賴 穎，趙錦慧

（周口師范學(xué)院 生命科學(xué)系，河南 周口 466001）

穿山龍為薯蕷科植物穿龍薯蕷的干燥根莖，又名野山藥、串地龍、地龍骨，藥用部分為根莖［1］.穿山龍味苦、性平、歸肝肺經(jīng)、功效祛風(fēng)除濕、活血通絡(luò)、止咳平喘.主要用于治療風(fēng)寒濕痹、肌膚麻木、筋骨疼痛、關(guān)節(jié)屈伸不利、跌打損傷、瘀滯作痛、冠心病、痰多咳喘等癥.主要分布于遼寧、吉林、黑龍江、河北、內(nèi)蒙、陜西、山西等省份［2］.

穿山龍含豐富的薯蕷皂苷（Diosein）［3］，薯蕷皂苷經(jīng)代謝產(chǎn)生的薯蕷皂苷元是發(fā)揮作用的成分.低糖基的穿山龍薯蕷皂苷元會被生命體所吸收，發(fā)揮療效.穿山龍薯蕷皂苷酶能夠特異性地水解穿山龍薯蕷皂苷上的鼠李糖基，生成低糖基穿山龍薯蕷皂苷.獲得皂苷水解酶主要有2種途徑，一是從植物或者動物中直接提取；二是通過微生物發(fā)酵.然而，當(dāng)前國內(nèi)外的研究多集中在通過篩選產(chǎn)穿山龍薯蕷皂苷酶微生物，實現(xiàn)對穿山龍薯蕷皂苷糖苷酶的發(fā)酵生產(chǎn)，從動物中直接提取的酶方面的相關(guān)報道非常少.筆者從動物源牛肝中提取得到較高活力的穿山龍薯蕷皂苷酶，并對該酶的部分酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，旨在為合理開發(fā)利用該酶奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實驗材料、主要試劑與儀器

1.1.1 實驗材料

新鮮牛肝1 000g，穿山龍干粉1 000g.

1.1.2 主要試劑

醋酸鈉，正丁醇，硫酸銨，硫酸，氯化鉀，聚丙烯酰胺.以上試劑均為分析純.

1.1.3 儀器

集熱式磁力攪拌儀，精密酸度儀，數(shù)顯恒溫水浴鍋，真空泵，冷凍離心機.

1.2 酶的提取

稱取500g新鮮的牛肝放入攪拌器，加入3倍體積的 HAc－NaAc緩沖液（0.02mol／L，pH5.0），攪拌成糊狀后，倒入洗凈的燒杯中，將燒杯放入冰水中沉淀30～40min，用高速冷凍離心機在8 000 r／min，4℃下離心10min，除去雜質(zhì)，收集含酶的上清液.依次用不同飽和度的硫酸銨進(jìn)行沉淀.

1.3 測酶活力的方法

各取0.1mL穿山龍底物與酶液混合，在特定條件下反應(yīng)4h后用0.2mL水飽和正丁醇終止酶反應(yīng)，搖勻，靜止使其分層，取上層溶液作薄板層析，每個點點樣量為10μL，展開劑為V（氯仿）∶V（甲醇）∶V（水）＝7∶3∶0.5.噴硫酸顯色后掃描打印，應(yīng)用工具軟件BandScan分析圖片.

1.4 牛肝源穿山龍皂苷酶酶學(xué)性質(zhì)研究

1.4.1 最適硫酸銨飽和度的確定

分別取飽和度為40%，45%，50%，55%，60%，65%，70%的硫酸銨沉淀的酶液0.1mL與0.1mL的底物混合，于37℃下反應(yīng)12h，然后加入0.2mL水飽和正丁醇終止反應(yīng)，作薄層層析檢測酶活，看底物的水解情況.

1.4.2 酶反應(yīng)的最適時間

在最佳底物濃度的基礎(chǔ)上，各取0.1mL穿山龍底物與酶液混合，分別于37℃下反應(yīng)0.5h，1 h，1.5h，2h，2.5h，3h，3.5h，4h，6h，8h，然后作薄層層析檢測，看底物的水解情況.

1.4.3 酶反應(yīng)的最適溫度

在上述最佳條件下，各取0.1mL穿山龍底物與酶液混合，分別于32℃，37℃，42℃，47℃ ，52℃，57℃下反應(yīng).然后作薄層層析檢測，看底物的水解情況.

1.4.4 酶反應(yīng)的最適底物濃度

分別配制底物濃度為0.2%，0.3%，0.4%，0.5%，0.6%，0.8%，1.0%，1.2%，2.0%，3.0%的10種穿山龍底物，各取0.1mL穿山龍底物與酶液等比例混合，于42℃下反應(yīng)4h，然后作薄層層析檢測，看底物的水解情況.

1.4.5 酶反應(yīng)的最適pH值

分別配制0.02mol／mL的pH值為4.0，4.4，4.8，5.2，5.6的 HAc－NaAc緩沖溶液，再分別用各緩沖溶液溶解底物穿山龍，在上述最佳條件下與酶液反應(yīng)，然后作薄層層析檢測，看底物的水解情況.

2 結(jié)果與分析

2.1 硫酸銨分級沉淀牛肝源穿山龍皂苷酶的最適濃度

用不同飽和度硫酸銨沉淀的酶液與穿山龍底物反應(yīng)，在薄層層析板上反應(yīng)生成物和反應(yīng)底物斑點濃度大小的圖像如圖1所示.

圖1 分級沉淀的酶對穿山龍皂苷酶酶活的影響

圖1產(chǎn)物層析位點的大小代表產(chǎn)物的多少，產(chǎn)物越多點越大，反應(yīng)越完全，也就代表轉(zhuǎn)化率越高.通過圖1和表2可知：硫酸銨飽和度為55%沉淀的酶有較強的催化能力，轉(zhuǎn)化率較高.

表1 硫酸銨飽和度濃度配比對酶反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響

2.2 酶反應(yīng)的最佳底物濃度

配制穿山龍的底物濃度分別為0.2%，0.3%，0.4%，0.5%，0.6%，0.8%，1.0%，1.2%，2.0%，3.0%，各取0.1mL與等量的酶液進(jìn)行反應(yīng)，然后進(jìn)行薄層層析，測定酶活力如圖2所示：

圖2 穿山龍皂苷酶與不同濃度底物反應(yīng)的薄層層析圖

表2 底物濃度對酶反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響

由以上數(shù)據(jù)可得出結(jié)論：穿山龍皂苷酶反應(yīng)的最佳底物濃度為2.0%.

2.3 酶反應(yīng)的最佳時間

取0.1mL濃度為2%的底物與酶液1∶1混合，置于40℃下分別反應(yīng)0.5h，1h，1.5h，2h，2.5h，3h，3.5h，4h，6h，進(jìn)行薄層層析，測定酶活力.如圖3所示：

圖3 酶反應(yīng)不同時間的薄層層析圖

分析以上數(shù)據(jù)得：反應(yīng)4h時產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率最高，為最佳反應(yīng)時間.

表3 酶反應(yīng)時間對酶反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響

2.4 酶反應(yīng)的最適溫度

在上述確定的最適條件下，各取0.1mL 0.2%底物溶液與酶液混合，分別于32℃，37℃，42℃，47℃，52℃，57℃下反應(yīng)，進(jìn)行薄層層析，測定酶活力，以確定酶反應(yīng)最適溫度，結(jié)果見圖4.

圖4 酶反應(yīng)不同溫度時的薄層層析圖

表4 酶反應(yīng)最適溫度對酶反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響

分析以上數(shù)據(jù)可知：穿山龍皂苷酶反應(yīng)的最適溫度為42℃.

2.5 酶反應(yīng)的最適pH值

分別配制0.02mol／mL pH值分別為4.0～5.6的緩沖溶液，再用各個緩沖液溶解底物，在上述條件下反應(yīng)，然后做薄層層析，測定其酶活力，確定最適的pH值，如圖5所示.

分析以上數(shù)據(jù)可知：酶反應(yīng)的最適pH值為5.2.

表5 酶反應(yīng)最適pH對酶反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響

圖5 酶反應(yīng)不同pH的薄層層析圖

3 討論

本文對由動物產(chǎn)的穿山龍薯蕷皂苷酶的部分酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究.由于采用的是來源于動物器官的酶，因此需要進(jìn)行前期的原料保存、原料破碎、細(xì)胞破碎等預(yù)處理，預(yù)處理過程繁瑣且容易出現(xiàn)變質(zhì)的問題.因此，筆者認(rèn)為可以選取微生物來源的酶代替動物源的酶作用于底物，可以簡化實驗前期的處理過程.實驗中筆者發(fā)現(xiàn)，穿山龍底物在該酶的作用下，不同的反應(yīng)時間所生成的產(chǎn)物的種類有所不同，當(dāng)反應(yīng)時間小于2h產(chǎn)物分子量偏大，終產(chǎn)物的量較少，當(dāng)反應(yīng)大于2h產(chǎn)物的分子量偏小，終產(chǎn)物量增加.本實驗的最佳反應(yīng)時間為4h，因此，推測該酶可能是一種外切酶.本文中對于該酶的酶反應(yīng)機理不甚明了，還有待于今后對酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的深入研究得以闡述清楚.

［1］Angulo P，Lindor KD.Treatment of nonalcoholic fatty liver：present and emerging therapies［J］.Semin Liver Dis，2001，21（1）：81－88.

［2］張克義，常天輝，李伯堅，等.穿山龍冠心寧及水溶性皂甙對小鼠心肌營養(yǎng)性血流量的影響［J］.中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1982，11（3）：10.

［3］Yoneda M，F(xiàn)ujita K，Iasaki T，et a1.Treatment of NASH：nutritional counseling and physical exercise［J］.Nippon Rinsho，2006，64（6）：1139－1145.