廖玲敏 潘銳柯 周力學(xué)薛淑娟 張莘 周楠 狄娜

中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 廣州 510120

近年來(lái)隨著超聲造影劑制備技術(shù)的不斷改進(jìn)，靶向超聲微泡造影劑（targeted microbubble contrast agents, TMCA）在疾病診斷和治療中的作用成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。經(jīng)靜脈注入帶有特定配體的靶向微泡造影劑，在體內(nèi)通過(guò)配體與受體結(jié)合的方式，使微泡選擇性聚集并較長(zhǎng)時(shí)間停留于靶組織或靶器官而達(dá)到靶向顯影[1]。目前國(guó)內(nèi)外已有多篇關(guān)于TMCA應(yīng)用于各種腫瘤早期診斷的報(bào)道[2-3]。有研究證實(shí)，在體外靶向微泡與絨毛膜癌細(xì)胞可特異性結(jié)合，流其結(jié)合力具有一定的強(qiáng)度，有望能抵抗毛細(xì)血管內(nèi)血流生理性沖洗的破壞，實(shí)現(xiàn)靶向顯影[4-6]。本研究旨在探討耦合抗人絨毛膜促性腺素（anti-human chorionic gonadotropin beta，β-HCG）抗體TMCA的穩(wěn)定性及靶向微泡與妊娠絨毛組織在體外的結(jié)合特性，為今后滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤的早期診斷、準(zhǔn)確定位及評(píng)估化療療效提供更為準(zhǔn)確和科學(xué)的依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 一般資料

實(shí)驗(yàn)組選自中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院婦產(chǎn)科2010年3月—2011年2月進(jìn)行門診人工流產(chǎn)術(shù)患者的妊娠絨毛組織?；颊吣挲g20～36歲，妊娠時(shí)間均在6～7周，平時(shí)月經(jīng)規(guī)律，無(wú)內(nèi)分泌紊亂、自然流產(chǎn)、習(xí)慣性流產(chǎn)、稽留流產(chǎn)史等。

對(duì)照組選同期本科室收治的宮頸癌行全子宮切除術(shù)患者的內(nèi)膜組織，患者年齡均＜40歲，月經(jīng)規(guī)律，有生育史，臨床和病理排除子宮內(nèi)膜癌、子宮內(nèi)膜增生癥、子宮內(nèi)膜息肉、子宮黏膜下肌瘤等。

本實(shí)驗(yàn)得到本院生殖醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，并獲得患者知情同意。

1.2 材料和儀器

聲諾維（SonoVue）由瑞士BRACCO Imaging BV公司生產(chǎn)；鼠抗β-HCG、熒光素標(biāo)記兔抗小鼠IgG（rabbit anti-mouse IgG/FITC）和兔抗鼠IgG血清，購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司；異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate, FITC），購(gòu)于美國(guó)SIGMA公司；倒置熒光顯微鏡；FACS Calibur流式細(xì)胞儀。

聲諾維混懸液：凍干粉[聚乙二醇4000、二硬脂磷酰脂膽堿（DSPC）、二棕櫚磷酰脂甘油（DPPGNA）、棕櫚酸]25 mg和SF6氣體59 mg緩慢加入到0.9%NaCl溶液5 mL，靜置備用。使用期間應(yīng)密封，避免氣體彌散。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)本采集、保存及處理取人流室做負(fù)壓吸引術(shù)獲取的新鮮妊娠絨毛組織和在開(kāi)腹或經(jīng)陰式全子宮切除術(shù)獲取的子宮內(nèi)膜組織，立即由本院病理科做快速冷凍切片。取1張用蘇木素-伊紅染色，由病理科醫(yī)生閱片證實(shí)為正常妊娠絨毛組織。切片后立即保存于-29℃冰箱中，當(dāng)日使用完畢。

1.3.2 靶向微泡造影劑的制備與鑒定 TMCA的制備按參考文獻(xiàn)方法進(jìn)行[4,7]。玻片凝集試驗(yàn)：取4張潔凈載玻片A、B、C、D，其中A、B載玻片分別加20 μL靶向微泡造影劑，C、D載玻片上加20 μL 聲諾維。然后，A、C載玻片上分別滴加等容積兔抗鼠IgG血清，B、D載玻片上分別滴加等容積的0.9%NaCl溶液。不時(shí)搖動(dòng)，光鏡下觀察。免疫熒光實(shí)驗(yàn)：取制備好的TMCA和聲諾維混懸液各50 μL，分別加入等容積FITC標(biāo)記的兔抗小鼠IgG抗體稀釋液，避光反應(yīng)15 min，在熒光顯微鏡下觀察。

1.3.3 靶向微泡造影劑穩(wěn)定性的檢測(cè)取FITC標(biāo)記兔抗鼠IgG抗體稀釋液100 μL，用0.01 mol/L pH 7.4 PBS以1∶20稀釋；稀釋后加入上述制備好的TMCA 2 mL混合后，振蕩混勻，避光反應(yīng)10 min，用PBS洗滌混懸液，去除游離抗體。用500μL TMCA＋500 μL PBS作為空白對(duì)照組。在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測(cè)，分別檢測(cè)1、10 、20 及30 min各時(shí)間點(diǎn)聲諾維混懸液和抗β-HCG抗體的結(jié)合率，觀察普通微泡與抗體結(jié)合率隨時(shí)間變化的情況。重復(fù)檢測(cè)17個(gè)樣本。

1.3.4 靶向微泡造影劑與絨毛組織切片的尋靶實(shí)驗(yàn)將妊娠絨毛組織冷凍切片隨機(jī)分為TMCA組（A組）和聲諾維組（B組），每組各10張切片，分別與TMCA、聲諾維混懸液進(jìn)行結(jié)合實(shí)驗(yàn)；將正常子宮內(nèi)膜組織冷凍切片隨機(jī)分為TMCA(C組）和聲諾維組（D組），每組各10張切片，分別與TMCA、聲諾維懸混液進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)。在顯微鏡下觀察微泡與絨毛組織結(jié)合情況，以每個(gè)絨毛組織上結(jié)合20個(gè)以上微泡為陽(yáng)性，每張切片隨機(jī)觀察6個(gè)不同的絨毛組織，以子宮內(nèi)膜組織為對(duì)照組。

觀察5 min后，用新配制的PBS反復(fù)沖洗絨毛組織切片上的TMCA，然后在顯微鏡下觀察TMCA微泡與絨毛組織結(jié)合情況，比較沖洗前后TMCA微泡與絨毛組織結(jié)合率來(lái)評(píng)價(jià)結(jié)合的穩(wěn)定性。

抗體阻斷實(shí)驗(yàn)的過(guò)程：取絨毛組織冷凍切片，復(fù)溫20 min，PBS沖洗3次后；在切片上滴加100 μL 鼠抗β-HCG稀釋液，37℃溫育5 min，用PBS沖洗去除未結(jié)合的游離抗體；再加入TMCA 100 μL，37 ℃溫育5 min；用PBS洗滌后，計(jì)數(shù)絨毛組織與TMCA的結(jié)合情況；以子宮內(nèi)膜組織為對(duì)照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 靶向微泡造影劑的鑒定結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)中制備的TMCA為乳白色混懸液，光鏡下觀察，微泡大小、分布均勻，與普通聲諾維微泡無(wú)異。當(dāng)加入兔抗鼠IgG抗血清后，光鏡下觀察原來(lái)均勻分布的TMCA形成輕度凝集狀態(tài)，微泡之間連成串狀形如葡萄。而加0.9%NaCl溶液后仍是均勻分散的微氣泡。聲諾維加入兔抗鼠抗血清或0.9%NaCl溶液后均未見(jiàn)凝集反應(yīng)。經(jīng)FITC標(biāo)記的兔抗小鼠IgG抗體稀釋液染色后，熒光顯微鏡下觀察可見(jiàn)TMCA殼表面發(fā)出環(huán)狀明亮的的綠色熒光，而單純的聲諾維微泡表面則未見(jiàn)熒光。

2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

聲諾維微泡與鼠抗β-H C G的結(jié)合率在1 、10 、20 及30 min分別為（92.25±2.18）%、（93.59±4.46）%、（95.27±2.88）%、（95.80±1.50）%，其結(jié)合率隨時(shí)間的增加越來(lái)越高。其中1 min時(shí)的結(jié)合率分別與20、30 min的結(jié)合率相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），10 和30 min的結(jié)合率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而其他幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1）。

2.3 靶向微泡造影劑與絨毛組織切片的尋靶實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1 抗體與微泡結(jié)合率A：1 min；B：10 min；C：20 min；D：30 min

圖2 聲諾維與絨毛組織、子宮內(nèi)膜組織結(jié)合率（×200）A：TMCA與絨毛組織結(jié)合；B：SonoVue與絨毛組織結(jié)合；C：聲諾維與子宮內(nèi)膜組織結(jié)合；D：聲諾維與子宮內(nèi)膜組織結(jié)合

TMCA與妊娠絨毛組織溫育5 min后，在光鏡下觀察可見(jiàn)大量TMCA聚集在絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞周圍（圖2A），僅少量的聲諾維微泡散在結(jié)合于絨毛組織切片上（圖2B）；而對(duì)照組子宮內(nèi)膜組織僅少量的TMCA或聲諾維微泡散在結(jié)合于組織間隙（圖2C、D）。TMCA與絨毛組織和子宮內(nèi)膜組織結(jié)合的陽(yáng)性率分別為（83.30±2.15）%（13.30±2.58）%，兩組相比差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；聲諾維與絨毛組織和子宮內(nèi)膜組織結(jié)合率分別為（15.00±3.07）%和（8.30±1.48）%，兩組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；TMCA與絨毛組織結(jié)合率和聲諾維與絨毛組織結(jié)合率相比，其差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；T M C A和子宮內(nèi)膜組織結(jié)合率與聲諾維和內(nèi)膜組織結(jié)合率相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

TMCA與絨毛組織沖洗前后的結(jié)合率：TMCA與絨毛組織反應(yīng)5 min后，顯微鏡下觀察到微泡大部分聚集在絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞周圍，而組織切片的中間胚芽組織部分少見(jiàn)微泡聚集。沖洗之前結(jié)合率為（83.30±2.15）%，用PBS勻速?zèng)_洗后，有部分微泡被沖走，結(jié)合率為（78.30±4.36）%，沖洗前后結(jié)合率相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；對(duì)照組子宮內(nèi)膜組分別沖洗前后的結(jié)合率分別為（13.30±2.58）%和（5.00±1.10）%，沖洗前后結(jié)合率相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

當(dāng)使用抗β-HCG抗體預(yù)處理絨毛組織和子宮內(nèi)膜組織后，TMCA與子宮絨毛組織的結(jié)合率為（16.70±2.50）%，TMCA與子宮內(nèi)膜組織的結(jié)合率為(11.70±2.47)%?？贵w預(yù)處理絨毛組織前后結(jié)合率相比，差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），抗體預(yù)處理子宮內(nèi)膜組織前后結(jié)合率相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

TMCA的應(yīng)用是進(jìn)行超聲分子顯像的物質(zhì)基礎(chǔ)，而制備靶向微泡的關(guān)鍵技術(shù)在于微泡的表面修飾，即如何將特異度好、活性高的配體牢固結(jié)合到微泡表面。本實(shí)驗(yàn)采用聚乙二醇4000作為耦聯(lián)劑增強(qiáng)微泡和配體的連接。聚乙二醇具有良好的柔韌性和延展性，可向外伸入周圍介質(zhì)中數(shù)十納米，提高了靶向作用的穩(wěn)定性；同時(shí)，濃密的短多聚鏈層也可保證微泡的穩(wěn)定性，降低其非特異性結(jié)合率[8]。本實(shí)驗(yàn)所選用的聲諾維超聲造影劑外有穩(wěn)定的磷脂外殼，內(nèi)含SF6氣體。脂質(zhì)體（磷脂）以單層形式包裹微氣泡，分子的疏水端朝向氣體，親水端朝向水溶液介質(zhì)，形成一道堅(jiān)固的屏障，有效地避免了溶液中微泡間的相互融合[9]。由于單克隆抗體不能耐受微泡的制備過(guò)程，所以在本實(shí)驗(yàn)制備TMCA的過(guò)程中直接將聲諾維混懸液和抗β－HCG抗體溶液等容積結(jié)合，4 ℃條件下靜置；利用含氣體微泡比周圍的水相輕的特點(diǎn)，2 h后，上層為混懸液，下層為清亮液體，經(jīng)新配制的PBS懸浮3次后，所得上層混懸液，用玻片凝集實(shí)驗(yàn)、免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)進(jìn)行鑒定，均證明了抗β－HCG抗體可以結(jié)合聲諾維至混懸微泡表面，并且其結(jié)合率不隨時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯降低。此種方法成本低，操作簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)條件要求不高，不影響微泡和抗體活性，不會(huì)對(duì)微泡造成破壞，能滿足靶向超聲造影劑的早期實(shí)驗(yàn)研究。

妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病是一組來(lái)源于胎盤(pán)絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞的疾病，具高度惡性，早期可通過(guò)血行轉(zhuǎn)移至全身，因而早期定位診斷惡性滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤尤為重要。普通超聲微泡造影劑因缺乏對(duì)病變組織的特殊親和力，不能有效駐留靶組織，不利于觀察微小病變，從而有可能錯(cuò)過(guò)早期發(fā)現(xiàn)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲血管的證據(jù)。TMCA對(duì)于靶區(qū)病變有一定的親和力，可以到達(dá)靶向區(qū)域組織或器官，選擇性地與相應(yīng)的配體結(jié)合，從而達(dá)到特異的增強(qiáng)靶區(qū)超聲信號(hào)。本實(shí)驗(yàn)中將抗β－HCG抗體連接到聲諾維的外殼上制備成TMCA，通過(guò)與妊娠絨毛組織的結(jié)合反應(yīng)、子宮內(nèi)膜組織對(duì)照組實(shí)驗(yàn)及抗體預(yù)處理實(shí)驗(yàn)，表明耦合抗β-HCG抗體的TMCA與絨毛組織在體外一定條件下能高效率、高強(qiáng)度，高特異性地結(jié)合。

因臨床上早期發(fā)現(xiàn)惡性滋養(yǎng)細(xì)胞疾病大多經(jīng)化療后能治愈，所以很難取得子宮的大體標(biāo)本；而腫瘤滋養(yǎng)細(xì)胞和正常妊娠的滋養(yǎng)細(xì)胞在許多方面仍保持不少相似之處，如都能產(chǎn)生HCG等糖蛋白和性激素，所以本試驗(yàn)選取人工流產(chǎn)術(shù)后的妊娠絨毛組織作為研究對(duì)象。本實(shí)驗(yàn)不足之處為所制備的TMCA在體外能與絨毛組織特異性的結(jié)合，但在實(shí)際應(yīng)用中抗體介導(dǎo)的靶向微泡會(huì)受到血流剪切狀態(tài)的限制，大部分抗體在高剪切力的血流中不能迅速地與配體結(jié)合[10]。因此究竟在體內(nèi)靶向造影劑對(duì)靶器官的作用如何，還需深入研究。

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