腸源性內(nèi)毒素血癥在大鼠代謝綜合征相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制*

周 鑫， 韓德五△， 許瑞齡， 李素紅， 吳惠文， 趙元昌

(1山西醫(yī)科大學(xué)肝病研究所，山西 太原030001；2山西省腫瘤醫(yī)院病理科，山西 太原030013；3山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院，山西 汾陽 032200)

1000-4718(2012)03-0492-07

2011-10-17

2011-11-22

山西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.2008011073-1)

△通訊作者 Tel：0351-4135073；E-mail：xinxin6633@yeah.net

腸源性內(nèi)毒素血癥在大鼠代謝綜合征相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制*

周 鑫1， 韓德五1△， 許瑞齡1， 李素紅2， 吳惠文3， 趙元昌1

(1山西醫(yī)科大學(xué)肝病研究所，山西 太原030001；2山西省腫瘤醫(yī)院病理科，山西 太原030013；3山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院，山西 汾陽 032200)

目的探討腸源性內(nèi)毒素血癥(IETM)在代謝綜合征(MS)相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展中的作用及可能的分子機(jī)制。方法將64只大鼠隨機(jī)分為8組，分別是3月正常對(duì)照組(3C)、3月高糖高脂組(3H)、6月正常對(duì)照組(6C)、6月高糖高脂組(6H)、9月正常對(duì)照組(9C)、9月高糖高脂組(9H)、12月正常對(duì)照組(12C)和12月高糖高脂組(12H)。測(cè)定血漿脂多糖(LPS)、游離脂肪酸(FFA)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、巨噬細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、空腹血糖(FPG)和空腹胰島素(FINS)，并計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)。免疫組化方法觀察脂肪組織、肝組織和胰腺組織CD68表達(dá)水平；Western blotting測(cè)定肝組織、胰腺組織中JNK1、p-JNK1、NF-κB p65、IκB、GRP78蛋白表達(dá)水平。結(jié)果與正常對(duì)照組相比，各階段高糖高脂組的大鼠血清LPS、TNF-α、CRP、MCP-1、FPG、FINS和HOMA-IR的水平都升高，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；免疫組化結(jié)果顯示各階段高糖高脂組大鼠的脂肪組織、肝組織和胰腺組織CD68表達(dá)水平明顯升高，且隨時(shí)間推移加重；各階段高糖高脂組的大鼠肝組織p-JNK1、NF-κB p65表達(dá)顯著高于正常組，而IκB表達(dá)顯著低于正常組；高糖高脂組的大鼠胰腺組織p-JNK1和NF-κB p65的表達(dá)于第6個(gè)月開始升高，第9個(gè)月、第12個(gè)月達(dá)到高峰，而IκB的表達(dá)也于第6個(gè)月開始降低。結(jié)論IETM可能在MS相關(guān)的代謝性疾病中發(fā)揮著重要的作用，NF-κB、JNK和GRP78信號(hào)可能參與了上述過程。

腸源性內(nèi)毒素血癥； 代謝綜合征； 非酒精性脂肪性肝??； 糖尿病，2型； 胰島素抵抗

在前期實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，大鼠經(jīng)過高糖高脂飲食喂養(yǎng)1年，先后出現(xiàn)了非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)和Ⅱ型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)等代謝綜合征(metabolic syndrome,MS)相關(guān)的代謝性疾病，并且結(jié)合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)判斷認(rèn)為是NAFLD誘發(fā)了T2DM[1],這可能是因?yàn)樵谥靖魏头蔷凭灾拘愿窝?non-alcoholic steatohepatitis，NASH)階段已出現(xiàn)腸源性內(nèi)毒素血癥(intestinal endotoxemia，IETM)和由此產(chǎn)生的胰島素抵抗與炎癥反應(yīng)，為T2DM發(fā)生作了鋪墊。近年來國外也有多篇文獻(xiàn)報(bào)道LPS在NASH發(fā)病機(jī)制中具有重要作用[2-4]，因此我們?cè)O(shè)想LPS在NAFLD、T2DM等MS相關(guān)代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。為此，我們?cè)O(shè)計(jì)了以下實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討LPS在MS相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展中可能的作用及其分子機(jī)制。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動(dòng)物 Sprague-Dawley大鼠64只，雌雄各半，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2主要試劑及儀器 脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)顯色基質(zhì)鱟試劑盒、腫瘤壞死因子α(tumour necrosis factor alpha，TNF-α)放免試劑盒、C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)ELISA試劑盒、巨噬細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)ELISA試劑盒、胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)放免試劑盒、血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)PG)試劑盒、兔抗CD68多克隆抗體及SABC免疫組化試劑盒購自北京中衫生物科技有限公司；c-Jun氨基末端激酶(c-Jun amino-terminal kinase，JNK)、磷酸化c-Jun氨基末端激酶(phosphorylated c-Jun amino-terminal kinase，p-JNK)、核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)、核因子κB抑制蛋白(inhibitory subunit of nuclear factor κB,IκB)和葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(glucose-regulated protein 78,GRP78)抗體均購自Cell Signaling Technology；721分光光度計(jì)購自上海第三分析儀器廠；SN-684型放免γ計(jì)數(shù)器購自上海核所日環(huán)光電儀器有限公司。

2方法

2.1動(dòng)物分組及模型的建立 64只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為8組(n=8)：3月正常對(duì)照組(normal control group of 3 months,3C)、6月正常對(duì)照組(normal control group of 6 months,6C)、9月正常對(duì)照組(normal control group of 9 months,9C)和12月正常對(duì)照組(normal control group of 12 months,12C)以正常飲食喂養(yǎng)；3月高糖高脂組(high-sucrose and high-fat diet group of 3 months,3H)、6月高糖高脂組(high-sucrose and high-fat diet group of 6 months,6H)、9月高糖高脂組(high-sucrose and high-fat diet group of 9 months,9H)和12月高糖高脂組(high-sucrose and high-fat diet group of 12 months,12H)采用高糖高脂膳食(70%正常飼料+20%豬油+10%蔗糖+1%膽固醇+0.25%膽酸)喂養(yǎng)。正常組總熱量13.89 kJ/g,模型組總熱量68.40 kJ/g。上述各組動(dòng)物均在天黑前投食，自由飲水，每月稱體重1次。分別于實(shí)驗(yàn)第3月末、第6月末、第9月末、第12月末處死相應(yīng)階段的正常組及高糖高脂組大鼠，采腹主動(dòng)脈血，3 500 r/min離心備用。

2.2生化指標(biāo)檢測(cè) 測(cè)定血漿LPS、TNF-α、CRP、MCP-1、FPG、FINS，計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment-insulin resistance，HOMA-IR)：HOMA-IR=(FPG×FINS)/22.5。

3免疫組化方法檢測(cè)

檢測(cè)內(nèi)臟脂肪組織、肝組織和胰腺組織中CD68(巨噬細(xì)胞分子標(biāo)記)的表達(dá)情況。CD68陽性表達(dá)胞漿呈黃色或棕黃色。在400倍光鏡下，每組取5張，每張取5個(gè)視野，運(yùn)用Image-Pro Plus 6.0軟件分析，棕色陽性染色顆粒以(CD68+細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%表示。

4Westernblotting檢測(cè)

檢測(cè)肝組織、胰腺組織中 JNK1、p-JNK1、NF-κB p65、IκB和GRP78的表達(dá)。

5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1LPS及MS相關(guān)的炎癥介質(zhì)變化

表1顯示，模型組大鼠血清LPS、TNF-α、CRP和MCP-1從實(shí)驗(yàn)第3個(gè)月開始持續(xù)增高至第12月末，但在各階段之間未見明顯差異。

表1 LPS、FFA及MS相關(guān)的炎性介質(zhì)變化

*P<0.05vs3C group;△P<0.05vs3H group.3C，6C，9C and 12C represent control rats in 3,6,9 and 12 months, respectively; 3H，6H，9H and 12H represent high-sucrose and high-fat diet for 3,6,9 and 12 months，respectively.

2FINS、FPG和HOMA-IR的結(jié)果

表2顯示，模型組各階段大鼠與正常組相比，血漿FINS和FPG明顯升高且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，胰島素抵抗指數(shù)與正常組相比均有顯著差異(P<0.05)。

表2大鼠FBS、FINS和HOMA-IR的變化

*P<0.05vs3C group;△P<0.05vs3H group;#P<0.05vs6H group;▲P<0.05vs9H group.

3免疫組化結(jié)果觀察

3.1脂肪組織 正常組大鼠脂肪組織無CD68陽性的單核細(xì)胞浸潤，見圖1A。高糖高脂組3月時(shí)可見脂肪組織內(nèi)少許CD68陽性的巨噬細(xì)胞，見圖1B；6月時(shí)較多巨噬細(xì)胞浸潤至脂肪組織，見圖1C；9月時(shí)脂肪組織中較多巨噬細(xì)胞浸潤，且脂肪組織血管周圍不斷有單核細(xì)胞游出，見圖1D、F;12月時(shí)脂肪組織內(nèi)大量巨噬細(xì)胞浸潤，且脂肪組織血管周圍有成團(tuán)單核細(xì)胞游出，見圖1E、G；高糖高脂組各時(shí)段CD68陽性表達(dá)與同時(shí)段對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3大鼠脂肪組織、肝臟和胰腺巨噬細(xì)胞浸潤的情況

GroupAdiposetissueCD68+LivertissueCD68+PancreaticCD68+3C0.00±0.001.14±1.790.00±0.003H6.81±1.35*16.96±2.42*0.00±0.006C0.00±0.001.89±2.280.00±0.006H11.13±3.57*△28.43±10.13*△2.60±0.74*△9C0.00±0.003.02±2.490.00±0.009H17.52±3.54*△#29.67±3.98*△14.73±1.75*△#12C0.00±0.004.07±2.740.00±0.0012H17.07±3.56*△#30.67±3.22*△20.79±1.65*△#▲

*P<0.05vs3C group;△P<0.05vs3H group;#P<0.05vs6H group;▲P<0.05vs9H group.

Figure 1. CD68 expression in adipose tissue of rats in each group(immunohistochemical staining,×400). A: normal control; B,C,D,E: high-sucrose and high-fat diet for 3, 6, 9 and 12 months, respectively;F, G: CD68 expression in perivascular area in adipose tissue of rats exposed to high-sucrose and high-fat diet for 9 and 12 months,respectively.

圖1正常和高糖高脂組大鼠脂肪組織中CD68的表達(dá)

3.2肝組織 正常組大鼠肝組織僅有極少量CD68陽性的巨噬細(xì)胞浸潤，見圖2A。高糖高脂組3月時(shí)可見肝組織內(nèi)少量CD68陽性的巨噬細(xì)胞，見圖2B；6月時(shí)大量巨噬細(xì)胞彌漫性浸潤肝組織，見圖2C；9月、12月時(shí)肝組織中仍有大量巨噬細(xì)胞浸潤，見圖2D、E；高糖高脂組各時(shí)段CD68陽性表達(dá)與同時(shí)段對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

3.3胰腺組織 正常組大鼠胰腺組織無CD68陽性的巨噬細(xì)胞浸潤，見圖3A。高糖高脂組3月時(shí)可見胰腺外分泌腺內(nèi)少量CD68陽性的巨噬細(xì)胞，見圖3B；6月時(shí)胰島周圍有少量巨噬細(xì)胞浸潤，見圖3C；9月、12月時(shí)胰島內(nèi)有大量巨噬細(xì)胞浸潤，見圖3D、E；高糖高脂組各時(shí)段CD68陽性表達(dá)與同時(shí)段對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且高糖高脂組各時(shí)段間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

Figure 2. CD68 expression in liver tissue of rats in each group(immunohistochemical staining,×200). A: normal control; B,C,D,E: high-sucrose and high-fat diet for 3, 6, 9 and 12 months, respectively.

圖2正常和高糖高脂組大鼠肝組織中CD68的表達(dá)

Figure 3. CD68 expression in pancreas of rats in each group(immunohistochemical staining,×400). A: normal control; B,C,D,E: high-sucrose and high-fat diet for 3, 6, 9 and 12 months, respectively.

圖3正常和高糖高脂組大鼠胰腺組織中CD68的表達(dá)

4Westernblotting結(jié)果

4.1肝臟

4.1.1JNK1磷酸化的激活 模型組與正常組相比，JNK1的表達(dá)無明顯量的變化，而p-JNK1自3月開始活性升高，于6月升至最高值且持續(xù)到12月，與對(duì)照組差異明顯(P<0.05)，見圖4、表4。

4.1.2NF-κB的活化與IκB的降解 在靜息狀態(tài)下NF-κB與IκB結(jié)合, 處于非活化狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞受到內(nèi)毒素刺激時(shí),IκB磷酸化并與NF-κB分離, 導(dǎo)致NF-κB持續(xù)活化,并轉(zhuǎn)至胞核調(diào)控TNF-α等基因的表達(dá)。模型組NF-κB的表達(dá)自3月開始增強(qiáng)，于6月升至最高值且持續(xù)到12月，與對(duì)照組差異明顯(P<0.05)；而IκB的表達(dá)自3月開始減弱，于6月降至最低值且持續(xù)到12月，與對(duì)照組差異明顯(P<0.05)，見圖4、表4。

4.1.3GRP78的表達(dá) 模型組GRP78的表達(dá)自3月開始增強(qiáng)，于6月升至最高，雖9-12月表達(dá)略有下降，但仍保持較高水平，與對(duì)照組差異明顯(P<0.05),見圖4、表4。

4.2胰腺

4.2.1JNK1磷酸化的激活 模型組與正常組相比，JNK1的表達(dá)無明顯量的變化，而p-JNK1自6月開始活性升高，于9月升至最高值，12月表達(dá)雖略有下降，但仍保持較高水平，與對(duì)照組差異明顯(P<0.05),見圖5、表5。

4.2.2NF-κB的活化與IκB的降解 模型組NF-κB的表達(dá)自9月開始增強(qiáng)，于12月升至最高值，與對(duì)照組差異明顯(P<0.05)；而IκB的表達(dá)自9月開始減弱，于12月降至最低值，與對(duì)照組差異明顯(P<0.05)，見圖5、表5。

Figure 4. The expression of p-JNK1/JNK1,GRP78,NF-κB and IκB in the liver.NC: normal control; 3H,6H,9H,12H: high-sucrose and high-fat diet for 3, 6, 9 and 12 months, respectively.

圖4大鼠肝臟JNK1、p-JNK1、GRP78、NF-κB和IκB蛋白的表達(dá)

表4 大鼠肝臟p-JNK1 /JNK1、GRP78、NF-κB和IκB蛋白的表達(dá)

*P<0.05vsNC group;△P<0.05vs3H group;#P<0.05vs6H group;▲P<0.05vs9H group.

Figure 5. The expression of p-JNK1/JNK1,GRP78,NF-κB and IκB in the pancreas. NC: normal control; 3H,6H,9H,12H: high-sucrose and high-fat diet for 3, 6, 9 and 12 months, respectively.

圖5大鼠胰腺JNK1、p-JNK1、GRP78、NF-κB和IκB蛋白的表達(dá)

4.2.3GRP78的表達(dá) 正常組未見表達(dá)，模型組GRP78的表達(dá)自3月開始增強(qiáng)，于9月升至最高且持續(xù)至12月保持較高水平，與對(duì)照組差異明顯(P<0.05)，見圖5、表5。

5相關(guān)性分析

將每個(gè)階段LPS與HOMA-IR作相關(guān)分析，結(jié)果顯示LPS與HOMA-IR呈明顯正相關(guān)(3月：r=0.782，P<0.05)；(6月：r=0.953，P<0.01)；(9月：r=0.848，P<0.05)；(12月：r=0.867，P<0.05)。

討 論

我們采用高糖高脂喂養(yǎng)大鼠1年，大鼠先后出現(xiàn)非酒精性脂肪性肝病、Ⅱ型糖尿病[4]、動(dòng)脈粥樣硬化及其相關(guān)的心血管疾病(待發(fā)表)，證實(shí)這是貼近臨床實(shí)際的代謝綜合征的動(dòng)物模型。非酒精性脂肪性肝病、Ⅱ型糖尿病、高血壓病、動(dòng)脈粥樣硬化及其相關(guān)的心腦血管疾病等都與代謝綜合征密切相關(guān)。這一組疾病是以慢性低度炎癥為特征的代謝性疾病，其共同的基本發(fā)病機(jī)制是胰島素抵抗。而腸源性內(nèi)毒素血癥在其中發(fā)揮重要的作用。

表5 大鼠胰腺p-JNK1 /JNK1、GRP78、NF-κB和IκB蛋白的表達(dá)

*P<0.05vsNC group;△P<0.05vs3H group;#P<0.05vs6H group;▲P<0.05vs9H group.

大量研究表明，在NAFLD發(fā)病過程中均伴有腸源性內(nèi)毒素血癥，其原因與高糖高脂飲食喂養(yǎng)下腸內(nèi)細(xì)菌繁殖增多、腸粘膜通透性增加以及肝Kupffer細(xì)胞(KC)吞噬功能下降有關(guān)[5-7]。許多NAFLD動(dòng)物模型中都觀察到血漿LPS水平升高[3]，我們實(shí)驗(yàn)也證實(shí)NAFLD大鼠在單純脂肪肝階段血中LPS水平就升高，且在NAFLD的發(fā)展過程中始終保持高水平。另外，體外采用小劑量皮下注射LPS也可直接引起大鼠發(fā)生NASH與胰島素抵抗[8]。Harte等[9]通過對(duì)臨床患者長達(dá)半年到1年的觀察證實(shí)NAFLD患者循環(huán)血中LPS水平明顯升高， LPS水平的升高不取決于是否伴有T2DM，并且NAFLD各個(gè)階段LPS無明顯差別，這與我們的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，提示LPS在脂肪肝階段就已經(jīng)存在，并且在NAFLD的進(jìn)展中發(fā)揮作用，影響著T2DM和MS的發(fā)生發(fā)展。越來越多的證據(jù)顯示，血中升高的LPS在MS中具有重要作用[10-11]。Omar等[12]觀察了346名T2DM患者伴有IETM，并發(fā)現(xiàn)內(nèi)毒素與TG、葡萄糖、胰島素異常間有明顯相關(guān)性，證明T2DM患者亞臨床炎癥反應(yīng)是循環(huán)血內(nèi)毒素所介導(dǎo)。

LPS作用的靶器官主要涉及單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)和脂肪組織。在肝臟，LPS作用于KC通過形成TLR4-CD14復(fù)合物，激活NF-κB途徑導(dǎo)致炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-6等的大量釋放產(chǎn)生系統(tǒng)性的效果從而影響T2DM的發(fā)生[13]。目前認(rèn)為脂肪組織不僅僅參與代謝調(diào)節(jié)還參與免疫調(diào)節(jié)。脂肪組織中除了脂肪細(xì)胞還有為數(shù)不多的巨噬細(xì)胞。由于脂肪細(xì)胞儲(chǔ)存過多的甘油三酯，細(xì)胞脹大而毛細(xì)血管沒有相應(yīng)的增長，脂肪細(xì)胞缺氧而壞死釋放大量的脂肪細(xì)胞因子。這些細(xì)胞因子連同LPS促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞生成的趨化蛋白(如MCP-1)，后者把毛細(xì)血管內(nèi)的單核細(xì)胞吸引到炎癥部位形成新的巨噬細(xì)胞，我們免疫組化染色也觀察到第9個(gè)月、第12個(gè)月脂肪組織血管周圍有成團(tuán)的新游出的巨噬細(xì)胞。脂肪組織中新移居的巨噬細(xì)胞以及脂肪細(xì)胞都能被LPS激活，分泌的TNF-α、IL-6、IL-1等炎癥介質(zhì)一方面加重IR，另一方面啟動(dòng)系統(tǒng)性的炎癥反應(yīng)，對(duì)肝臟、胰腺及其它系統(tǒng)器官造成損傷。CD68是巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物，能較好地反映巨噬細(xì)胞的浸潤程度。我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在高糖高脂喂養(yǎng)早期大鼠即伴有IETM，且持續(xù)1年保持高水平，TNF-α、MCP-1、CRP水平同LPS變化趨勢(shì)一致。對(duì)脂肪組織、肝臟、胰腺進(jìn)行免疫組化染色，CD68呈陽性反應(yīng)，表明這些組織都有不同程度的巨噬細(xì)胞浸潤，因此提示LPS作用于這些新移居的巨噬細(xì)胞，使之釋放大量的致炎性細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，從而誘導(dǎo)MS相關(guān)疾病出現(xiàn)亞臨床的慢性低度炎癥。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 模型組大鼠出現(xiàn)了空腹高血糖和高胰島素血癥,并有明顯的胰島素抵抗 (IR)。相關(guān)分析顯示, 各個(gè)階段模型組大鼠的 LPS與 IR之間呈正相關(guān)。眾所周知, IR是MS相關(guān)疾病發(fā)生和發(fā)展的基礎(chǔ)。MS幾乎所有的組份如中心性肥胖、高血糖、血脂異常、高血壓等都是由IR所引起的。LPS可直接促進(jìn)脂肪分解，或通過TNF-α間接促進(jìn)脂肪分解,增加FFA的生成，使循環(huán)血漿FFA明顯增多。增高的FFA能使IRS1/2絲氨酸磷酸化，抑制胰島素受體酪氨酸激酶的活性,而導(dǎo)致IR的發(fā)生[14]。LPS作用于肝臟KC和脂肪組織中巨噬細(xì)胞形成TLR4-CD14復(fù)合物，激活NF-κB途徑導(dǎo)致炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-6等的大量釋放而導(dǎo)致IR發(fā)生。此外，LPS可以促進(jìn)活性氧(ROS)產(chǎn)生[15]，誘發(fā)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致IR的發(fā)生。研究已經(jīng)證實(shí)，內(nèi)毒素是重要的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激原，它可以通過未折疊蛋白和/或鈣聚集等多種途徑直接引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[16]，也可以通過氧化應(yīng)激間接誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激目前被認(rèn)為是代謝性疾病的炎癥基礎(chǔ)，是胰島素抵抗發(fā)生的關(guān)鍵機(jī)制。在慢性代謝性疾病如肥胖、胰島素抵抗和Ⅱ型糖尿病發(fā)生發(fā)展中至關(guān)重要。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激主要被錯(cuò)誤折疊蛋白反應(yīng)(UPR)所啟動(dòng)。UPR主要通過3個(gè)跨膜蛋白所介導(dǎo)，分別是PERK、IRE1α和ATF6。在靜息狀態(tài)下，3個(gè)跨膜蛋白都與分子伴侶GRP78結(jié)合形成蛋白復(fù)合體而維持無活性狀態(tài)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，這3個(gè)蛋白感受分子活化，同時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志物GRP78從跨膜蛋白脫落。UPR可激活多種通路，主要通過激活JNK和IKK-NF-κB信號(hào)通路相互作用，引起炎癥因子的表達(dá)。過去人們普遍認(rèn)為，肥胖是通過誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)從而引起IR的。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所致的IR主要是通過IRE1α介導(dǎo)的JNK活化來實(shí)現(xiàn)的，說明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是IR的關(guān)鍵機(jī)制。又如，肝細(xì)胞內(nèi)蓄積大量FFA，通過脂質(zhì)中間的代謝產(chǎn)物(如甘油二酯、神經(jīng)酰胺)即可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激而發(fā)生炎癥和凋亡，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是炎癥和凋亡發(fā)生的重要機(jī)制。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示模型組大鼠血中LPS水平升高，免疫組化顯示肝臟巨噬細(xì)胞浸潤自第3個(gè)月開始增加且持續(xù)至12月；胰腺巨噬細(xì)胞浸潤開始在外分泌腺然后6個(gè)月進(jìn)展至胰島周圍，9、12月胰島才明顯出現(xiàn)巨噬細(xì)胞的浸潤。分子生物學(xué)結(jié)果顯示模型組肝臟p-JNK、NF-κB和GRP78的蛋白表達(dá)都是自第3個(gè)月開始增強(qiáng)，至第6個(gè)月升至最高且持續(xù)至第12個(gè)月；模型組胰腺p-JNK和NF-κB的蛋白表達(dá)分別自第6個(gè)月以后才開始逐漸增強(qiáng)，而胰腺的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物GRP78自第3個(gè)月表達(dá)就顯著增加，6個(gè)月以后進(jìn)一步增強(qiáng)。上述結(jié)果表明，血中LPS升高水平與肝臟、胰島巨噬細(xì)胞浸潤以及p-JNK、NF-κB和GRP78走向大體一致，而胰腺GRP78在第3個(gè)月就顯著增加，這可能是由于IR致使胰島素分泌代償性增多超過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的處理能力從而活化UPR致使發(fā)生炎癥、凋亡或壞死，最終導(dǎo)致β細(xì)胞損傷及凋亡發(fā)生，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是炎癥與IR發(fā)生的關(guān)鍵機(jī)制。具體而言，LPS可能通過肝臟和胰島浸潤的單核巨噬細(xì)胞,誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，使GRP78從跨膜蛋白脫落入血，使JNK和NF-κB信號(hào)蛋白表達(dá)增加。這樣，一方面誘發(fā)了胰島素抵抗，使體內(nèi)發(fā)生系統(tǒng)代謝障礙；另一方面引發(fā)肝臟、胰島炎癥反應(yīng)使NAFLD、T2DM等與MS相關(guān)的代謝性疾病發(fā)生慢性低度炎癥。

綜上所述，非酒精性脂肪性肝病、T2DM等MS相關(guān)疾病大多伴有腸源性內(nèi)毒素血癥，LPS與相應(yīng)的受體TLR4結(jié)合分別作用于脂肪細(xì)胞、天然免疫系統(tǒng)通過NF-κB、JNK和GRP78等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路使肝臟、胰島引發(fā)慢性低度炎癥與胰島素抵抗。除LPS外，血中葡萄糖、FFA是TLR4的內(nèi)源性配體，通過天然免疫系統(tǒng)發(fā)揮的作用也不容忽視。

[1] 周 鑫，韓德五，李素紅，等.高糖高脂致大鼠非酒精性脂肪肝合并高血糖動(dòng)物模型的研究[J]．中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2011，21(7)：1-7．

[2] Wigg AJ,Roberts-Thomson IC,Dymock RB,et al. The role of small intestinal bacterial overgrowth, intestinal permeability, endotoxaemia, and tumour necrosis factor α in the pathogenesis of non-alcoholic steatohepatitis[J].Gut,2001,48(2):206-211.

[3] Brun P,Castagliuolo I,Di Leo V,et al. Increased intestinal permeability in obese mice: new evidence in the pathogenesis of nonalcoholic steatohepatitis[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2007,292(2):G518-G525.

[4] Kudo H, Takahara T, Yata Y,et al. Lipopolysaccharide triggered TNF-α-induced hepatocyte apoptosis in a murine non-alcoholic steatohepatitis model[J].J Hepatol,2009,51(1):168-175.

[5] Erridge C,Attina T,Spickett CM,et al.A high-fat meal induces low-grade endotoxemia:evidence of a novel mechanism of postprandial inflammation[J].Am J Clin Nutr,2007,86(5):1286-1292.

[6] Farhadi A,Gundlapalli S,Shaikh M,et al.Susceptibility to gut leakiness:a possible mechanism for endotoxaemia in non-alcoholic steatohepatitis[J].Liver Int,2008,28(7):1026-1033.

[7] 吳惠文.枯否細(xì)胞在非酒精性脂肪肝炎發(fā)生中的作用[M].∥韓德五.腸源性內(nèi)毒素血癥與肝病.第1版.北京:中國科技出版社,2004.493-504.

[8] 郭江紅，韓德五，郭建紅. 內(nèi)毒素誘發(fā)大鼠非酒精性脂肪性肝炎和胰島素抵抗[J]. 中國病理生理雜志, 2010,26(5):1009-1011.

[9] Harte AL，da Silva NF,Creely SJ,et al. Elevated endotoxin levels in non-alcoholic fatty liver disease[J]. J Inflamm(Lond), 2010,7:15.

[10]Creely S, McTernan P, Kusminski C,et al. Lipopolysaccharide activates an innate immune system response in human adipose tissue in obesity and type 2 diabetes[J]. Endocrinol Metab，2007,292(3)：740-747.

[11]Cani PD, Amar J, Iglesias MA,et al. Metabolic endotoxemia initiates obesity and insulin resistance[J]. Diabetes, 2007, 56(7): 1761-1772.

[12]Omar S, Nasser M, Daghri K,et al.Changes in endotoxin levels in T2DM objects on anti-diabetic therapies[J]．Cardiovasc Diabetol，2009，8：20．

[13]Pickup JC,Crook MA. Is type Ⅱ diabetes mellitus a disease of the innate immune system[J]. Diabetologia,1998,41(10): 1241-1248.

[14]Feldstein AE,Werneburg NW,Canbay A,et al. Free fatty acids promote hepatic lipotoxicity by stimulating TNF-α expression via a lysosomal pathway[J].Hepatology,2004,40(1):185-194.

[15]Gung?r N, Pennings JL, Knaapen AM, et al.Transcriptional profiling of the acute pulmonary inflammatory response induced by LPS: role of neutrophils[J].Respir Res，2010,11：24.

[16]賈建桃，張慧英，田小霞，等．葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78在復(fù)合2因素誘導(dǎo)的大鼠肝肺綜合征中的作用[J]．中國病理生理雜志，2011，27(8)：1580-1585．

Roleofintestinalendotoxemiaindevelopmentofmetabolicsyndrome-relateddiseasesinrats

ZHOU Xin1, HAN De-wu1, XU Rui-ling1, LI Su-hong2, WU Hui-wen3, ZHAO Yuan-chang1

(1InstituteofHepatology,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China;2DepartmentofPathology,TumorHospitalofShanxiProvince,Taiyuan030013,China;3ShanxiMedicalUniversityofFenyangCollege,Fenyang032200,China.E-mail:xinxin6633@yeah.net)

AIM: To investigate the effect of intestinal endotoxemia (IETM) on the development of metabolic syndrome (MS)-related diseases and its molecular mechanisms.METHODSSixty-four rats were randomly divided into 8 groups, which were normal groups of 3 months (3C), 6 months (6C), 9 months (9C) and 12 months (12C)，and high-sucrose and high-fat groups of 3 months (3H), 6 months (6H), 9 months (9H) and 12 months (12H). The levels of lipopolysaccharide (LPS), tumor necrosis factor α (TNF-α), C-reactive protein (CRP), monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1), fasting plasma glucose (FPG) and fasting plasma insulin (FINS) in the serum were measured. The insulin resistance index (HOMA-IR) was also calculated. The protein expression of CD68 in the tissues of fat, liver and pancreas was detected by the method of immunohistochemistry. The expression of JNK1, p-JNK1, NF-κB p65, IκB and GRP78 in the liver and pancreas was analyzed by Western blotting.RESULTSThe levels of LPS, FFA, TNF-α, CRP, MCP-1, FPG, FINS and HOMA-IR in high-sucrose and high-fat groups of every phase were higher than those in normal groups. The results of immunohistochemistry showed that the expression of CD68 (representing the infiltration of mononuclear cells) in the tissues of fat, liver and pancreas in high-sucrose and high-fat groups gradually increased from the 3rd month to the 12th month. Compared with normal groups, the expression of p-JNK1, NF-κB p65 and GRP78 in the liver were increased from the 3rd month to the 12th month, but the expression of IκB in the liver was reduced. The expression of p-JNK1 and NF-κB p65 in the pancreatic tissues was increased from the 6th month to the 12th month, but the expression of IκB reduced. However, the expression of GRP78 in pancreatic tissues was increased from the 3rd month to the 12th month.CONCLUSIONIntestinal endotoxemia may play an important role in the development of MS-related diseases. LPS-mediated JNK1, NF-κB and GRP78 expression may be involved in the signal transduction pathways of MS development induced by intestinal endotoxemia．

Intestinal endotoxemia; Metabolic syndrome; Non-alcoholic fatty liver disease; Diabetes mellitus,type 2; Insulin resistance

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.03.019