中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院，重慶 400042; 2.安微蚌埠醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，安徽 蚌埠 233030)

薇依霜為醫(yī)院傳統(tǒng)護(hù)膚制劑，具有防止皮膚萎縮、保濕防皺、營(yíng)養(yǎng)皮膚、抗衰老等作用。其主要成分為維生素E(含量為2%)，且含有羥苯乙酯(含量為0.1%)作為防腐劑。為對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制，筆者參照有關(guān)文獻(xiàn)方法[1-2]，采用高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定了維生素E和羥苯乙酯的含量，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Gold System高效液相色譜儀(美國(guó)貝克曼)，包括125泵、166紫外檢測(cè)器;Sartorius BT 25S型電子分析天平(德國(guó)賽多利斯);RE-201C型恒溫水浴鍋(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司);KQ-50B型超聲波清洗儀(昆明市超聲儀器有限公司)。維生素E對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為100062-200608);羥苯乙酯對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為100847-200501);薇依霜(第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院自制，批號(hào)分別為091112，091217，091123);甲醇(色譜純，SK Chemicals公司);水為超純水，其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

維生素E測(cè)定色譜條件:Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm);流動(dòng)相:甲醇;紫外檢測(cè)波長(zhǎng):285 nm;流速:2.0 mL/min;進(jìn)樣量:20μL;柱溫:室溫。羥苯乙酯測(cè)定色譜條件:Diamonsil C18柱(250 mm ×4.6 mm，5μm);流動(dòng)相:甲醇 -水(45∶55);紫外檢測(cè)波長(zhǎng):258 nm;流速1.0 mL/min;進(jìn)樣量:20μL;柱溫:室溫。

2.2 溶液配制

精密稱取維生素E對(duì)照品0.024 9 g，置25 mL容量瓶中，加無(wú)水乙醇溶解定容，得質(zhì)量濃度為0.996 g/L的維生素E對(duì)照品溶液。精密稱取羥苯乙酯對(duì)照品0.010 8 g，置50 mL容量瓶中，加無(wú)水乙醇溶解定容，作為對(duì)照品貯備液;精密吸取對(duì)照品貯備液5 mL，置50 mL容量瓶中，加無(wú)水乙醇定容，得質(zhì)量濃度為21.6μg/mL的羥苯乙酯對(duì)照品溶液。精密稱取薇依霜0.1 g，置10 mL量瓶中，加適量無(wú)水乙醇溶解，超聲處理1 h，冷卻至室溫，定容，搖勻，微孔濾器(0.22μm)濾過(guò)，續(xù)濾液作為供試品溶液。測(cè)定維生素E時(shí)，供試品溶液不用稀釋;測(cè)定羥苯乙酯時(shí)，供試品溶液需用無(wú)水乙醇稀釋2倍。按處方比例配制缺維生素E的制劑，再按供試品溶液制備方法制成不含維生素E的陰性對(duì)照品溶液。按處方比例配制缺羥苯乙酯的制劑，再按供試品溶液制備方法制成不含羥苯乙酯的陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性考察:分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。可見(jiàn)，待測(cè)成分與其他物質(zhì)分離良好，分離度大于1.5，維生素E和羥苯乙酯的保留時(shí)間分別為13.6 min和18.6 min，陰性對(duì)照品溶液色譜在待測(cè)成分相應(yīng)位置無(wú)干擾峰，表明其他成分對(duì)待測(cè)成分的測(cè)定無(wú)干擾。

圖1 維生素E高效液相色譜圖

圖2 羥苯乙酯高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察:分別精密吸取維生素E對(duì)照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，置 10 mL 容量瓶中，加無(wú)水乙醇定容，配制得5個(gè)不同梯度的對(duì)照品工作溶液(0.099 6，0.199，0.299，0.398，0.498 g/L)，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，記錄維生素E峰面積，以峰面積(A)對(duì)質(zhì)量濃度(C，g/L)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 A=32.241 8 C+0.166 9，r=0.999 5(n=5)。結(jié)果表明，維生素E進(jìn)樣質(zhì)量濃度在0.099 6～0.498 g/L范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。分別精密吸取羥苯乙酯對(duì)照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，置 10 mL 容量瓶中，加無(wú)水乙醇定容，配制得5個(gè)不同梯度的對(duì)照品工作溶液(2.16，4.32，6.48，8.64，10.80μg/mL)，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，記錄羥苯乙酯的峰面積，以峰面積(A)對(duì)質(zhì)量濃度(C，μg/mL)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 A=2.122 2C+0.01031，r=0.9997(n=5)。結(jié)果表明，羥苯乙酯進(jìn)樣質(zhì)量濃度在2.16～10.80μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn):取維生素E高(0.398 g/L)、中(0.299 g/L)、低(0.199 g/L)3個(gè)質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件于1 d內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣5次，以及連續(xù)5 d分別進(jìn)樣，考察日內(nèi)精密度和日間精密度。結(jié)果日內(nèi)精密度 RSD＜1.18%(n=5)，日間精密度 RSD＜1.72%(n=5)。取羥苯乙酯高(8.64μg/mL)、中(6.48μg/mL)、低(4.32μg/mL)3個(gè)質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件于1 d內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣5次，以及連續(xù)5 d分別進(jìn)樣，考察日內(nèi)精密度和日間精密度。結(jié)果日內(nèi)精密度RSD＜1.57%(n=5)，日間精密度 RSD＜2.45%(n=5)。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品溶液，室溫放置 0，6，12，24 h，依法進(jìn)樣測(cè)定峰面積。結(jié)果維生素E峰面積的 RSD=1.67%，羥苯乙酯峰面積的 RSD=1.23%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn):取同一批樣品(批號(hào)為091112)5份，依法制備供試品溶液并進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果維生素E峰面積的 RSD=1.91%(n=5)，羥苯乙酯峰面積的 RSD=1.57%(n=5)。

加樣回收試驗(yàn):精密稱取已知維生素E含量的同一批樣品1 g(批號(hào)為091112)共9份，每3份為一組，分別加入不同質(zhì)量濃度維生素E對(duì)照品溶液1.0 mL，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液并進(jìn)樣，計(jì)算加樣回收率。精密稱取已知羥苯乙酯含量的同一批樣品0.03 g(批號(hào)為091112)共9份，每3份為一組，分別加入不同質(zhì)量濃度羥苯乙酯對(duì)照品溶液各1.0 mL，按2.2項(xiàng)下方法制備供試液品溶液并進(jìn)樣，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 維生素E與羥苯乙酯加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.4 樣品含量測(cè)定

取薇依霜樣品3批，按2.2項(xiàng)下制備供試液品溶液，按2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算維生素E和羥苯乙酯的含量。結(jié)果維生素E和羥苯乙酯含量分別為標(biāo)示量的(99.9±0.72)%和(98.84±2.87)%(n=3)。

3 討論

曾考察了乙腈-甲醇對(duì)維生素E的分離效果，發(fā)現(xiàn)維生素E的保留時(shí)間隨乙腈含量的增加而延長(zhǎng)，當(dāng)乙腈為100%、流速為1.5 mL/min時(shí)，保留時(shí)間達(dá)43.5 min。而用甲醇作流動(dòng)相、流速為1.5 mL/min時(shí)，保留時(shí)間為18.5 min，當(dāng)流速增加到2.0 mL/min時(shí)，保留時(shí)間降到13.6 min，且峰形較好。因此本試驗(yàn)選擇甲醇為流動(dòng)相，并將流速設(shè)為2.0 mL/min。

羥苯乙酯測(cè)定時(shí)，考察了不同比例甲醇-水作為流動(dòng)相時(shí)的分離效果，當(dāng)甲醇-水為50∶50時(shí)，羥苯乙酯與樣品中的干擾物質(zhì)(主要為香精)的色譜峰重疊，無(wú)法分離;當(dāng)甲醇-水為45∶55、流速為 1.0 mL/min時(shí)，可以較好分離，保留時(shí)間為18.6 min。

曾采用乙醇為溶劑、80℃水浴溶解、冷藏后離心取上清液的方法，但試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)樣品分散溶解不完全，且離心分離效果不好，上清液中不溶性雜質(zhì)不易去除，容易堵塞色譜柱。后改為超聲促溶并用微孔濾膜過(guò)濾的方式處理樣品，通過(guò)加樣回收試驗(yàn)證明該方法穩(wěn)定、可靠。

[1]胡守蓮，范玉峰.HPLC法測(cè)定維生素E搽劑中維生素E的含量[J].中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥，2009，16(10):5-6.

[2]簡(jiǎn)炎林，鄒國(guó)芳.醫(yī)院制劑中防腐劑羥苯乙酯的含量測(cè)定[J].中國(guó)藥房，2009，20(13):1 016-1 017.