羅洪亮 綜述，朱培謙審校

（南昌大學第二附屬醫(yī)院胃腸外科，南昌330006）

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen－activated protein kinases，MAPK）是真核生物信號傳遞網(wǎng)絡中的重要途徑之一，在調(diào)控細胞凋亡、生長以及一些重要基因的表達中發(fā)揮重要作用[1]。現(xiàn)已經(jīng)確認在哺乳動物中存在4條不同的MAPK通路：extra－cellular signal－regulated kinase（ERK）、ERK5、c－Jun N－terminal kinase（JNK）、p38，其中JNK和P38被稱為應激活化MAPK通路[2]。一系列的MKKs可以激活JNK和P38，如MKK3、MKK6可以激活P38，MKK7可以激活JNK，只有MKK4能同時激活JNK和P38。

研究表明JNK和P38具有腫瘤抑制作用[3]，大約5%的各種腫瘤中發(fā)現(xiàn)了喪失功能的MKK4基因突變[4]。但另外一些學者的研究指出MKK4和JNK參與腫瘤的形成。這說明這條通路在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展扮演著復雜的角色。因此，筆者描述MKK4的生物學性狀并討論它是怎樣調(diào)控腫瘤發(fā)生、發(fā)展的。

1 MKK4的生物學性狀

1.1 MKK4的結構 人的MKK4基因位于第17染色體，它編碼一條含399個氨基酸的蛋白[5]。所有哺乳動物的MKK家族約有40%的同源性，MKK4與MKK7最為相似，大約有50%相同[6]。MKK4蛋白結構可分為3個部分：位于N端的D域序列在信號級聯(lián)反應中與JNK和P38連接；中間為激酶區(qū)（KD），包括11個亞基，7、8亞基間的S－I－A－K－T序列的絲氨酸和蘇氨酸殘基磷酸化后激活MKK4；位于C端的DVD域序列能與上游的各種MKKKs級聯(lián)（圖1）。MKK4與上下游之間的相互作用被看作是這條MAPK信號傳導通路的關鍵所在[7]。

1.2 MKK4的組織分布 MKK4 m RNA廣泛的表達于成年小鼠和人體的組織中，并且在腦的表達最高，特別是在大腦皮質(zhì)、丘腦、海馬體和小腦。在小鼠早期胚胎形成過程中（胚胎形成的前10d）MKK4僅局限地表達于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，從12 d開始，MKK4開始在肝臟中表達，并與肝的分化和生長發(fā)育相一致。亞細胞定位研究顯示MKK4蛋白主要存在于細胞質(zhì)中，一些細胞核中也有少量表達[8]。MKK4在免疫系統(tǒng)中也起到一定的作用，但確切的作用尚不完全清楚，一組研究表明MKK4缺失會嚴重影響B(tài)細胞和T細胞的生長發(fā)育，但另一組研究卻沒有發(fā)現(xiàn)明顯的證據(jù)表明MKK4對B、T細胞的生長發(fā)育是必需的。MKK4信號傳導通路同樣作用于由于心肌負荷量增大引起的心肌代償性肥大[9]。

圖1 MKK4蛋白結構

2 MKK4在MAPK的機制

2.1 上游基序激活MKK4 MKKKs通過磷酸化位于MKK4蛋白KD區(qū)域中Ser－Ile－Ala－Lys－Thr序列內(nèi)的絲氨酸／蘇氨酸殘基而激活MKK4。這些MKKKs包括促分裂素細胞外調(diào)節(jié)激酶激酶（MEKK）、混合酶譜激酶（MLK）、細胞凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1（ASK1）、轉化生長因子－β（TGF－β）－活化蛋白激酶－1（TAK1）和Tp L2[10]。不同的MKKKs激活不同的MKKS，例如，MEKK1和TAK1都能磷酸化MKK4和MKK7，而MEKK4只能磷酸化MKK4，這是因為MEKK1能連接到MKK4和MKK7都有的C－末端DVD位點上，而MEKK4只能特異性地連接到MKK4。一個關于MEKK1，MKK4，JNK的連續(xù)二聚交互體信號傳導通路模型已被提出，即MEKK1結合MKK4并使之磷酸化，然后再脫離MKK4；活化的MKK4連接到JNK并使之磷酸化。除了MAPK信號傳導通路中各成分之間的直接相互作用之外，其相關的支架蛋白也能通過改變這條通路的成分和促進他們的激活來調(diào)節(jié)這條通路。

2.2 MKK4激活JNK和P38 MKK4是MKKS家族中惟一能同時磷酸化和激活JNK和P38通路的激酶，并且MKK4能激活所有的JNK亞型（JNK1、JNK2、JNK3）和部分P38亞型（p38a、p38b）。

圖2 MKK4促細胞凋亡的機制

2.2.1 MKK4－JNK調(diào)節(jié)細胞凋亡 對于JNK通路，一些體外的研究提示MKK4能磷酸化JNK酪氨酸殘基，而MKK7能磷酸化蘇氨酸殘基，這些結果就引出了一個關于MKK4，MKK7協(xié)同激活JNK通路的假說。一些利用特定缺失MKK4和MKK7的小鼠胚胎干細胞和胚胎成纖維細胞在小鼠體內(nèi)的研究也支持這個假說，這些研究同時顯示不同的刺激可以有差別的利用的MKK4和MKK7：在MKK7缺失的胚胎成纖維細胞中，JNK對細胞炎性因子、腫瘤壞死因子－α（TNF－α）和白細胞介素－1等刺激所引起的激活效應幾乎完全消失，而在MKK4缺失的細胞中，其激活效應降低50%。這就說明在這些因素引起的JNK激活效應中MKK7是必須的，而MKK4則是選擇性的；以此相對的，在應對外界環(huán)境的刺激（紫外線、熱休克、滲透壓變化）引起的JNK激活效應，MKK4、MKK7表現(xiàn)出相似的作用[11]。

JNK通路一直被認為與調(diào)節(jié)細胞凋亡有關，但它的機制還不是完全清楚。目前提出了兩個假說來解釋JNK如何調(diào)節(jié)細胞凋亡。第一個假說是，JNK誘導細胞凋亡，它通過在線粒體水平激活內(nèi)源性細胞凋亡途徑的促凋亡蛋白并且誘導細胞色素C釋放，然后啟動caspase級聯(lián)反應引起細胞凋亡。JNK能直接磷酸化并激活含BH3結構域的促凋亡蛋白Bim、Bmf，使它們從細胞骨架上脫落下來并從新分配到線粒體膜上，引起線粒體膜的通透性改變并釋放細胞色素C。JNK調(diào)節(jié)紫外線誘導成纖維細胞凋亡的實驗支持這個假說，缺失JNK的成纖維細胞能完全抵抗紫外線誘導的細胞凋亡，并且明顯減少細胞色素C的釋放，而該細胞的由Fas／CD95介導的外源性細胞凋亡途徑不受影響[12]。另外一種假說是，JNK對外源性細胞凋亡途徑起調(diào)節(jié)作用，如對Fas－FADD－caspase和TNFRITRADD－FADD－caspase通路的調(diào)節(jié)，但只起促進作用而不是啟動作用。JNK的持續(xù)活化是TNFa介導的細胞凋亡所必需的，JNK的持續(xù)活化對一些抗細胞凋亡分子如c FLIP（細胞型FADD樣白細胞介素－1轉換酶抑制蛋白）的失活是必要的。在這些調(diào)節(jié)過程中，JNK是通過影響細胞對活化AP－1家族（cJun、cFos等）產(chǎn)生的反應來調(diào)節(jié)細胞周期調(diào)節(jié)蛋白的表達。這些通路中的JNK的濃度和持久度決定了細胞在接受外源性調(diào)往信號的刺激時是否會凋亡[13]（圖2）。

2.2.2 MKK4－P38與細胞周期 越來越多的研究表明，MKK4能激活P38進而參與細胞周期的調(diào)節(jié)，在用MKK4缺陷胚胎成纖維細胞研究P38是否有激活障礙的實驗過程中，當受到的刺激是TNF和白細胞介素－1的時候，P38的活化明顯受限。在缺乏特異性激活P38的MKK3，MKK6的胚胎成纖維細胞中，MKK4接受紫外線的刺激能激活P38的實驗也證明MKK4能激活P38。在這個試驗中還觀察到可以通過改變MKK4的水平來調(diào)節(jié)P38活化反應的強弱。與MKK4激活JNK過程中先是酪氨酸殘基磷酸化不同的是，MKK4激活P38過程中是酪氨酸，蘇氨酸殘基同時磷酸化[14]。MKK4激活P38后通過兩條途徑來遏止細胞周期進程，一條是直接磷酸化并抑制cdc25B分子，使CyclinB／cdc2復合物不能被激活，阻止進入有絲分裂。這種機制在腫瘤細胞周期阻滯中非常重要：紫外線和烷化劑類化療藥物能介導這種依賴P38的G1／S或G2／M細胞周期停滯通路[15]。另外一條和JNK一樣通過調(diào)控細胞周期基因的表達使細胞周期停滯或細胞凋亡。JNK和P38都能通過磷酸化活化蛋白－1家族（AP－1）轉錄因子的c－Jun，ATF－2，MEF2C亞基來調(diào)節(jié)AP－1的活性，而一些細胞調(diào)節(jié)蛋白包括Cyclin D1、p53、p21Cip1、p16INK4A、p19Arf都被認為是被AP－1調(diào)節(jié)的靶基因，這些基因的編碼產(chǎn)物都參與調(diào)節(jié)細胞凋亡和DNA損傷反應[16]。

3 MKK4與腫瘤

過去的研究表明MKK4對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的起調(diào)節(jié)作用，MKK4是腫瘤抑制基因或是腫瘤轉移抑制基因，但也有一部分研究提示它是親癌基因。這說明MKK4和它下游的JNK、P38在腫瘤的進展過程中有著更為復雜的作用。

3.1 MKK4基因的突變對腫瘤的抑制作用 抑癌基因的缺失或是失活會促進腫瘤的形成和發(fā)展，MKK4作為抑癌基因的最早在1997年，有研究發(fā)現(xiàn)2株胰腺癌和肺癌細胞株均缺失能編碼MKK4的基因位點。并且他們對88株來自結腸癌，乳腺癌、胰腺癌、睪丸癌的細胞株的研究發(fā)現(xiàn)MKK4基因發(fā)生了2種無意義的突變和3種錯義的突變，而這些突變導致一些MKK4蛋白的關鍵亞基無法合成或者具有重要功能的氨基酸被替換致使無法磷酸化JNK。另一個支持MKK4具有腫瘤抑制作用的是MKK4基因顯性無意義的突變能促使胚胎干細胞變異并提高致瘤性。近年的研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)性的胰腺癌、膽管癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌MKK4基因的錯義或無義的突變率為約。同樣的突變在肺癌內(nèi)也發(fā)現(xiàn)。另外在對胰腺癌的研究中還發(fā)現(xiàn)MKK4（＋）的胰腺癌患者的死亡率只有MKK4（－）胰腺癌患者的一半，MKK4與存活時間相關[17]。

3.2 MKK4的腫瘤轉移抑制作用 MKK4同樣與腫瘤的轉移有關。研究發(fā)現(xiàn)在正常前列腺上皮組織中有高水平的MKK4蛋白表達，前列腺腫瘤組織中MKK4表達顯著降低，并且發(fā)現(xiàn)MKK4的低水平表達與轉移能力有關。有研究將具有高度轉移性的小鼠前列腺癌細胞株AT6.1（缺乏MKK4表達）和轉染了MKK4的該種細胞株（AT6.1－MKK4）注入到重度聯(lián)合免疫缺陷的小鼠體內(nèi)，觀察他們的肺轉移情況。結果顯示與AT6.1（缺乏MKK4表達）的小鼠相比，AT6.1－MKK4的小鼠肺肉眼轉移灶明顯減少，并且存活時間顯著延長，而原發(fā)腫瘤灶無明顯差異。說明了MKK4具有腫瘤轉移抑制作用。同時，在AT6.1－MKK4的小鼠肺內(nèi)發(fā)現(xiàn)了微轉移灶提示腫瘤細胞已從原發(fā)灶逃離但在肺里的生長得到抑制。此外，JNK另外一個激活體MMK7，也能通過抑制AT6.1細胞在肺的克隆來抑制轉移；而P38的激活者MKK6卻不能，說明MKK4是通過介導JNP通路來抑制前列腺癌的轉移。最近Victoria等[18]提出腫瘤細胞內(nèi)MKK4蛋白表達的調(diào)節(jié)是在MKK4 m RNA翻譯MKK4蛋白階段的假說，他們用PCR和免疫印跡法檢測了人類PC3、LNCaP、C4－2、DuPro和DU145前列腺癌細胞株，SKOV3ip.1、SKOV3、CaOV3、Hey A8卵巢癌細胞株，Hela宮頸癌細胞株的MKK4蛋白表達量和MKK4 mRNA量并以小鼠腦細胞作為陽性對照，不表達MKK4的ASPC－1胰腺癌細胞株作為陰性對照。結果發(fā)現(xiàn)在這些不同細胞的細胞核中MKK4蛋白和MKK4 mRNA都沒有明顯的差異，而在胞漿中，MKK4高表達細胞的MKK4蛋白量和MKK4 mRNA量都明顯高于MKK4低表達細胞，提示MKK4表達的調(diào)控在翻譯階段。

Yamada等[19]的研究發(fā)現(xiàn)與正常的卵巢上皮細胞相比，卵巢癌細胞的MKK4蛋白表達同樣降低了，并且MKK4蛋白表達水平高的卵巢癌轉移能力較MKK4缺乏的明顯降低并且存活期延長了70%。將人類卵巢癌細胞株SKOV3ip.1（很少表達MKK4蛋白）和轉染了MKK4的SKOV3ip.1細胞株注射到免疫缺陷的小鼠腹腔中，30d后發(fā)現(xiàn)轉染了MKK4的SKOV3ip.1細胞株引起的網(wǎng)膜轉移灶較無MKK4的降低了88%[20]。

還有研究表明MKK4對腫瘤轉移抑制的調(diào)控可能是通過降低腫瘤細胞的黏附作用、促進細胞凋亡和抑制細胞的增殖實現(xiàn)的。實時定量PCR顯示注入癌細胞株后第3天在網(wǎng)膜上出現(xiàn)的兩組癌細胞并無明顯差別；用鏡下觀察和免疫組化法檢測的兩組微小轉移灶也無明顯差別。用Brd U（S期標記物）和p H3（M期標記物）同時標記到兩組微轉移灶的癌細胞內(nèi)，發(fā)現(xiàn)標記了Brd U和p H3的SKOV3ip.1－MKK4癌細胞較未轉染MKK4的明顯減少，提示SKOV3ip.1－MKK4細胞很少通過細胞周期中的S、M期而處于休眠期或是凋亡狀態(tài)。而在SKOV3ip.1－MKK4細胞中細胞周期抑制蛋白p21明顯增高，約是對照組的10倍[21]。在另外一個卵巢癌動物實驗模型中，發(fā)現(xiàn)p38的另一個激活者MKK6同樣能抑制腫瘤的轉移，而JNK的另一激活者MKK7卻不能，說明MKK4是通過介導p38通路來抑制卵巢癌的轉移。這些研究說明MKK4在不同的器官和不同的環(huán)境下通過介導不同的MAPK通路來發(fā)揮腫瘤轉移抑制作用。

3.3 MKK4的親癌性 并不是所有有關MKK4的研究都支持MKK4基因為抑癌基因，同樣，也有一部分實驗說明MKK4具有促癌作用。在一些缺乏內(nèi)源性MKK4的乳腺癌和胰腺癌細胞株經(jīng)異位表達的MKK4刺激后腫瘤細胞的增殖能力和侵襲力都明顯增強。相反的，用siRNA技術敲除MMK4陽性的乳腺癌細胞株的MKK4基因后發(fā)現(xiàn)癌細胞的非停泊性生長減弱，細胞凋亡易感性和抑制腫瘤生長能力增強。另外，而人支氣管上皮細胞株MKK4基因有意義的突變能增加細胞的增殖能力和侵襲力。這些研究都提示MKK4的親癌性。

此外，Cunningham等[22]用特異性靶向斷裂胰腺癌細胞株PL5的MKK4基因的實驗同樣論證了MKK4的促癌作用。靜脈注射原代PL5細胞或是MKK4（＋）的小鼠，有大部分的小鼠發(fā)生肺轉移；而注射MKK4的小鼠只有少數(shù)發(fā)生肺轉移。當皮下注射MKK4（－）PL5時，小鼠腫瘤的體積翻倍時間較注射原代PL5或MKK4（＋）的明顯延長，都提示MKK4促進腫瘤生長。在促癌作用機制中MKK4主要通過介導JNK通路來促進腫瘤的生長。Huang等[23]用免疫組化和RT－PCR技術對多例喉鱗癌的研究發(fā)現(xiàn)喉鱗癌組織MKK4的陽性表達率遠高于癌旁正常組織MKK4的表達，并且MKK4的陽性表達與淋巴結轉移正相關。Finegan和Tournier[24]建立了一種新的小鼠模型，即用致癌物誘導特異性缺失MKK4的表皮生成乳頭狀瘤。結果發(fā)現(xiàn)特異性缺失MKK4表皮的小鼠能抵抗腫瘤發(fā)生。其機制是MKK4通過激活JNK信號通路來增加表皮生長因子的表達來促進細胞增殖和腫瘤形成?？傊?，這些研究表明MKK4對腫瘤發(fā)生、發(fā)展的調(diào)節(jié)方式取決于不同的條件，并且能根據(jù)不同的組織類型、不同環(huán)境以及與其他的細胞內(nèi)信號通路的相互作用選擇不同的途徑。

4 展 望

MKK4作為MAPK信號傳導通路的構成部分，在調(diào)節(jié)不同腫瘤的發(fā)生發(fā)展所到作用差異性提示它在調(diào)節(jié)過程中可能涉及到多種因子的共同作用，存在著極為復雜的機制，人們的認識并不是十分清楚。因此，還需通過建立合適的實驗模型，加強對MKK4的研究，進一步了解它在不同腫瘤的發(fā)病中機制，明確它與不同腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預后的關系，為腫瘤的早期診斷和個體化靶向治療奠定基礎。

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