彭林輝，周 杰，霍 楓，詹世林，張 琪，蘇長(zhǎng)青，錢(qián)其軍，石 英△

（1.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院肝膽外科，廣州510010；2.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院肝膽外科，廣州510515；3.中山大學(xué)第三附屬醫(yī)院肝臟病醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室，廣州510630；4.第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院基因與病毒治療實(shí)驗(yàn)室，上海200438）

基因治療和病毒治療是近年來(lái)腫瘤治療的研究熱點(diǎn)。但是，傳統(tǒng)的基因治療，如常用的非增殖型腺病毒傳輸治療基因存在治療基因表達(dá)率低、靶向性差[1]；病毒治療單用時(shí)腫瘤的殺傷效率不夠高，如已進(jìn)入臨床的溶瘤病毒ONYX－015單獨(dú)應(yīng)用治療頭頸部腫瘤有效率不到10%[2]。理論上，在溶瘤腺病毒中插入具有抗癌作用的基因，在病毒選擇性感染、增殖時(shí)大量表達(dá)具有抗癌作用的細(xì)胞因子，是更有前景的抗癌新策略[3]。CNHK300病毒系統(tǒng)是本室構(gòu)建的人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子（h TERT）調(diào)控的溶瘤病毒，體外實(shí)驗(yàn)和荷瘤動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均證明比ONYX－015有更強(qiáng)的抗腫瘤效果[4]。為了進(jìn)一步增強(qiáng)抗腫瘤效果，本研究將具有抗腫瘤作用的小鼠γ－干擾素基因（mIFN－γ）插 入CNHK300，構(gòu)建了基因病毒治療系統(tǒng)CNHK300－mIFN－γ（簡(jiǎn) 稱(chēng)CNHK300－Mγ）[5]。為了明確治療基因插入是否影響溶瘤病毒的抗腫瘤作用和插入基因的表達(dá)情況，本究采用胃癌細(xì)胞株SGC－7901、大腸癌細(xì)胞株HT－29和正 常 成纖維細(xì)胞株MRC－5，以CNHK300、ONYX－015和Ad Easy－mIFN－γ（簡(jiǎn) 稱(chēng)AdEasy－Mγ）作為對(duì)照，進(jìn) 行CNHK300－Mγ抗腫瘤實(shí)驗(yàn)研究。

1 材料與方法

1.1 材料 人胚胎腎293細(xì)胞株購(gòu)自加拿大Microbix Biosystems公司。健康人成纖維細(xì)胞MRC－5和人大腸癌細(xì)胞HT－29購(gòu)自美國(guó)American Type Culture Collection（ATCC），人胃癌細(xì)胞株SGC－7901購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所。腺病毒ONYX－015由美國(guó)加州大學(xué)Berk AJ教授惠贈(zèng)。重組腺病毒CNHK300、CNHK300－Mγ和Ad Easy－Mγ由本實(shí)驗(yàn)室重組并保存。各細(xì)胞株培養(yǎng)液、培養(yǎng)血清及抗生素參照供應(yīng)商推薦，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，0.25%胰酶消化細(xì)胞、傳代。

1.2 方法

1.2.1 病毒的擴(kuò)增與純化 腺病毒擴(kuò)增采用HEK293細(xì)胞；病毒純化采用常規(guī)氯化銫梯度離心純化法；采用Qbiogene公司的TCID50法測(cè)定病毒滴度。

1.2.2 病毒增殖實(shí)驗(yàn) 分別收集上述腫瘤及正常細(xì)胞株，計(jì)數(shù)，按5×106／孔接種6孔板。24 h后當(dāng)腫瘤細(xì)胞達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，正常細(xì)胞達(dá)到接觸抑制，分別按MOI＝5感染CNHK300－Mγ、CNHK300和ONYX－015。感染2 h后，將培養(yǎng)液替換成5%血清培養(yǎng)液，放置在37℃的5%CO2孵箱中培養(yǎng)。收集感染0、48 h細(xì)胞凍融液及上清，TCID50法測(cè)定病毒滴度，以0 h病毒滴度為參照，算出病毒的增殖倍數(shù)。

1.2.3 細(xì)胞病理效應(yīng)（CPE實(shí)驗(yàn)，Cytopathic Effect） 將上述腫瘤及正常細(xì)胞按5×104個(gè)／孔的密度植入24孔板中，每孔加入1 mL的培養(yǎng)基。24 h后對(duì)細(xì)胞換用無(wú)血清培養(yǎng)液，按MOI＝0、0.01、0.1、1、10、100分別加入病毒CNHK300－Mγ、CNHK300和ONYX－015，十字法搖勻，2 h后換用5%血清培養(yǎng)液，37℃，5%CO2孵箱培養(yǎng)7 d，每日觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。7 d后吸掉細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入500μL結(jié)晶紫染色液（2%結(jié)晶紫溶于20%甲醇），室溫染色15 min，在純水中洗掉多余染液后拍照記錄。

1.2.4 細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn) 接種上述腫瘤及正常細(xì)胞至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（104／孔），用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，按梯度MOI值感染細(xì)胞，分別加入病毒CNHK300－Mγ、CNHK300和ONYX－015，7 d后棄去病毒殘液，四唑鹽比色試驗(yàn)（MTT）檢測(cè)3種病毒對(duì)各種細(xì)胞的殺傷作用。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在570 nm波長(zhǎng)下測(cè)定光吸收值，參考波長(zhǎng)為650 nm。每個(gè)病毒MOI值做8個(gè)復(fù)孔，獨(dú)立重復(fù)3次。MOI為病毒數(shù)量與細(xì)胞數(shù)量之比。

1.2.5 雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)mIFNγ表達(dá)量 分別收集上述腫瘤及正常細(xì)胞株，計(jì)數(shù)，按5×104／孔接種于24孔板。24 h后當(dāng)腫瘤細(xì)胞達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，正常細(xì)胞達(dá)到接觸抑制，分別按MOI＝1感染CNHK300－Mγ和Ad Easy－Mγ（攜帶mIFN－γ的非增殖病毒）。感染2 h后，將培養(yǎng)液替換成5%血清培養(yǎng)液，放置在37℃的5%CO2孵箱中培養(yǎng)。收集感染3、7 d細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用ELISA檢測(cè)其中mIFN－γ的表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件采用Excel2003，所有定量實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，各組數(shù)據(jù)以±s表示。

2 結(jié) 果

2.1 CNHK300－Mγ和CNHK300病毒的擴(kuò)增與純化。與野生型腺病毒比較，重組病毒CNHK300由h TERT調(diào)控E1A基因，而重組腺病毒CNHK300－Mγ，在h TERT之前插入了CMV啟動(dòng)子調(diào)控mIFN－γ的基因表達(dá)盒。病毒在293細(xì)胞中反復(fù)擴(kuò)增到需要量，純化后進(jìn)行滴度測(cè)定，CNHK300－Mγ和CNHK300滴度測(cè)定分別為1.0×109、1.6×109pfu／mL。

2.2 攜帶治療基因的溶瘤腺病毒CNHK300－Mγ選擇性在胃腸道腫瘤細(xì)胞中增殖，在SGC－7901、HT－29和MRC－5中的增殖倍數(shù)分為32 536、25 150和50.2，如圖1所示。在腫瘤細(xì)胞株和正常細(xì)胞株增殖差異比較中發(fā)現(xiàn)，SGC－7901／MRC－5和HT－29／MRC－5在CNHK300－Mγ分 別 為648和501，在CNHK300分別為450和280，在ONYX－015分別為32和16。由此可見(jiàn)，與CNHK300相比，mIFN－γ基因插入后，在各種細(xì)胞中的增殖能力均有所下降，但腫瘤細(xì)胞內(nèi)的選擇性增殖能力沒(méi)有下降；與ONYX－015相比，CNHK300－Mγ顯示出更為特異的腫瘤細(xì)胞內(nèi)選擇性增殖能力。

圖1 3種病毒48 h增殖情況

2.3 CPE實(shí)驗(yàn)可以較為直觀地看出3種病毒對(duì)胃腸道腫瘤細(xì)胞株和正常細(xì)胞株的殺傷能力。從圖2～4中可以看出：CNHK300－Mγ對(duì)腫瘤細(xì)胞株的殺傷能力明顯高于正常肝細(xì)胞株，在MOI值為1時(shí)均基本殺滅，而正常細(xì)胞株至MOI值為100時(shí)才有部分殺傷力。與ONYX－015相比，CNHK300－Mγ在腫瘤細(xì)胞株的殺傷能力明顯增強(qiáng)而在正常細(xì)胞株中殺傷力進(jìn)一步減弱。

2.4 MTT試驗(yàn)是一種檢測(cè)細(xì)胞存活率、判定藥物對(duì)細(xì)胞殺傷作用的通用方法。結(jié)果表明，CNHK300－Mγ、CNHK300和ONYX－015均表現(xiàn)出了對(duì)胃腸道腫瘤細(xì)胞較強(qiáng)的殺傷力，CNHK300－Mγ對(duì)正常細(xì)胞株殺傷力最弱。對(duì)不同細(xì)胞的半殺傷劑量IC50的結(jié)果直觀地表明CNHK300－Mγ和CNHK300對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力與ONYX－015相比有明顯提高。CNHK300－Mγ雖然較CNHK300對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用有所下降，但在正常細(xì)胞中下降更明顯，在MRC－5細(xì)胞中，其IC50值是CNHK300的8倍以上（表1）。

圖2 3種病毒在SGC－7901細(xì)胞株中的CPE試驗(yàn)

圖3 3種病毒在HT－29細(xì)胞株中的CPE試驗(yàn)

圖4 3種病毒在MRC－5細(xì)胞株中的CPE試驗(yàn)

表1 3種病毒感染對(duì)不同細(xì)胞增殖的半抑制劑量IC50（MOI）（pfu／cell）

表2 2種病毒在不同細(xì)胞株上清液中mIFN－γ的表達(dá)量（pg／mL）

2.5 Ad Easy－Mγ是攜帶mIFN－γ的非增殖型腺病毒，感染胃腸道腫瘤細(xì)胞后只有少量mIFN－γ的表達(dá)，感染時(shí)間延長(zhǎng)，表達(dá)量變化不大；而CNHK300－Mγ感染胃腸道腫瘤細(xì)胞后均有大量mIFN－γ的表達(dá)，感染的時(shí)間延長(zhǎng)，表達(dá)量均成倍上升。SGC－7901細(xì)胞株受CNHK300－Mγ感染后mIFN－γ的表達(dá)量是Ad Easy－Mγ的238倍（3 d時(shí)）和1 037倍（7 d時(shí)），HT－29細(xì)胞株受CNHK300－Mγ感染后mIFN－γ的表達(dá)量是Ad Easy－Mγ的345倍（3 d時(shí)）和1 865倍（7 d時(shí)）。對(duì)于正常細(xì)胞MRC－5，2種病毒感染后，mIFN－γ的表達(dá)量相似，均不高，感染的時(shí)間延長(zhǎng)變化也不大。上述結(jié)果提示利用增殖型腺病毒攜帶治療基因能明顯提高腫瘤局部治療基因的表達(dá)。

3 討 論

20世紀(jì)90年代初Martuza等[6]應(yīng)用基因工程的方法將病毒基因組進(jìn)行改造，使病毒感染、復(fù)制及溶解細(xì)胞的能力在腫瘤細(xì)胞內(nèi)得到有效增強(qiáng)，而對(duì)正常細(xì)胞影響大為減少，腫瘤病毒治療逐漸成為研究的熱點(diǎn)。這種經(jīng)基因工程方法改造的病毒被稱(chēng)為復(fù)制選擇性溶瘤病毒（replication－selective oncolytic virus），簡(jiǎn)稱(chēng)為溶瘤病毒，其相應(yīng)的治療理念被稱(chēng)為病毒治療（virotherapy）[7－8]。目前，改造腺病毒靶向機(jī)制主要有以下幾個(gè)方面：（1）改造病毒表面的結(jié)合蛋白，與某些特定的腫瘤組織結(jié)合，從而使病毒只能感染特定的腫瘤組織。目前，研究主要集中于腺病毒外殼蛋白的改造，包括纖維蛋白（fiber）、五鄰體（penton）及六鄰體（hexon）蛋白[9]。（2）根據(jù)腫瘤生物學(xué)行為上的一些異常表現(xiàn)，選擇性地缺失病毒在正常細(xì)胞復(fù)制所必需而在腫瘤細(xì)胞中非必需的基因，如ONYX－015是E1B－55 kD缺失的腺病毒，它依據(jù)多數(shù)人類(lèi)腫瘤細(xì)胞p53功能不良而正常細(xì)胞p53陽(yáng)性的特點(diǎn)，可以特異地殺傷p53缺失或變異的腫瘤細(xì)胞。（3）在病毒增殖必須基因的上游插入腫瘤組織特異性啟動(dòng)子或增強(qiáng)子，從而使病毒只在特定的腫瘤細(xì)胞內(nèi)增殖，而在其它細(xì)胞內(nèi)處于失活狀態(tài)，如甲胎蛋白（AFP）啟動(dòng)子[10]、前列腺癌特異性抗原（PSA）啟動(dòng)子[11]、缺氧啟動(dòng)子[12]、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子（h TERT）等。其中h TERT是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。在構(gòu)成人端粒酶的3個(gè)亞單位中h TERT是決定其活性的主要因素[13]，在原發(fā)性腫瘤和腫瘤細(xì)胞中有高表達(dá)，而在正常細(xì)胞中不表達(dá)，并且h TERT的表達(dá)與端粒酶活性高度相關(guān)[14]。h TERT基因的啟動(dòng)子區(qū)域已經(jīng)被克隆成功，是調(diào)控的是h TERT基因轉(zhuǎn)錄的主要部位[15]。用h TERT啟動(dòng)子控制E1A表達(dá)而獲得的增殖性腺病毒，具有選擇性裂解端粒酶陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的能力，而且殺傷能力與野生型腺病毒相當(dāng)[16]，在本室構(gòu)建的溶瘤病毒CNHK300中也觀察到相似的結(jié)果[4]。

為了優(yōu)化溶瘤病毒的抗癌性，研究人員進(jìn)一步將CNHK300攜帶上治療基因，期望治療基因在端粒酶陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞中選擇性地高表達(dá)，強(qiáng)化抗腫瘤效果。IFN－γ是已證實(shí)有多重抗癌作用的細(xì)胞因子，其機(jī)理主要有[17－18]：（1）影響細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，直接殺傷腫瘤細(xì)胞；（2）直接抑制腫瘤血管生成；（3）多重的免疫調(diào)節(jié)作用：調(diào)節(jié)MHCⅠ和MHCⅡ類(lèi)分子在大多數(shù)免疫細(xì)胞（如單核巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞等）內(nèi)的表達(dá)；誘導(dǎo)Th2向Th1分化，減少病毒抗體產(chǎn)生；增強(qiáng)腫瘤壞死因子的抑瘤作用；激活巨噬細(xì)胞及細(xì)胞毒細(xì)胞（CTL），增加淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞（LAK）的抗腫瘤活性。雖然IFN－γ已應(yīng)用到臨床試驗(yàn)中[19]，但是不穩(wěn)定、半衰期短、活性低，需要高劑量反復(fù)注射方能取得一定的療效，不良反應(yīng)較嚴(yán)重，費(fèi)用高，因而應(yīng)用明顯受限。

在作者的前期研究中將腺病毒E1A基因置于h TERT啟動(dòng)子控制之下，并將含mIFN－γ的外源基因表達(dá)盒插入到腺病毒的基因組中，成功地構(gòu)建一種新的基因－病毒治療系統(tǒng)CNHK300－Mγ[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，mIFN－γ基因的插入雖然在各種細(xì)胞株中的增殖能力和殺傷能力均有所降低，但正常細(xì)胞下降更明顯，與CNHK300相比腫瘤細(xì)胞內(nèi)選擇性增殖能力和對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷能力均無(wú)下降，與ONYX－015相比，在腫瘤細(xì)胞中增殖能力和殺傷能力明顯增強(qiáng)，而在正常細(xì)胞中的毒性進(jìn)一步下降，可見(jiàn)mIFN－γ基因的插入沒(méi)有改變?nèi)芰霾《咀陨硖禺愋詺缒[瘤細(xì)胞的能力。與Ad Easy－Mγ相比，CNHK300－Mγ在胃腸道腫瘤細(xì)胞中能隨著病毒的增殖大量表達(dá)mIFN－γ并隨時(shí)間相對(duì)延長(zhǎng)，表達(dá)量成倍上升，能有效避免傳統(tǒng)基因治療中治療基因表達(dá)率低的主要缺點(diǎn)。

胃腸道惡性腫瘤是十分常見(jiàn)的重大疾病，一經(jīng)確診絕大部分為中晚期，治療非常棘手且預(yù)后不理想。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道端粒酶陽(yáng)性率在胃腸道腫瘤中為85.0%～93.8%，端粒酶活性的表達(dá)和腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及PTNM分期顯著相關(guān)[20－24]。CNHK300－Mγ既有類(lèi)似CNHK300的溶瘤病毒選擇性殺傷端粒酶陽(yáng)性的胃腸道腫瘤細(xì)胞的作用，同時(shí)也能隨著病毒大量增殖高效表達(dá)IFN－γ，具備了基因治療和病毒治療的雙重抗瘤作用，進(jìn)一步動(dòng)物試驗(yàn)極可能顯示比CNHK300更強(qiáng)的抗瘤效果，擁有較高的胃腸道腫瘤治療潛力。

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