王順清， 鐘雯婷， 鄧 暉， 毛 平， 許艷麗

(廣州醫(yī)學(xué)院附屬市一人民醫(yī)院 1血液科，2輸血科， 廣東 廣州 510180)

1000-4718(2012)04-0730-04

2011-03-31

2012-03-08

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.30871101)；廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技重點資助項目(No.2006-ZDi-02)

△通訊作者 Tel：020-81048386；E-mail：drwangshq@medmail.com.cn

應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)篩選與RANK蛋白新基序IVVY相互作用的蛋白*

王順清1△， 鐘雯婷1， 鄧 暉2， 毛 平1， 許艷麗1

(廣州醫(yī)學(xué)院附屬市一人民醫(yī)院1血液科，2輸血科， 廣東 廣州 510180)

目的應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)篩選小鼠巨噬細(xì)胞中與核因子κB受體激活因子(RANK)蛋白上新基序IVVY相互作用的蛋白，以探尋RANKL/RANK系統(tǒng)中介導(dǎo)破骨細(xì)胞形成的RANK下游新信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白。方法應(yīng)用GAL4酵母雙雜交系統(tǒng)3，構(gòu)建僅包含編碼新基序535IVVY538的一小段RANK的cDNA片段為誘餌質(zhì)粒pGBKT7-IVVY，并與巨噬細(xì)胞cDNA文庫質(zhì)粒pGADT7-library共轉(zhuǎn)化AH109酵母，篩選與RANK蛋白新基序IVVY相互作用的蛋白，通過回復(fù)性雜交實驗驗證其可靠性，并對陽性克隆進(jìn)行測序和基因同源性分析。結(jié)果篩選出4個可能與IVVY基序有相互作用的蛋白，包括Ring1和YY1結(jié)合蛋白(RYBP)、ATP結(jié)合盒、E2F轉(zhuǎn)錄因子和熱休克蛋白8，其中表達(dá)RYBP的陽性克隆出現(xiàn)頻率高、速度快。結(jié)論應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)成功地篩選出4個可能與IVVY基序相互作用的候選蛋白，其中RYBP可能性最大。

酵母雙雜交； RANKL/RANK系統(tǒng)； IVVY基序； 相互作用蛋白質(zhì)

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)占血液系統(tǒng)惡性腫瘤的10%～15%，其突出的臨床特點之一就是進(jìn)行性骨質(zhì)破壞，稱之為骨髓瘤骨病(myeloma bone disease，MBD)，其治療方法和療效均有限，是影響MM患者生存質(zhì)量和預(yù)后的重要因素之一。研究發(fā)現(xiàn)骨髓瘤患者核因子κB受體激活因子配體(receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand，RANKL)表達(dá)異常增高，致使RANKL與它的受體—核因子κB受體激活因子(receptor activator of nuclear factor-kappa B，RANK)組成的RANKL/RANK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)過度激活，促使大量巨噬細(xì)胞分化形成破骨細(xì)胞，這種破骨細(xì)胞生成過多且功能亢進(jìn)在骨髓瘤骨病發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用，因此抑制RANKL/RANK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑從而抑制破骨細(xì)胞的形成及其破骨功能是治療骨髓瘤骨病最有效方法之一[1]。深入研究RANKL/RANK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及其轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，針對 RANKL/RANK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中各信號蛋白來研究、開發(fā)新的 MBD 治療藥物是研究的熱點之一。我們前期的研究在RANK蛋白上鑒定出一個全新的基序——535IVVY538，它是破骨細(xì)胞形成所必需的位點，且介導(dǎo)了一條新的破骨細(xì)胞形成所必需的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[2]。為進(jìn)一步研究此信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，我們已成功構(gòu)建出高質(zhì)量的適合酵母雙雜交實驗的小鼠巨噬細(xì)胞cDNA 文庫[3]，本研究旨在利用酵母雙雜交技術(shù)篩選和找出與IVVY基序相互作用的RANK下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白。

材 料 和 方 法

1材料

1.1載體與菌株 大腸桿菌DH5α購自Invitrogen，酵母AH109 菌株、pGBKT7 和pGADT7 質(zhì)粒均購自Clontech。

1.2誘餌質(zhì)粒和cDNA文庫 本課題組已成功構(gòu)建高質(zhì)量小鼠巨噬細(xì)胞cDNA酵母表達(dá)文庫pGADT7 - library, 稱AD/library。PCR擴增包含編碼新基序535IVVY538的一小段小鼠RANK的cDNA片段(編碼498～556號共59個氨基酸)，克隆到pGBKT7載體，構(gòu)建出誘餌質(zhì)粒pGBKT7-IVVY，稱DNA-BD/bait。

1.3主要試劑 酵母雙雜交系統(tǒng)(MatchmakerTMGAL4 Two-Hybrid System 3，包含pGBKT7 和pGADT7 質(zhì)粒等)、酵母質(zhì)粒提取試劑盒(Easy Yeast Plasmid Isolation Kit)、酵母轉(zhuǎn)化系統(tǒng)(YeastmakerTMYeast Transformation System 2)、酵母YPDA培養(yǎng)基、SD/-Trp 、SD/-Leu、SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp、X-α-半乳糖苷酶(X-α-galactosidase, X-α-Gal)、抗c-Myc和HA-Tag抗體等購自Clontech。大腸桿菌質(zhì)粒提取試劑盒購自Qiagen。限制性內(nèi)切酶和連接酶等購自NEB。其它試劑購自Sigma。

2方法

2.1AD/library及DNA-BD/bait自激活活性檢測 按照Clontech公司的說明書，利用標(biāo)準(zhǔn)PEG/LiAc方法分別轉(zhuǎn)化誘餌質(zhì)粒DNA-BD/bait和巨噬細(xì)胞cDNA文庫質(zhì)粒AD/library至酵母菌AH109，轉(zhuǎn)化子再分別鋪皿于SD /-Trp/X-α-Gal 和SD /-Leu/X-α-Gal培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3～4 d，通過觀察酵母克隆是否生長、克隆大小及菌落顏色的變化，判斷誘餌和文庫質(zhì)粒是否有自激活活性。同時用載體pCL1和pGBKT7-53質(zhì)粒分別接種于SD /-Leu/X-α-Gal和SD /-Trp/X-α-Gal平板作為陽性和陰性對照組。

2.2AD/library及DNA-BD/bait在酵母中蛋白表達(dá)的檢測 分別挑取一個轉(zhuǎn)化了AD/library和DNA-BD/bait的酵母克隆接種于SD/-Leu和SD/-Trp液體培養(yǎng)基，于30 ℃振蕩培養(yǎng)、擴增后低溫低速離心收集，用Urea/SDS方法提取蛋白質(zhì)。用抗c-Myc和HA-Tag單抗行Western blotting，檢測AD/library及DNA-BD/bait質(zhì)粒在酵母中的蛋白質(zhì)表達(dá)情況；未轉(zhuǎn)化的酵母AH109為陰性對照。

2.3AD/library及DNA-BD/bait共轉(zhuǎn)化酵母進(jìn)行篩庫 利用Clontech公司YeastmakerTMYeast Transformation System 2試劑盒，按說明書將AD/library及DNA-BD/bait共轉(zhuǎn)化AH109酵母感受態(tài)細(xì)胞，30 ℃培養(yǎng)90 min后，將菌液涂布于高選擇強度的SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal平板上，30 ℃培養(yǎng)、觀察7 d，篩選藍(lán)色的陽性克隆。

2.4假陽性克隆的剔除及候選陽性質(zhì)粒與誘餌質(zhì)粒在酵母內(nèi)相互作用的驗證 挑取所有單菌落的陽性克隆，在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal平板上反復(fù)、連續(xù)傳代3次，3次均呈陽性的克隆再接種于SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp液體培養(yǎng)基，用酵母質(zhì)粒提取試劑盒(Easy Yeast Plasmid Isolation Kit)提取酵母內(nèi)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中擴增，用Qiagen公司試劑盒抽提、純化大腸桿菌質(zhì)粒。然后，所獲得的候選陽性質(zhì)粒一對一與誘餌質(zhì)粒DNA-BD/bait共轉(zhuǎn)化酵母菌AH109，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-Gal平板, 不能生長或生長菌落呈白斑者作為假陽性剔除。這樣也在酵母內(nèi)進(jìn)一步驗證了所篩選出的陽性質(zhì)粒與誘餌質(zhì)粒的相互作用。

2.5陽性克隆的鑒定、分析 上述最后篩選出來的陽性質(zhì)粒，一方面用限制性內(nèi)切酶BsrGⅠ酶切、1%瓊脂糖凝膠中電泳，根據(jù)片段大小進(jìn)行分類；另一方面將陽性質(zhì)粒進(jìn)行測序, 在GenBank中進(jìn)行同源性比對分析。

結(jié) 果

1AD/library及DNA-BD/bait自激活活性檢測

如圖1所示，陽性對照組pCL1質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子在SD/-Leu/X-α-Gal平板見藍(lán)色克隆生長，陰性對照pGBKT7-53質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子在SD/-Trp/X-α-Gal平板見白色克隆生長；AD/library及DNA-BD/bait質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子分別在SD/-Leu/X-α-Gal和SD/-Trp/X-α-Gal平板上出現(xiàn)白色克隆生長；而且4種轉(zhuǎn)化子的克隆生長良好，直徑>2 mm，說明AD/library及DNA-BD/bait表達(dá)的蛋白無自激活活性。

Figure 1. Detection of autonomous activation of AD/library and DNA-BD/bait.Only positive control pCL1 showed blue colonies. Like negative control pGBKT7-53, AD/library and DNA-BD/bait showed white colonies.

圖1AD/library及DNA-BD/bait自激活活性檢測

2AD/library及DNA-BD/bait在酵母中蛋白表達(dá)的檢測

從AD/library及DNA-BD/bait的克隆轉(zhuǎn)化菌提取蛋白質(zhì)，經(jīng)Western blotting分析，分別檢測到相應(yīng)的HA和c-Myc標(biāo)記的融合蛋白，見圖2。

Figure 2. Detection of the expression of HA- and c-Myc- fusing protein in yeast.

圖2酵母中HA和c-Myc融合蛋白表達(dá)的檢測

3酵母的共轉(zhuǎn)化篩庫和候選陽性質(zhì)粒的提取

我們共進(jìn)行了3輪AD/library和DNA-BD/bait的酵母

AH109共轉(zhuǎn)化，直接在高選擇強度的SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-Gal平板上進(jìn)行篩庫實驗，總共篩選出25個陽性的藍(lán)色克隆，將這25個克隆反復(fù)3次在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal平板上接種傳代得到18個陽性的藍(lán)色克隆。提取這18個陽性酵母克隆中的質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中擴增后提取和純化出來，此過程中丟失4個陽性克隆的質(zhì)粒，最后獲得14個候選的陽性質(zhì)粒，編號為1～14。

4候選陽性質(zhì)粒與DNA-BD/bait相互作用的驗證

將篩選出的14個候選陽性質(zhì)粒一對一與DNA-BD/bait共轉(zhuǎn)化AH109 酵母感受態(tài)，菌液鋪于SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal平板上篩選。有4個沒有克隆形成，為假陽性克隆，最后獲得10個陽性的候選質(zhì)粒，見圖3。

Figure 3. Verification of the interaction between candidate positive plasmids and DNA-BD/bait.No clone formed when 4 of all 14 candidate plasmids (No.6,12,13,14) and DNA-BD/bait were used to co-transform yeast strain AH109.They were false positive clones.

圖3候選陽性質(zhì)粒與DNA-BD/bait相互作用的驗證

5候選質(zhì)粒的分析和鑒定

候選質(zhì)粒用BsrGⅠ酶切后電泳分析，其中6個質(zhì)粒有相似的插入片段,另有2個質(zhì)粒有相似大小的插入片段，其余2個各不相同。對這10個質(zhì)粒的插入片段行DNA測序，在GenBank中進(jìn)行同源性分析，結(jié)果與酶切分析一致，如表1所示，其中6個DNA序列完全一樣，編碼Ring1和YY1結(jié)合蛋白(Ring1 and YY1 binding protein，RYBP)；有2個DNA序列完全一樣，編碼ATP結(jié)合盒(ATP-binding cassette)；其余2個分別為編碼E2F轉(zhuǎn)錄因子(E2F transcription factor)和熱休克蛋白8 (heat-shock protein 8)的基因。而且，檢查實驗結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，表達(dá)RYBP蛋白的陽性克隆出現(xiàn)最快。

表1 候選質(zhì)粒的同源性分析

討 論

酵母雙雜交系統(tǒng)是Fields等[4]建立的一種檢測蛋白-蛋白相互作用實驗技術(shù)，其基本原理是：典型的真核生物轉(zhuǎn)錄因子，如GAL4、GCN4等含有2個不同的結(jié)構(gòu)域：DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-binding domain，BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(transcription-activating domain，AD)，二者可以從核酸一級結(jié)構(gòu)上分開而獨立表達(dá)出有功能的結(jié)構(gòu)域，這2個結(jié)構(gòu)域只要在同一細(xì)胞內(nèi)能夠彼此靠近，就可以激活下游報告基因的表達(dá)。因此將誘餌蛋白融合到一個結(jié)構(gòu)域上(如BD-bait)，而將表達(dá)文庫構(gòu)建到另一個結(jié)構(gòu)域上(如AD-library)，就可以篩選到與誘餌蛋白相互作用的蛋白。酵母雙雜交技術(shù)是目前應(yīng)用較多的釣取與已知蛋白直接相互作用分子的方法。

RANKL/RANK系統(tǒng)涉及多種生理功能，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)雜。本研究是要在鑒定出的RANK蛋白上介導(dǎo)破骨細(xì)胞形成所必需新基序535IVVY538的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究此基序介導(dǎo)的新的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，目的是要篩選直接與IVVY基序相互作用的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，因此只選擇了RANK基因上編碼包括IVVY基序在內(nèi)的一段cDNA片段(編碼498～556號氨基酸)來構(gòu)建誘餌質(zhì)粒，這樣誘餌蛋白只是包括IVVY在內(nèi)的59個氨基酸，可以盡量減少RANK蛋白上其它的結(jié)構(gòu)(如Motif 1～3等等)的干擾，使酵母雙雜交所篩選到的候選蛋白更能針對于IVVY基序，有利于減少整個實驗過程及結(jié)果分析的復(fù)雜性。

酵母雙雜交實驗中所用的cDNA文庫是我們專門為此研究構(gòu)建的[3]，來源于破骨細(xì)胞的前體細(xì)胞——巨噬細(xì)胞的mRNA，必然存在著豐富的介導(dǎo)巨噬細(xì)胞向破骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化的全套信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白基因；文庫平均滴度為3.24×109cfu/L，總?cè)萘窟_(dá)3.89×107cfu，平均插入片段為2.27 kb，重組率達(dá)95.83%，質(zhì)量高，為酵母雙雜交實驗打下堅實的基礎(chǔ)。

我們直接利用高選擇強度SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal進(jìn)行篩選，僅經(jīng)過3輪的篩庫，就得到10個陽性的候選質(zhì)粒，經(jīng)測序和同源比對分析，篩出4個可能與IVVY基序相互作用的候選蛋白。其中有6個是同一個基因，表達(dá)RYBP蛋白，它不僅出現(xiàn)的幾率最高，而且實驗中發(fā)現(xiàn)其陽性克”隆出現(xiàn)最快，提示它是可能性最大、相互作用最強的候選蛋白，下一步將首先展開重點研究，篩選到的其它候選蛋白也需進(jìn)一步分析和驗證。

RYBP是一個轉(zhuǎn)錄抑制因子，屬PcG(polycomb Group)蛋白家族成員之一，可與PcG蛋白復(fù)合體的其它成分如Ring1、M33以及其它轉(zhuǎn)錄因子如YY1、E2F等相互作用，通過PcG蛋白依賴性的表觀遺傳學(xué)機制，如啟動子區(qū)CpG島甲基化、組蛋白修飾(H3甲基化、H2A泛素化)等，調(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄活性，發(fā)揮多種生理或病理功能。RYBP基因敲除小鼠在胚胎期就死亡，RYBP表達(dá)缺陷會導(dǎo)致眼睛和中樞系統(tǒng)發(fā)育異常[5]。研究還證實RYBP參與細(xì)胞的增殖、分化以及凋亡等[6-7]，與生物體生長發(fā)育、腫瘤發(fā)生發(fā)展等密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)了RYBP可能通過IVVY基序與RANK蛋白相互作用，介導(dǎo)破骨細(xì)胞生成，這為進(jìn)一步研究RANKL/RANK信號系統(tǒng)介導(dǎo)破骨細(xì)胞形成的生理機制提供了一個切入點。但RYBP與RANK之間相互作用的具體途徑、機制等，有待于進(jìn)一步驗證和研究。

(致謝：本研究在美國阿拉伯馬大學(xué)伯明翰分校馮旭副教授的悉心指導(dǎo)和大力支持下完成，深表感謝！)

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ScreeningofproteinsinteractingwithIVVYmotifofRANKproteinbyyeasttwo-hybridtechnique

WANG Shun-qing1, ZHONG Wen-ting1, DENG Hui2, MAO Ping1, XU Yan-li1

(1DepartmentofHematology,2DepartmentofBloodTransfusion,GuangzhouFirstMunicipalPeople’sHospital,GuangzhouMedicalCollege,Guangzhou510180,China.E-mail:drwangshq@medmail.com.cn)

AIM: To explore the new downstream signal transduction proteins mediating osteoclast formation in RANKL/RANK system by the technique of yeast two-hybrid in mouse macrophages.METHODSUsing MatchmakerTMGAL4 Two-Hybrid System 3, a small piece of RANK cDNA which harbored a cDNA fragment coding a novel motif,535IVVY5381， was sub-cloned into pGBKT7 to construct the bait plasmid (named as pGBKT7-IVVY). The yeast strain AH109 co-transformed with pGBKT7-IVVY and a yeast expression macrophage cDNA library (pGADT7-library) was used to screen the proteins interacting with IVVY motif of RANK. Repeated yeast two-hybridization experiments were conducted to exclude the false positive clones and to verify the interactants. The positive clones were sequenced and analyzed with BLAST in NCBI.RESULTSFour candidate proteins probably interacting with IVVY were obtained, including Ring1 and YY1 binding protein (RYBP), ATP-binding cassette, E2F transcription factor and heat-shock protein 8. The clone coding RYBP was screened out frequently and quickly.CONCLUSIONFour candidate interactive proteins are successfully identified using yeast two-hybrid screening. RYBP is the most probable one.

Yeast two-hybrid; RANKL/RANK system; IVVY motif; Interactive protein

R733.3

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.04.027