李沛軍，孔保華，鄭冬梅，陳 倩

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

一次過(guò)柱法快速分離純化驢心肌中高鐵肌紅蛋白

李沛軍，孔保華*，鄭冬梅，陳 倩

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

肌紅蛋白及其存在形式是決定肉和肉制品色澤的重要因素，高鐵肌紅蛋白為其重要存在形式之一。以馬科動(dòng)物－驢的心肌為原料，采用70%～100%飽和硫酸銨分段鹽析法粗提肌紅蛋白，加入鐵氰化鉀氧化后透析，經(jīng)CMSephadex Fast Flow陽(yáng)離子交換柱層析進(jìn)行一步純化。SDS－PAGE電泳和紫外/可見(jiàn)光光譜掃描結(jié)果表明，僅通過(guò)一次柱交換，即可得到電泳純的高鐵肌紅蛋白，為快速提取、純化高鐵肌紅蛋白提供了一條途徑。

驢心肌，高鐵肌紅蛋白，純化，電泳純

肉的色澤是影響消費(fèi)者購(gòu)買肉制品的重要因素[1－2]。肉的顏色主要取決于肌肉中的兩種色素蛋白質(zhì)，即血紅蛋白和肌紅蛋白的含量，以及血色素存在的形式。肌紅蛋白為肉自身的色素蛋白，肉色的深淺與其含量多少有關(guān)；血紅蛋白存在于血液中，對(duì)肉顏色的影響要視放血情況而定。放血良好的肉，肌肉中肌紅蛋白色素占80%～90%，比血紅蛋白豐富的多[3]，是決定肉顏色的主要因素。肌紅蛋白是一種球狀的血紅素蛋白，分子量約為17000[4]，在動(dòng)物的需氧器官和心室中含量豐富。在通常條件下，肌紅蛋白（Myoglobin，Mb）有三種存在形式：還原型肌紅蛋白（DMb）、氧合肌紅蛋白（MbO2）、高鐵肌紅蛋白（Met－Mb）[5]。純品肌紅蛋白主要用于肌肉基礎(chǔ)[6]和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究[7－8]。目前我國(guó)的純品肌紅蛋白主要依靠進(jìn)口，價(jià)格昂貴，國(guó)內(nèi)企業(yè)尚無(wú)肌紅蛋白商品生產(chǎn)。在肉品科學(xué)研究中，很多研究都需要應(yīng)用到純品肌紅蛋白，用于研究肉制品的顏色變化[9]，以及相關(guān)酶的作用[10]。關(guān)于對(duì)肌紅蛋白的分離純化有一些報(bào)道。湯祥明、Chaijan和Enoki分別采用兩次柱層析法，對(duì)豬心肌[11]、鳥骨骼肌[12]和沙丁魚肌肉[13]中肌紅蛋白的提取純化進(jìn)行了研究，方法繁瑣，提取效率不高；Joseph從野牛心肌中提取、純化了肌紅蛋白[14]，方法耗時(shí)多，需要較高的成本[11]。很多報(bào)道中用到的肌紅蛋白均為馬心肌紅蛋白的氧化態(tài)－高鐵肌紅蛋白[15－19]，高鐵肌紅蛋白較還原型肌紅蛋白更為穩(wěn)定，提取時(shí)不需要苛刻的外界條件；而驢（Equus asinus）屬馬科、馬屬[20]，且原料較馬心易得。因此，選用肌紅蛋白含量高的驢心肌作為原料，進(jìn)行提取、純化高鐵肌紅蛋白的研究。本文采用硫酸銨分段鹽析法粗提驢心肌中的高鐵肌紅蛋白，然后通過(guò)一次陽(yáng)離子交換柱層析進(jìn)行純化，以期在較短的時(shí)間內(nèi)得到電泳純的高鐵肌紅蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮驢心 購(gòu)自哈爾濱橫道街市場(chǎng)，4℃冷藏運(yùn)輸；羧甲基纖維素瓊脂糖凝膠（CM－Sepharose Fast Flow） 美國(guó)GE healthcare公司；聚乙二醇（PEG）－20000 德國(guó)merck公司；牛血清白蛋白（BSA） 美國(guó)Sigma Aldrich公司；考馬斯亮藍(lán)試劑盒 南京建成生物工程研究所；肌紅蛋白萃取緩沖液 1mmol/L乙二胺四乙酸二鈉（EDTA），0.05mol/L Na2HPO4－NaH2PO4，pH6.0；層析緩沖液A 1mmol/L EDTA，0.02mol/L Na2HPO4－NaH2PO4，pH6.0；層析液B 0.5mol/L NaCl；其它化學(xué)試劑 均為分析純。

Bio Logic LP低壓層析系統(tǒng)，垂直電泳設(shè)備Mini－PROTEAN Tetra Cell，0.45μm濾膜 美國(guó)BIO－RAD公司；透析袋（截留分子量為8000～14000） 深圳晶美公司；組織搗碎機(jī) 荷蘭Philips公司；高速分散均質(zhì)機(jī) 德國(guó)IKA公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)Allegra 64R，紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)DU－800 美國(guó)Beckman Coulter公司；Delta320 pH計(jì) 上海METTLER－TOLEDO儀器設(shè)備有限公司；真空抽濾系統(tǒng) 上海亞榮生化儀器廠；低壓層析柱（1.5cm×20cm） 上海華美實(shí)驗(yàn)儀器廠；凝膠成像儀 上海天能科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 組織勻漿液的制備 屠宰后新鮮驢心，冰袋低溫保存，運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室，樣品處理按照J(rèn)oseph方法[14]，并進(jìn)行適當(dāng)?shù)男薷模?℃冷庫(kù)中進(jìn)行。取驢心150g，去除脂肪、結(jié)締組織后切成1cm3小塊，生理鹽水漂洗；加入400mL肌紅蛋白萃取緩沖液，移入組織搗碎機(jī)，加入少許冰塊，分多次絞碎，再用高速分散均質(zhì)機(jī)以轉(zhuǎn)速15000r/min，分5次間歇均質(zhì)50s，靜置萃取過(guò)夜。次日取勻漿液于4℃下6000×g離心30min，除去沉淀。取上清液，經(jīng)中速定性濾紙進(jìn)行真空過(guò)濾，除去殘留脂肪。加入過(guò)量鐵氰化鉀（大約1kg心肌組織加入1g鐵氰化鉀）[21]，充分反應(yīng)后測(cè)定溶液總蛋白和高鐵肌紅蛋白含量。

1.2.2 分段鹽析制備高鐵肌紅蛋白粗提液 向上述制備的組織勻漿液中緩慢加入固體硫酸銨，同時(shí)使用磁力攪拌器攪拌，至70%硫酸銨飽和度，4℃萃取30min。在4℃下18000×g離心20min后，棄去沉淀，再向上清液緩慢加入固體硫酸銨至飽和，同時(shí)使用磁力攪拌器攪拌。靜置萃取30min后，于4℃下20000×g離心60min，棄上清液。沉淀用肌紅蛋白萃取緩沖液重新溶解，將溶解液于4℃，18000×g離心10min，除去不溶性物質(zhì)。最后將濾液通過(guò)0.45μm濾膜過(guò)濾，在層析緩沖液A中，4℃透析24h，期間多次換液。透析液用PEG－20000濃縮。

1.2.3 高鐵肌紅蛋白的陽(yáng)離子交換層析 取1.5cm× 20cm層析柱，潔凈并安裝好。將經(jīng)過(guò)溶脹，并經(jīng)過(guò)層析緩沖液A漂洗的CM－Sephadex Fast Flow柱料攪動(dòng)倒入層析柱，并用上述緩沖溶液平衡。將經(jīng)PEG－20000濃縮后的粗提液上樣至層析柱，先用層析緩沖液A洗去未結(jié)合的蛋白，再使用層析緩沖液A（100%～40%），層析液B（0%～60%）進(jìn)行連續(xù)梯度洗脫。洗脫速度為0.4mL/min。280nm下自動(dòng)檢測(cè)吸光值并記錄，自動(dòng)收集器以每管2mL的體積自動(dòng)收集洗脫液。

1.2.4 肌紅蛋白鑒定 根據(jù)肌紅蛋白已知特性，其分子量為17000左右[4]，而高鐵肌紅蛋白溶液在350～700nm范圍內(nèi)有特征吸收峰[22]，故采用十二烷基磺酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）和紫外－可見(jiàn)光譜掃描兩種方法對(duì)所得樣品進(jìn)行鑒定。

1.2.4.1 蛋白的SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）SDS－PAGE按照Laemml方法進(jìn)行，并做適當(dāng)修改[23]，對(duì)肌紅蛋白粗提液、層析后各組分中蛋白質(zhì)進(jìn)行凝膠電泳。分離膠濃度是10%，濃縮膠濃度是5%。電泳膠片置于凝膠成像儀中進(jìn)行攝像，結(jié)合Tanon軟件進(jìn)行分析和處理。

1.2.4.2 紫外－可見(jiàn)吸收光譜分析 通過(guò)紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)CM－Sephadex Fast Flow層析柱所洗脫下的目標(biāo)峰進(jìn)行光譜掃描，掃描范圍為350～700nm，掃描間隔為1nm。

1.2.5 總蛋白濃度測(cè)定和高鐵肌紅蛋白濃度測(cè)定

1.2.5.1 總蛋白濃度測(cè)定 總蛋白質(zhì)濃度測(cè)定采用Bradford法[24]，按照說(shuō)明書使用考馬斯亮藍(lán)試劑盒進(jìn)行測(cè)定，以牛血清白蛋白（BSA）作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，使用紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)，于595nm波長(zhǎng)處比色。做出標(biāo)準(zhǔn)曲線后，通過(guò)測(cè)定樣品吸光值，計(jì)算出其總蛋白濃度。

1.2.5.2 高鐵肌紅蛋白濃度測(cè)定 高鐵肌紅蛋白濃度采用Krzywicki的方法進(jìn)行測(cè)定[25]，高鐵肌紅蛋白百分含量計(jì)算公式如下：

其中，R1、R2和R3分別代表A572/A525、A565/A525和A545/ A525，而A572、A565、A545和A525則分別表示測(cè)定溶液在對(duì)應(yīng)不同波長(zhǎng)下的吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 CM-Sephadex陽(yáng)離子交換層析

將含有肌紅蛋白的粗提液用平衡緩沖液A透析24h，上樣到CM－Sephadex Fast Flow陽(yáng)離子層析柱，可見(jiàn)層析柱內(nèi)的柱料由白色逐漸變成紅褐色。先用平衡緩沖液A洗去未結(jié)合的蛋白，結(jié)合的蛋白再用含0.5mol/L NaCl的同一緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫速度0.4mL/min。約30min記錄儀上出現(xiàn)第一個(gè)洗脫峰B，對(duì)應(yīng)液體為無(wú)色；約140min記錄儀上出現(xiàn)第三個(gè)洗脫峰D，對(duì)應(yīng)液體為紅褐色，250min對(duì)應(yīng)的洗脫峰E液體為深紅色，見(jiàn)圖1。與經(jīng)一次葡聚糖Sephadex G－75凝膠過(guò)濾層析得到的洗脫圖[12－13]相比，CM－Sephadex Fast Flow柱料可將肌紅蛋白粗提液充分洗脫分開，這可能與提取方法、不同層析方式，以及柱料有關(guān)[11]。

圖1 高鐵肌紅蛋白陽(yáng)離子層析圖譜Fig.1 Metmyoglobin ion chromatogram

2.2 SDS-PAGE電泳

把經(jīng)硫酸銨粗提后得到的高鐵肌紅蛋白粗提液及圖1中五個(gè)洗脫峰對(duì)應(yīng)的洗脫樣品，進(jìn)行SDSPAGE電泳實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，粗提液A中不同分子量的蛋白，在經(jīng)過(guò)CM-Sephadex陽(yáng)離子交換柱層析后，得到很好的分離，其中層析圖中D峰對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)分子量大約為17000。而馬心肌紅蛋白[26]、野牛心肌紅蛋白[14]、山羊心肌紅蛋白[27]等多種哺乳動(dòng)物肌紅蛋白分子量均為17000左右[4]。據(jù)此初步判定層析圖中D峰即為目標(biāo)肌紅蛋白峰。

此前對(duì)沙丁魚肌紅蛋白提取純化的報(bào)道中，雖然經(jīng)過(guò)了兩次柱層析，仍可在電泳圖中清晰的看到雜蛋白條帶[12]，而本實(shí)驗(yàn)盡管僅通過(guò)一次柱層析，卻未發(fā)現(xiàn)任何明顯雜蛋白條帶存在。這為更加快速精確地提取、純化電泳純高鐵肌紅蛋白提供了一條解決途徑。

圖2 電泳實(shí)驗(yàn)圖Fig.2 SDS-PAGE pattern

2.3 分光光度計(jì)掃描

先前對(duì)肌紅蛋白分離、純化的報(bào)道中，幾乎都只采用一種方法，主要是SDS-PAGE電泳，對(duì)得到的樣品進(jìn)行鑒定[4，27]。本實(shí)驗(yàn)采用兩種方法對(duì)經(jīng)過(guò)一次柱層析得到的目標(biāo)樣品進(jìn)行鑒定。經(jīng)SDS-PAGE電泳初步鑒定后，將洗脫峰D對(duì)應(yīng)洗脫液在350～700nm處進(jìn)行光譜掃描。圖3的掃描圖譜顯示，該溶液在410、505、630nm處附近有特征吸收峰，這與Millar等的報(bào)道一致[22，28]。據(jù)此可進(jìn)一步判定該蛋白即為高鐵肌紅蛋白。

圖3 D峰對(duì)應(yīng)光譜掃描圖Fig.3 Absorption spectrum of D peak elution

2.4 高鐵肌紅蛋白得率研究

組織勻漿在加入過(guò)量鐵氰化鉀，硫酸銨鹽析和CM-Sephadex Fast Flow柱層析后，分別測(cè)定提取液總蛋白和高鐵肌紅蛋白含量，如表1所示。由于僅通過(guò)一次柱層析，最終得率高達(dá)23.8%，顯著高于經(jīng)過(guò)兩次柱層析，進(jìn)行豬心肌高鐵肌紅蛋白提取的得率（14.1%）[11]。

表1 高鐵肌紅蛋白純化過(guò)程Table 1 Purification process of metmyoglobin

3 結(jié)論

新鮮驢心肌經(jīng)磷酸鹽緩沖液萃取后，采用70%～100%飽和硫酸銨進(jìn)行分段鹽析，加入鐵氰化鉀氧化后透析，經(jīng)CM-Sephadex Fast Flow陽(yáng)離子交換進(jìn)行一次柱層析。結(jié)果表明，層析過(guò)程中第三個(gè)洗脫峰洗脫出的蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)SDS-PAGE電泳結(jié)果為單一條帶，其分子量在17000左右；紫外/可見(jiàn)光光譜掃描分析表明其在410、505、630nm處有特征吸收峰，鑒定其為高鐵肌紅蛋白。這樣，僅通過(guò)一次柱交換，即可得到電泳純的高鐵肌紅蛋白，得率高達(dá)23.8%，為快速、高效提取純化高鐵肌紅蛋白提供了一條途徑。

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Extraction and purification of metmyoglobin from donkey（Equus asinus）heart muscle by single-step chromatography

LI Pei-jun，KONG Bao-hua*，ZHENG Dong-mei，CHEN Qian
（College of Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

Myoglobin and its existing states are responsible for the color of meat and meat products，of which metmyoglobin is an important one.Myoglobin was extracted from donkey（Equus asinus）heart muscle by ammonium sulfate fractionation（70%～100%）.After oxidized by potassium ferricyanide and dialyzed，the sample solution was further purified by CM-Sephadex Fast Flow ion exchange column chromatography.The results of SDS-PAGE electrophoresis and absorption spectra analysis showed that metmyoglobin in electrophoresis pure was obtained by single column chromatography.This provided a fast and efficient way for extraction and purification of metmyoglobin.

donkey heart muscle；metmyoglobin；purification；electrophoresis pure

TS201.2+1

B

1002－0306（2012）01－0200－04

2011－01－17 *通訊聯(lián)系人

李沛軍（1986－），男，博士研究生，研究方向：畜產(chǎn)品加工與貯藏。

國(guó)家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目（200903012－02）；東北農(nóng)業(yè)大學(xué)創(chuàng)新專項(xiàng)基金（CXZ011）。