楊 虹，彭 芳，劉 杰，吳 芹，時京珍

(貴陽中醫(yī)學(xué)院1.實驗中心基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實驗室，2.生理教研室，貴州貴陽 550002;3.遵義醫(yī)學(xué)院藥理研究室貴州省基礎(chǔ)藥理重點實驗室，貴州遵義 563003)

朱砂為硫化物類辰砂族礦石辰砂，主要成分為硫化汞(HgS)，尚含有少量可溶性汞，具有清心鎮(zhèn)驚以及安神等功效，為中醫(yī)臨床常用，2005版《中國藥典》收載的564種中成藥中，含朱砂制劑約占總數(shù)的7.6%。然而因朱砂中含重金屬汞，各國藥品標(biāo)準(zhǔn)均以總汞含量衡量其毒性，致使朱砂及其復(fù)方汞含量超標(biāo)的問題嚴(yán)重。汞在自然界中有多種存在形式，其吸收分布均有很大的差異，將汞的毒性等同于朱砂的毒性，以總汞含量評價朱砂及其復(fù)方的毒性是否合理?肝是藥物代謝的主要臟器，也是汞的毒性靶器官之一。本文采用短期給藥臨床劑量，探討朱砂及其復(fù)方朱砂安神丸、對比 HgS和氯化汞(HgCl2)對大鼠肝及對金屬硫蛋白、細胞色素P450酶(cytochrome P450，CYP)、結(jié)構(gòu)型雄烷受體(constitutive and rostane receptor，CAR)等基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1 動物

清潔級SD大鼠，雄性，體質(zhì)量200～226 g，購自重慶騰鑫比爾實驗動物銷售有限公司，動物許可證號:SCXK(渝)2007-0008。

1.2 藥品與試劑

朱砂(亳州市京晥中藥飲片廠，水飛炮制品)、HgCl2(貴州省萬山特區(qū)礦產(chǎn)公司)、朱砂安神丸水蜜丸(哈藥集團世一堂制藥廠)、HgS(美國Sigma公司)、Trizol和RNA純化試劑盒(北京Tiangen)、High capacity RT試劑盒和POWER SYBR?GREEN PCRMaster Mix(美國ABI公司)、引物設(shè)計與合成(上海捷瑞生物工程有限公司)。

1.3 主要儀器

F732-V型冷原子吸收測汞儀(上海華光儀器儀表廠)，RealTime-PCR(美國 Bio-Rad 公司)，TU-1810紫外-可見分光光度計 (北京通用分析儀器公司)。Master Cycler Gradient PCR儀(德國eppendorf公司)。

1.4 動物分組給藥

健康雄性SD大鼠30只，隨機分為5組，正常對照組、HgS組、朱砂組、朱砂安神丸組和HgCl2組，每組6只。按照分組分別ig給予等量生理鹽水、HgS 0.15 g·kg－1(含汞 0.13 g·kg－1)、朱砂0.15 g·kg－1(含汞 0.13 g·kg－1)、朱砂安神丸1.4 g·kg－1(含汞0.13 g·kg－1，為臨床 0.2 g·kg－1等效劑量)、HgCl20.02 g·kg－1(含汞 0.015 g·kg－1)，每天 1 次，連續(xù)21 d，斷頭取血，取肝組織。

1.5 大鼠一般情況觀察和體質(zhì)量測定

給藥期間觀察大鼠精神狀態(tài)、毛發(fā)質(zhì)量、活動情況和進食情況。于給藥第1，6，13和21天稱取大鼠體質(zhì)量，繪制體質(zhì)量變化曲線。

1.6 肝指數(shù)的測定

取肝稱濕重，計算肝指數(shù)。肝指數(shù)=肝質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。

1.7 血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase，ALT)的檢測

斷頭取大鼠血，以900×g，4℃離心10 min后吸取血清，全自動生化分析儀測定ALT含量。

1.8 大鼠肝汞蓄積量的檢測

冷原子吸收光譜法檢測大鼠肝組織中汞蓄積量。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:汞40 μg·L－1標(biāo)準(zhǔn)液，依次吸取0，2，4，6，8 和10 ml至反應(yīng)瓶中，定容至25 ml，分別加入氯化亞錫100 g·L－1溶液2 ml，迅速蓋緊瓶塞記錄反應(yīng)峰值，根據(jù)結(jié)果制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。取一定量大鼠肝組織放入消化罐中，加入濃 HNO35 ml，170℃消化2 h后將消化液定容至25 ml。分別加入氯化亞錫100 g·L－1溶液2 ml，迅速蓋緊記錄峰值，根據(jù)結(jié)果計算大鼠肝中的汞蓄積量。

1.9 實時RT-PCR方法測定基因表達

取50～100 mg肝組織，采用Trizol一步法提取總RNA，按照RNA純化試劑盒說明純化，得100 μl RNA純化液。紫外分光光度計檢測RNA純度，配置 2000 mg·L－1的 RNA 樣品稀釋液 50 μl。取 5 μl RNA稀釋液按High Capacity RT試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，稀釋成100 mg·L－1備用。引物序列見表1。逆轉(zhuǎn)錄條件:25℃ ×10 min，37℃ ×2 h，85℃ ×5 min，4℃后取出。PCR 擴增:配置 15 μl反應(yīng)體系，包 括 3 μl cDNA 稀 釋 液，7.5 μl POWER SYBR?GREEN PCRMaster Mix，混合引物(表1)0.5 μl，DEPC 水 4 μl。反應(yīng)條件:95℃ × 10 min，3個循環(huán);95℃ ×10 s，60℃ ×1 min，40 個循環(huán);95℃ ×1 min，55℃ ×1 min;55℃ ×10 s，80 個循環(huán)。根據(jù)結(jié)果對基因表達進行相對定量?；蛳鄬Ρ磉_(%)=目的基因的表達/內(nèi)參基因的表達×100%。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 朱砂安神丸、朱砂、硫化汞和氯化汞對大鼠日常行為的影響

與正常對照組相比，給藥初期，HgCl2組大鼠進食明顯減少，不喜活動。給藥中后期，精神較差，毛質(zhì)粗糙微泛黃，毛發(fā)排列混亂不服貼，喂藥反抗明顯。其他組大鼠精神狀態(tài)良好，飲食活動等無明顯差異。

2.2 朱砂安神丸、朱砂、硫化汞和氯化汞對大鼠體質(zhì)量的影響

大鼠體質(zhì)量變化見圖1。汞含量約為朱砂安神丸汞含量1/10的HgCl2，給藥后立即出現(xiàn)體質(zhì)量負增長，第6天體質(zhì)量緩慢增長。與正常對照組相比，HgCl2組大鼠第6，13，21天體質(zhì)量均明顯降低(P＜0.05);但HgS、朱砂和朱砂安神丸組大鼠第6，13，21天體質(zhì)量與對照組沒有顯著差異。

Tab.1 Sequences of the primers

Fig.1 Effect of different mercury compounds on body mass of rats.Thirty male SD rats were orally gavaged normal saline，HgS 0.15 g·kg－1，cinnabar 0.15 g·kg－1，Zhusha Anshenwan 1.4 g·kg－1and HgCl20.02 g·kg－1，once daily，for 21 d.Animal body mass gain was calculated at the beginning，on the sixth，the thirteenth，and twenty first day.±s，n=6.*P＜0.05，compared with corresponding normal control group.

2.3 朱砂安神丸、朱砂、硫化汞和氯化汞對大鼠肝指數(shù)和血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶的影響

如表2所示，與正常對照組相比，HgS，朱砂和朱砂安神丸和HgCl2組大鼠肝指數(shù)和ALT含量均無統(tǒng)計學(xué)差異，但HgCl2組大鼠肝指數(shù)有所升高。

Tab.2 Effect of mercury compounds on liver index and serum alanine transaminase(ALT)activity in rats

2.4 朱砂安神丸、朱砂、硫化汞和氯化汞對大鼠肝組織中汞蓄積量的影響

如圖2所示，與正常對照組相比，HgCl2組大鼠組織汞蓄積量明顯升高(P＜0.05)，而HgS、朱砂和朱砂安神丸組無明顯差異。

2.5 朱砂安神丸、朱砂、硫化汞和氯化汞對大鼠肝組織基因表達的影響

2.5.1 朱砂安神丸、朱砂、硫化汞和氯化汞對大鼠肝組織MT-2 mRNA表達的影響

如圖3所示，與正常對照組相比，HgCl2組大鼠肝組織MT-2基因相對表達量明顯增高(P＜0.05)，表明HgCl2可明顯上調(diào)MT-2基因的表達，而其他組沒有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異。

Fig.2 Hg contents in the livers of different mercury compounds-treated rats.See Fig.1 for animal treatment.Livers were colffected at the end of experiment and Hg contents were determined by the cold atomic absorption spectrometry.1.Normal control;2.HgS;3.cinnabar;4.Zhusha Anshenwan;5.HgCl2.±s，n=6.*P＜0.05，compared with normal control group.

Fig.3 Effect of different mercury compounds on expressions of MT-2 mRNA in the livers.See Fig.1 for animal treatment.MT-2 relative expression(%)=MT-2 gene expression/β-actin gene expression×100%.1:normal control;2:HgS;3:cinnabar;4:Zhusha Anshenwan;5:HgCl2.±s，n=6.*P＜0.05，compared with normal control group.

2.5.2 朱砂安神丸、朱砂、硫化汞和氯化汞對大鼠肝組織CYP1A1，CYP1A2，CYP3A2和CYP4A10基因表達的影響

由表3可見，與正常對照組相比，HgCl2組大鼠CYP1A1和CYP1A2基因表達明顯增高(P＜0.05)，CYP4A10基因表達有增高趨勢但沒有統(tǒng)計學(xué)意義。朱砂組CYP3A2基因表達明顯升高(P＜0.05)，而HgS組、朱砂安神丸組沒有統(tǒng)計學(xué)差異。

2.5.3 朱砂安神丸、朱砂、硫化汞和氯化汞對大鼠肝組織CAR及CYP2B1基因表達的影響

由表4可見，與正常對照組相比，HgCl2組CAR基因表達明顯降低(P＜0.05)，其他組沒有統(tǒng)計學(xué)差異。CYP2B1基因表達各組之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異。

Tab.3 Effect of different mercury compounds on mRNA expressions of CYP1A1，CYP1A2，CYP3A2 and CYP4A10

Tab.4 Effect of different mercury compounds on mRNA expressions of CAR and CYP2B1 in livers of rats

3 討論

朱砂安神丸出自李東垣名作《內(nèi)外傷辨惑論》一書，以朱砂為君，黃連為臣，生地、當(dāng)歸為佐，甘草為使，可清心養(yǎng)血，鎮(zhèn)驚安神，為我國中醫(yī)臨床常用，然而其全方含汞約9%[1]，臨床使用是否安全遭到質(zhì)疑。HgS是朱砂中的主要成分，2010藥典規(guī)定炮制朱砂的HgS含量不得低于98%，其在水中的解離度極小(溶度積為 Ksp=10－52)，口服吸收率僅為0.2%。HgS是否為朱砂及其復(fù)方朱砂安神丸產(chǎn)生藥理、毒理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，目前尚無定論[2]。本實驗研究表明，短期以臨床劑量給予朱砂安神丸，相同汞含量的情況下比較HgS、朱砂、朱砂安神丸三者的毒性，三組大鼠體征沒有明顯改變，肝汞蓄積量，肝指數(shù)、生化指標(biāo)檢測均與正常組沒有明顯差異。HgCl2為可溶性二價汞，其在體內(nèi)的吸收率為7%～15%，遠高于HgS。本實驗結(jié)果顯示，給予HgCl20.02 g·kg－1(含汞0.015 g·kg－1，約 1/10 朱砂中汞含量)，其在肝組織內(nèi)的汞蓄積量明顯高于其他各組，肝較其他各組有增大趨勢。HgCl2組在給藥初期體質(zhì)量明顯降低，給藥中后期體質(zhì)量增加緩慢，提示持續(xù)給藥后體內(nèi)的解毒機制可能發(fā)揮了作用，但隨著給藥時間延長，機體對HgCl2出現(xiàn)不能耐受的趨勢。

MT富含巰基，可大量結(jié)合金屬，并可被金屬誘導(dǎo)合成增加，具有抗氧化損傷、重金屬解毒等作用[3]。在本實驗中，HgCl2組大鼠肝組織MT-2基因表達顯著增高，可明顯上調(diào)MT-2基因的表達。而HgS、朱砂、朱砂安神丸組與正常組的MT-2基因表達沒有明顯差異，均未觸發(fā)MT-2基因表達。

CYP酶系是參與體內(nèi)藥物代謝的主要酶系，CYP1A1，CYP1A2均可激活前致癌物導(dǎo)致癌癥的發(fā)生[4]。同時，重金屬可誘導(dǎo) CYP1A1 的表達[5]，在亞慢性小鼠汞暴露實驗中，甲基汞2.6 mg·kg－1可誘導(dǎo)CYP1A1基因表達上調(diào)[6]。本實驗中HgCl2組已明顯誘導(dǎo)CYP1A1，CYP1A2基因表達的增高，而HgS、朱砂和朱砂安神丸組與正常對照組的CYP1A1，CYP1A2基因表達沒有明顯差異。

CYP3A2是大鼠體內(nèi)重要的CYP3A亞型，臨床上有超過60%的藥物通過CYP3A代謝，是參與首過效應(yīng)的重要代謝酶。本實驗中朱砂組明顯上調(diào)了CYP3A2的基因表達，HgS、朱砂安神丸、HgCl2組則與正常組沒有顯著差異，在何海洋等[7]小鼠急性毒性實驗、陸遠富等[6]亞慢性小鼠毒性實驗中，朱砂300 mg·kg－1均明顯上調(diào)小鼠 CYP3A11 mRNA 表達，提示朱砂在與其他藥物聯(lián)用時可能影響其首過消除。

CYP4A10是人類CYP4A11的異體同工酶，該基因?qū)Ω味疚锩舾衃8]，易被肝致癌物誘導(dǎo)。同時，CYP4A10表達上調(diào)可導(dǎo)致肝內(nèi)氧應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化作用增強，誘發(fā)炎癥反應(yīng)而發(fā)生非酒精性脂肪肝[9]。本實驗中HgCl2組CYP4A10表達雖與正常組無統(tǒng)計學(xué)意義，但有增高趨勢，而其他各組并未發(fā)現(xiàn)這個誘發(fā)趨勢。

結(jié)構(gòu)型雄烷受體CAR是核受體超家族的重要成員，主要存在于肝，參與調(diào)節(jié)多種藥物代謝酶，與外源性物質(zhì)代謝以及肝疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[10]。CAR可參與疏水性膽汁酸石膽酸的解毒過程，CAR的表達缺失可能導(dǎo)致膽汁淤積和肝損傷[11];CAR可以調(diào)節(jié)幾乎所有膽紅素轉(zhuǎn)運轉(zhuǎn)化排泄的相關(guān)代謝酶和轉(zhuǎn)運體，CAR表達抑制可引起膽紅素聚集，引發(fā)高膽紅素血癥而產(chǎn)生黃疸[12]。本實驗中HgCl2組明顯降低了CAR基因表達，而其他各組與正常組沒有統(tǒng)計學(xué)差異。

大鼠CYP2B1受CAR通路調(diào)節(jié)，在小鼠體內(nèi)的同工酶為CYP2B9，人體內(nèi)為CYP2B6。參與多種毒物代謝及大約7%的常用藥物代謝[13]。本實驗中，HgCl2組CAR基因表達下調(diào)，但各組CYP2B1基因表達沒有統(tǒng)計學(xué)差異。在何海洋等[7]小鼠急性汞暴露實驗中，朱砂安神丸10 g·kg－1、朱砂 0.3 g·kg－1下調(diào)了小鼠 CYP2B9基因，而在陸遠富等[6]朱砂300 mg·kg－1和 HgCl232 mg·kg－1連續(xù)給藥 44 d 實驗中，小鼠CYP2B9基因則被誘導(dǎo)表達增高。以上實驗結(jié)果提示，大鼠CYP2B1基因與小鼠CYP2B9基因可能具有種屬差異性，同時其表達與給藥劑量和給藥時間有關(guān)。

課題組前期通過急性毒性實驗和亞慢性毒性實驗結(jié)果表明，朱砂及其復(fù)方朱砂安神丸未對肝造成明顯損傷，其毒性與HgCl2、甲基汞等汞存在形式相差甚遠[14－17]。本研究結(jié)果中 MT-2，P450 酶、核受體CAR在基因水平發(fā)生的變化是否會導(dǎo)致相應(yīng)酶活性的改變以及蛋白質(zhì)含量上的變化，這些還有待進一步的研究。

綜上所述，HgCl2在肝內(nèi)大量蓄積，機體可通過調(diào)動相關(guān)解毒蛋白如MT減輕HgCl2對肝組織的傷害。HgCl2可明顯改變P450酶基因的表達，下調(diào)CAR基因的表達。而HgS、朱砂、朱砂安神丸尚未明顯改變上述基因的表達，但朱砂可能影響其他肝代謝藥物的首過效應(yīng)。

[1]Chen B，Liu CN.Content determination of HgS and berberine hydrochloide in Zhushaanshenwan[J].Shandong Med Industry(山東醫(yī)藥工業(yè))，2003，22(1):12-13.

[2]Liang AH，Shang MF.General situation of the study on the toxicity of cinnabaris[J].China J Chin Mater Med(中國中藥雜志)，2005，30(4):249-252.

[3]Klaassen CD，Liu J，Choudhuri S.Metallothionein:an intracellular protein to protect against cadmium toxicity[J].Annu Rev Pharmacol Toxicol，1999，39:267-294.

[4]Androutsopoulos VP， Tsatsakis AM， Spandidos DA.Cytochrome P450 CYP1A1:wider roles in cancer progression and prevention[J].BMC Cancer，2009，9:187.

[5]Kann S，Huang MY，Estes C，Reichard JF，Sartor MA，Xia Y，et al.Arsenite-induced aryl hydrocarbon receptor nuclear translocation results in additive induction of phaseⅠ genes and synergistic induction of phaseⅡgenes[J].Mol Pharmacol，2005，68(2):336-346.

[6]Lu YF， Wu Q， Liang SX， Miao JW，Shi JS，Liu J.Evaluation of hepatotoxicity potential of cinnabar-containing An-Gong-Niu-Huang Wan，a patent traditional Chinese medicine[J].Regul Toxicol Pharmacol，2011，60(2):206-211.

[7]He HY，Wu Q，Liu J，Shi JZ.Effect of cinnabar and Zhusha Anshen Pill on the expression of cytochrome P450 mRNA in mouse liver[J].Lishizhen Med Mater MedRes(時珍國醫(yī)國藥)， 2011， 22(6):1373-1375.

[8]Bartosiewicz MJ，Jenkins D，Penn S，Emery J，Buckpitt A.Unique gene expression patterns in liver and kidney associated with exposure to chemical toxicants[J].J Pharmacol Exp Ther，2001，297(3):895-905.

[9]Leclercq IA，F(xiàn)arrell GC，F(xiàn)ield J，Bell DR，Gonzalez FJ，Robertson GR.CYP2E1 and CYP4A as microsomal catalysts of lipid peroxides in murine nonalcoholic steatohepatitis[J].J Clin Invest，2000，105(8):1067-1075.

[10]Tien ES，Negishi M.Nuclear receptors CAR and PXR in the regulation of hepatic metabolism[J].Xenobiotica，2006，36(10-11):1152-1163.

[11]Guo GL，Lambert G，Negishi M，Ward JM，Brewer HB Jr，Kliewer SA，et al.Complementary roles of farnesoid X receptor，pregnane X receptor，and constitutive androstane receptor in protection against bile acid toxicity[J].J Biol Chem，2003，278(46):45062-45071.

[12]Wagner M， Halilbasic E， Marschall HU， Zollner G，F(xiàn)ickert P，Langner C，et al.CAR and PXR agonists stimulate hepatic bile acid and bilirubin detoxification and elimination pathways in mice[J].Hepatology，2005，42(2):420-430.

[13]Hodgson E， Rose RL. Theimportance of cytochrome P4502B6 in the human metabolism of environmental chemicals[J].Pharmacol Ther，2007，113(2):420-428.

[14]Kang F， Wu K， He HY， Wu Q，Liu J，Kang YJ，et al.Comparative toxicology study of cinnabar，Zhusha Anshenwan，methylmercury and mercuric chloride[J].China J Chin Mater Med(中國中藥雜志)，2010，35(4):499-503.

[15]He HY，Kang F，Yan JW，Liu J，Shi JZ.Comparative studies on acute toxicity of cinnabar，Zhusha Anshenwan，mercuric chloride and mercurous chloride[J].Chin J Exp Tradit Med Form(中國實驗方劑學(xué)雜志)，2011，17(2):219-223.

[16]Shi JZ， Kang F， Wu Q， Lu YF，Liu J，Kang YJ.Nephrotoxicity of mercuric chloride，methylmercury and cinnabar-containing Zhu-Sha-An-Shen-Wan in rats[J].Toxicol Lett，2011，200(3):194-200.

[17]Liu J，Shi JZ，Yu LM，Goyer RA，Waalkes MP.Mercury in traditional medicines:is cinnabar toxicologically similar to common mercurials[J]?Exp Biol Med(Maywood)，2008，233(7):810-817.