湯麗苑， 徐 鈺， 陳 瑾， 劉新華， 俞 康△

(1溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院血液科, 2溫州醫(yī)學(xué)院，3溫州醫(yī)學(xué)院血液腫瘤與移植免疫研究所，浙江 溫州 325000)

1000-4718(2012)04-0649-06

2011-08-26

2012-01-18

溫州醫(yī)學(xué)院5010重大項(xiàng)目子課題(No.XNK05005)

△通訊作者Tel:0577-88069517;E-mail：yukang62@126.com

人多發(fā)性骨髓瘤RPMI 8226細(xì)胞條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)破骨前體細(xì)胞的分化成熟*

湯麗苑1， 徐 鈺2， 陳 瑾2， 劉新華3， 俞 康1△

(1溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院血液科,2溫州醫(yī)學(xué)院，3溫州醫(yī)學(xué)院血液腫瘤與移植免疫研究所，浙江 溫州 325000)

目的探討人多發(fā)性骨髓瘤RPMI 8226細(xì)胞條件培養(yǎng)液對(duì)破骨前體細(xì)胞RAW264.7的影響。方法Western blotting檢測(cè)可溶性核因子κB 受體激活劑配體(soluble receptor activator of NF-κB ligand, sRANKL)的蛋白表達(dá)?？咕剖崴嵝粤姿崦?tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP)染色觀察RAW264.7細(xì)胞的分化成熟情況。RT-PCR法檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞TRAP和cathepsin K mRNA的表達(dá)。結(jié)果Western blotting法證實(shí)RPMI 8226細(xì)胞條件培養(yǎng)液中含有sRANKL。TRAP染色發(fā)現(xiàn)RPMI 8226細(xì)胞條件培養(yǎng)液能誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分化為TRAP陽(yáng)性的多核成熟破骨細(xì)胞。人抑制性RANKL單克隆抗體拮抗30%RPMI 8226細(xì)胞條件培養(yǎng)液中sRANKL的作用，且具有劑量依賴性。30% RPMI 8226細(xì)胞條件培養(yǎng)液能刺激RAW264.7細(xì)胞上調(diào)TRAP和cathepsin K mRNA表達(dá)。結(jié)論人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞RPMI 8226條件培養(yǎng)液中的sRANKL具有促RAW264.7破骨前體細(xì)胞分化成TRAP陽(yáng)性的多核成熟破骨細(xì)胞的生物活性。人抑制性RANKL單克隆抗體阻斷30%RPMI 8226細(xì)胞條件培養(yǎng)液中sRANKL的誘導(dǎo)分化作用，且具有濃度依賴性。

多發(fā)性骨髓瘤； 破骨細(xì)胞； 核因子κB受體激活劑配體

骨髓瘤骨病是多發(fā)性骨髓瘤的重要病理改變之一，是影響骨髓瘤患者生活質(zhì)量和預(yù)后的重要因素。目前認(rèn)為骨髓瘤骨病由骨重建失調(diào)所致，包括破骨功能增強(qiáng)和成骨功能減弱，新生骨質(zhì)未能代償性增加,引起骨質(zhì)破壞[1]。核因子κB受體激活劑(receptor activator of NF-κB, RANK)/RANK配體(RANK ligand,RANKL)和骨保護(hù)素(osteoprotegerin,OPG)系統(tǒng)與骨髓瘤骨病發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[2]，其靶向治療是目前研究的熱點(diǎn)[3-4]。本文建立骨髓瘤細(xì)胞誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化的細(xì)胞模型，探討人多發(fā)性骨髓瘤RPMI 8226細(xì)胞表達(dá)sRANKL對(duì)RAW264.7細(xì)胞分化成熟的影響，同時(shí)研究人抑制性RANKL單克隆抗體在其中的抑制作用，為今后靶向治療提供實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1材料

人多發(fā)性骨髓瘤RPMI 8226細(xì)胞由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院血液研究所金潔教授惠贈(zèng)(ATCC，編號(hào):CCL-155)。鼠單核巨噬細(xì)胞(RAW264.7)購(gòu)于北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞庫(kù)(ATCC ，編號(hào):TIB-71)。人成骨肉瘤細(xì)胞(MG-63) 購(gòu)于武漢大學(xué)細(xì)胞保藏中心(CCTCC，編號(hào):GDC074)。人抑制性RANKL單克隆抗體(RANKL mAb，型號(hào)：MAB6262)、人RANKL單克隆抗體MAB6263(用于Western blotting)和重組人RANKL蛋白(rhRANKL)購(gòu)于R&D。TRAP染色試劑盒購(gòu)于Sigma。Random Primer、逆轉(zhuǎn)錄酶、RNasin、dNTP、5×Reaction Buffer購(gòu)于Fermentas。PCR 引物由上海生工生物工程公司合成。Platinum PCR SuperMix購(gòu)于Invitrogen。Amicon Ultra-15超濾管(15 mL，10 kD)購(gòu)于 Millipore。ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)于Pierce。

2方法

2.1工作液的配制 RANKL mAb干粉500 μg用1 mL無(wú)菌PBS溶解，配成濃度為500 mg/L，分裝后-80 ℃儲(chǔ)存。MAB6263干粉100 μg用200 μL無(wú)菌PBS溶解，配成濃度為500 mg/L，分裝后-80 ℃儲(chǔ)存。rhRANKL干粉10 μg用0.2 mL無(wú)菌PBS溶解，配成濃度為50 mg/L，加入0.1%人白蛋白保持其活性，分裝后-80 ℃儲(chǔ)存。

2.2細(xì)胞培養(yǎng)和條件培養(yǎng)液及其濃縮液的收集 RPMI 8226細(xì)胞、RAW264.7細(xì)胞與MG-63細(xì)胞用10% FCS-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),培養(yǎng)條件為37 ℃、5 % CO2，2～4 d換液傳代。臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)檢測(cè)活細(xì)胞率均在95%以上。RPMI 8226和MG-63細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，以1×108/L密度傳代接至25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，培養(yǎng)2 d后將細(xì)胞懸液或上清液移至離心管中，200×g離心5 min后，取上清液，500×g離心10 min完全去除細(xì)胞后，收集條件培養(yǎng)液，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩PMI 8226細(xì)胞條件培養(yǎng)液15 mL加入超濾管中，離心機(jī)甩平轉(zhuǎn)子4 000×g，30 min，取出濃縮液300 μL，稱量離心前后離心管重量，評(píng)估濃縮50倍，分裝后-80 ℃儲(chǔ)存。

2.3Western blotting法檢測(cè) RPMI 8226細(xì)胞取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)傳代，以1×108/L密度接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)2 d后分別通過離心獲取細(xì)胞，提取總蛋白。RPMI 8226細(xì)胞50×濃縮條件培養(yǎng)液和1×條件培養(yǎng)液經(jīng)蛋白裂解后，將20 μL蛋白經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，于搖床上封閉1.5 h，分別加入鼠抗人RANKL單克隆抗體(MAB6263)，4 ℃過夜，TBST充分漂洗。加入辣根過氧化物酶連接的羊抗鼠IgG室溫輕搖1.5 h，同上漂洗，與ECL化學(xué)發(fā)光試劑反應(yīng)，常規(guī)方法顯色、定影。

2.4TRAP染色 根據(jù)試劑盒使用說明書的步驟進(jìn)行。RAW264.7細(xì)胞以每孔1.5×104接種于6孔板，培養(yǎng)過夜后更換不同條件培養(yǎng)液(100 μg/L rhRANKL、30%MG-63細(xì)胞條件培養(yǎng)液、30%RPMI 8226細(xì)胞條件培養(yǎng)液以及0.00006 mg/L、0.0006 mg/L、0.006 mg/L、0.06 mg/L、0.6 mg/L、1 mg/L、1.5 mg/L不同濃度RANKL mAb加入30%RPMI 8226細(xì)胞條件培養(yǎng)液組)，第7 d TRAP 染色，細(xì)胞用4%多聚甲醛固定10 min后，加染色液，37 ℃避光水浴90 min 后，雙蒸水洗3 次,干燥后用中性樹脂封固，光鏡下(放大100倍)對(duì)各組每孔中TRAP陽(yáng)性多核破骨細(xì)胞(≥3個(gè)核)進(jìn)行計(jì)數(shù),并攝片記錄。

2.5RT-PCR檢測(cè) 每培養(yǎng)孔加1.0 mL Trizol混勻，以一步法抽提總RNA，紫外分光光度法檢測(cè)RNA濃度和純度，計(jì)算各組A260/A280比值(> 1.8)。逆轉(zhuǎn)錄體系含RNA 1 μg，dNTP 2.0 μL，Oligo (dT)1 μL，M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL，4×107U/L RNasin 0.25 μL，DEPC水補(bǔ)充至20 μL，42 ℃ 60 min，70 ℃10 min完成逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系為Platinum PCR SuperMix 13 μL，cDNA 1 μL，引物1 μL。反應(yīng)條件為94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，退火溫度30 s，72 ℃ 1 min，36個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min。以β-actin為內(nèi)參照，PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，掃描條帶后用Quantity One軟件，以目的條帶與內(nèi)參照條帶吸光度值之比作為目的基因mRNA相對(duì)含量，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。各引物和退火溫度見表1。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

表1RT-PCR引物及退火溫度

Table 1. Primers and annealing temperatures for RT-PCR

GenePrimersequenceTm(℃)β-actin(602bp)5’-gccatcctgcgtctggacctg-3’5’-catttgcggtgcacgatggag-3’58CathepsinK(324bp)5’-gggccaggatgaaagttgta-3’5’-ccgagccaagagagcatatc-3’55TRAP(101bp)5’-caccctgagatttgtggctgt-3’5’-cggttctggcgatctctttg-3’60

結(jié) 果

1Westernblotting法檢測(cè)sRANKL蛋白表達(dá)

RPMI 8226細(xì)胞表達(dá)跨膜型RANKL(mRANKL,43 kD)和 sRANKL (24 kD)。50×RPMI 8226細(xì)胞濃縮條件培養(yǎng)液發(fā)現(xiàn)sRANKL (24 kD)表達(dá)。但1×RPMI 8226細(xì)胞條件培養(yǎng)液未見表達(dá)，見圖1。

Figure 1. The expression of sRANKL protein detected by Western blotting. Lane 1:1×RPMI 8226 cell conditioned medium; Lane 2:RPMI 8226 cells; Lane 3:50×RPMI 8226 cell conditioned medium.

圖1Westernblotting檢測(cè)sRANKL蛋白的表達(dá)

2TRAP染色觀察RAW264.7細(xì)胞形態(tài)

TRAP染色觀察無(wú)誘導(dǎo)空白組RAW264.7細(xì)胞胞體較小，大部分細(xì)胞呈TRAP陰性單核細(xì)胞，少數(shù)為TRAP陽(yáng)性的單核或多核細(xì)胞。rhRANKL、RPMI 8226細(xì)胞條件培養(yǎng)液和MG-63細(xì)胞條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)組成熟破骨細(xì)胞數(shù)量明顯增多，胞體較大，形態(tài)不規(guī)則，呈油煎蛋形或漏斗形等，具有幾個(gè)到幾十個(gè)不等的細(xì)胞核(≥3個(gè))，細(xì)胞邊緣見偽足樣突起，胞漿呈空泡狀，胞漿TRAP活性部位呈玫瑰紅色，細(xì)胞核為陰性，即為TRAP陽(yáng)性多核成熟破骨細(xì)胞。加RANKL mAb組與無(wú)單抗組相比，TRAP陽(yáng)性的多核細(xì)胞形態(tài)相似，但數(shù)量明顯減少，見圖2。

3TRAP陽(yáng)性的多核破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)

3.1100 μg/L rhRANKL、30% RPMI 8226細(xì)胞條件培養(yǎng)液與30% MG-63細(xì)胞條件培養(yǎng)液對(duì)RAW264.7細(xì)胞的誘導(dǎo)作用 3組條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)的TRAP陽(yáng)性多核破骨細(xì)胞數(shù)和空白組比較有顯著差別，P<0.01。100 μg/L rhRANKL誘導(dǎo)組比其它兩誘導(dǎo)組有明顯差異(P<0.01)，見圖3。

3.21 mg/L RANKL mAb抑制30% RPMI 8226細(xì)胞條件培養(yǎng)液與100 μg/L rhRANKL對(duì)RAW264.7細(xì)胞的誘導(dǎo)作用 1 mg/L RANKL mAb抑制30% RPMI 8226細(xì)胞條件培養(yǎng)液和100 μg/L rhRANKL誘導(dǎo)的TRAP陽(yáng)性多核破骨細(xì)胞數(shù)明顯低于不加抗體組(P<0.01)。1 mg/L RANKL mAb阻斷30%RPMI 8226細(xì)胞條件培養(yǎng)液組與空白組無(wú)差別；而1 mg/L RANKL mAb阻斷100 μg/L rhRANKL組相比空白組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

Figure 2. The morphological changes of RAW264.7 cells(TRAP staining,×100). A：control；B：100 μg/L rhRANKL；C：30%RPMI 8226 cell conditioned medium；D：30%MG-63 cell conditioned medium；E：100 μg/L rhRANKL +1 mg/L RANKL mAb；F：30%RPMI 8226 cell conditioned medium +1 mg/L RANKL mAb；G：30%RPMI 8226 cell conditioned medium +0.6 mg/L RANKL mAb.

圖2RAW264.7細(xì)胞株TRAP染色形態(tài)圖

圖3RPMI8226與MG-63細(xì)胞條件培養(yǎng)液、rhRANKL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分化成熟的作用

3.3不同濃度RANKL mAb阻斷30% RPMI 8226細(xì)胞條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分化的作用 0.6、1、1.5 mg/L RANKL mAb抑制組顯著抑制30% RPMI 8226細(xì)胞條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化成熟作用(P<0.01)。0.06 mg/L RANKL mAb抑制組也具有明顯抑制作用(P<0.05)。0.00006、0.0006與0.006 mg/L RANKL mAb抑制組則阻斷效果不明顯(P>0.05)，見圖5。

圖41mg/LRANKLmAb抑制30%RPMI8226細(xì)胞條件培養(yǎng)液與100μg/LrhRANKL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分化成熟的作用

圖5RANKLmAb濃度依賴性阻斷30%RPMI8226條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)分化作用的量效關(guān)系

4RAW264.7細(xì)胞的TRAP與cathepsinKmRNA表達(dá)

4.1TRAP mRNA表達(dá) 30% MG-63細(xì)胞條件培養(yǎng)液組、30% RPMI 8226細(xì)胞條件培養(yǎng)液組、100 μg/L rhRANKL組和30% RPMI 8226細(xì)胞條件培養(yǎng)液+0.6 mg/L mAb組的TRAP mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于空白組，P<0.01。30% RPMI 8226細(xì)胞條件培養(yǎng)液+1 mg/L RANKL mAb組比其無(wú)抗體組TRAP表達(dá)量低(P<0.05)，見圖6。

4.2Cathepsin K mRNA表達(dá) 30% RPMI 8226細(xì)胞條件培養(yǎng)液組、30% RPMI 8226細(xì)胞條件培養(yǎng)液+0.6 mg/L和1 mg/L RANKL mAb組、100 μg/L rhRANKL組、100 μg/L rhRANKL +1 mg/L RANKL mAb組和30% MG-63細(xì)胞條件培養(yǎng)液組與空白組相比，cathepsin K mRNA表達(dá)增高(P<0.05)。其余組間均無(wú)顯著差異，見圖7。

討 論

多發(fā)性骨髓瘤起源于早期前B細(xì)胞惡性克隆，表現(xiàn)為骨質(zhì)破壞、反復(fù)感染、高鈣血癥、貧血和腎功能不全等。骨髓瘤微環(huán)境中RANKL/OPG比例嚴(yán)重失衡，RANKL過度表達(dá)，OPG表達(dá)和活性降低，導(dǎo)致破骨細(xì)胞功能增強(qiáng)，骨損傷加重[5]。近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者針對(duì)RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)進(jìn)行靶向治療研究，如 Reuter等[6]報(bào)道信筒子醌能通過抑制RANKL來阻止骨髓瘤誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化成熟。王藝華等[7]報(bào)道馬錢子堿能抑制骨髓瘤細(xì)胞對(duì)成骨細(xì)胞株RANKL的mRNA表達(dá),上調(diào)堿性磷酸酶、骨鈣蛋白及OPG的mRNA表達(dá)，證明馬錢子堿對(duì)骨髓瘤的治療效果優(yōu)于硼替佐米。但至今仍未有公認(rèn)的RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)靶向藥物應(yīng)用于骨髓瘤。本實(shí)驗(yàn)為此建立細(xì)胞模型, 研究RANKL在人骨髓瘤細(xì)胞RPMI 8226條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分化成熟影響中的作用,并且為今后靶向治療奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

圖6各組TRAPmRNA表達(dá)

圖7各組誘導(dǎo)cathepsinKmRNA表達(dá)

本實(shí)驗(yàn)采用單克隆抗體免疫沉淀法證實(shí)RPMI 8226細(xì)胞表達(dá)RANKL蛋白(包括mRANKL和sRANKL)，但檢測(cè)不到1×108/L RPMI 8226細(xì)胞條件培養(yǎng)液sRANKL蛋白表達(dá)，再將細(xì)胞培養(yǎng)液經(jīng)超濾管濃縮50倍后可檢測(cè)到sRANKL蛋白。同時(shí)以MG-63細(xì)胞[8]條件培養(yǎng)液與rhRANKL為陽(yáng)性對(duì)照，發(fā)現(xiàn)RPMI 8226細(xì)胞能明顯誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分化為TRAP陽(yáng)性的多核破骨細(xì)胞。這與Lai等[9]報(bào)道的人骨髓瘤細(xì)胞NCI-H929和U266的條件培養(yǎng)液能誘導(dǎo)人骨髓單個(gè)核細(xì)胞分化為TRAP陽(yáng)性的多核破骨細(xì)胞一致。同時(shí)1 mg/L人抑制性RANKL單克隆抗體能顯著阻斷30%RPMI 8226細(xì)胞條件培養(yǎng)液與100 μg/L rhRANKL誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞分化成熟作用，證明RPMI 8226細(xì)胞條件培養(yǎng)液中起誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化作用的重要成分為sRANKL。

高濃度抑制性RANKL單克隆抗體(0.6、1、1.5 mg/L)能顯著抑制30%RPMI 8226細(xì)胞條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)破骨前體細(xì)胞分化成熟作用。中等濃度RANKL抗體(0.06 mg/L)也具抑制作用(P<0.05)。低濃度RANKL抗體(0.00006、0.0006、0.006 mg/L)抑制效果不明顯。說明人抑制性RANKL單克隆抗體阻斷30%RPMI 8226細(xì)胞條件培養(yǎng)液中sRANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化成熟作用具有劑量依賴性。

本實(shí)驗(yàn)RT-PCR法顯示RAW264.7細(xì)胞未受誘導(dǎo)時(shí)就表達(dá)破骨細(xì)胞表型基因TRAP與骨吸收功能相關(guān)基因cathepsin K。30% RPMI 8226細(xì)胞條件培養(yǎng)液能刺激RAW264.7細(xì)胞上調(diào)TRAP和cathepsin K mRNA表達(dá)，與rhRANKL和MG-63細(xì)胞對(duì)照組相似。1 mg/L 人抑制性RANKL單克隆抗體抑制30% RPMI 8226細(xì)胞條件培養(yǎng)液組TRAP mRNA表達(dá)低于無(wú)抗體組，這與TRAP染色實(shí)驗(yàn)中該干預(yù)組誘導(dǎo)TRAP陽(yáng)性破骨細(xì)胞減少的結(jié)果一致。但cathepsin K mRNA受人抑制性RANKL單克隆抗體抑制作用不明顯。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了多發(fā)性骨髓瘤RPMI 8226細(xì)胞條件培養(yǎng)液中所含的sRANKL具有促使RAW264.7細(xì)胞分化成TRAP陽(yáng)性多核成熟破骨細(xì)胞的生物活性，且人抑制性RANKL單克隆抗體阻斷30%RPMI 8226細(xì)胞條件培養(yǎng)液中sRANKL的誘導(dǎo)分化作用具有濃度依賴性。這一發(fā)現(xiàn)將為探索多發(fā)性骨髓瘤骨病的分子機(jī)理以及尋找治療新靶點(diǎn)提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為廣大骨髓瘤患者造福。

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EffectofconditionedmediumofhumanmultiplemyelomaRPMI8226cellsonosteoclastogenesisofRAW264.7cells

TANG Li-yuan1, XU Yu2, CHEN Jin2, LIU Xin-hua3, YU Kang1

(1DepartmentofHematology,TheFirstAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalCollege;2WenzhouMedicalCollege,3HematologicMalignanciesandTransplantationImmunityResearchCenterofWenzhouMedicalCollege,Wenzhou325000,China.E-mail:yukang62@126.com)

AIM: To investigate the osteoclastogenic effect of conditioned medium of human multiple myeloma RPMI 8226 cells on preosteoclast RAW264.7 cells.METHODSThe protein expression of soluble receptor activator of NF-κB ligand (sRANKL) was detected by Western blotting. The morphological changes of RAW264.7 cells were observed after tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) staining. The mRNA expression of TRAP and cathepsin K was evaluated by RT-PCR.RESULTSThe result of Western blotting showed that conditioned medium of RPMI 8226 cells contained sRANKL. RPMI 8226 cell conditioned medium induced RAW264.7 cells to differentiate into TRAP-positive multinuclear osteoclasts. Human neutralized RANKL monoclonal antibody suppressed the differentiation of preosteoclasts in a dose-dependent manner, which was induced by 30% RPMI 8226 cell conditioned medium. RPMI 8226 cell conditioned medium increased the mRNA expression of TRAP and cathepsin K in RAW264.7 cells.CONCLUSIONThe sRANKL in conditioned medium of human multiple myeloma RPMI 8226 cells has the bioactivity to induce preosteoclast RAW264.7 cells to differentiate into TRAP-positive multinuclear osteoclasts. Human neutralized RANKL monoclonal antibody suppresses the differentiation of preosteoclasts induced by sRANKL in a dose-dependent manner.

Multiple myeloma; Osteoclast; Receptor activator of NF-κB ligand

R733.3

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.04.013