姜黃素對(duì)IL-1β體外誘導(dǎo)兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分泌IL-8、sICAM-1和NO、PGE2的影響

劉巍 朱雪松 朱新輝 逸弘 楊惠林

1 南通市第一人民醫(yī)院（南通226001） 2 蘇州大學(xué)骨科研究所

骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）的病因與發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，至今尚未完全闡明。合成性細(xì)胞因子和損傷（分解）性細(xì)胞因子在OA發(fā)病、治療中的作用日益受到重視［1］。 白介素 1β（IL-1β）既是 OA 滑膜分泌的主要炎癥因子，又是損害軟骨細(xì)胞、促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨退變的重要因素［2］。IL-1β是引起OA癥狀和體征的主要因素之一，是OA病理生理過(guò)程的中心環(huán)節(jié)。它可以誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞產(chǎn)生MCP-1、IL-8、sICAM-1等細(xì)胞因子，致使炎性細(xì)胞游走、移行至損傷部位，并黏附、聚集導(dǎo)致炎癥反應(yīng)擴(kuò)散［3、4］。 其中 IL-8是嗜中性粒細(xì)胞的重要趨化劑和活化劑，sICAM-1是主要的細(xì)胞粘附分子，二者都與早期炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。

一氧化氮（NO）和前列腺素（PGE2）作為關(guān)節(jié)損傷和基質(zhì)合成抑制的介質(zhì)，在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）、OA和炎癥性關(guān)節(jié)炎（IA）發(fā)病中的作用日益受到重視。OA患者血清和關(guān)節(jié)滑液中NO、PGE2含量顯著升高［5］。一氧化氮合酶抑制劑在關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型中能顯著改變關(guān)節(jié)破壞的過(guò)程［6］。IL-1β在體外刺激軟骨細(xì)胞能產(chǎn)生大量 NO、PGE2［7］。 目前認(rèn)為，抑制 NO、PGE2途徑是OA治療的一種潛在的、重要的途徑。

姜黃素（二阿魏?；淄椋琧urcumin）是從姜黃屬中藥姜黃、郁金、莪術(shù)、菖蒲等的根莖中提取的一種橙黃色酚性化合物，為姜黃屬植物主要活性成分之一，具有破血行氣、散風(fēng)活血、通經(jīng)止痛等多種功效。由于其毒性較低（小鼠灌胃的 LD50>2 g·kg-1）［8］，臨床廣泛應(yīng)用于慢性潰瘍和皰疹、前列腺肥大、高血脂等疾病的治療。近年研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素具有強(qiáng)大的抗炎、抗氧化作用，能夠抑制多種細(xì)胞分泌多種炎癥因子［9，10］。為了探討姜黃素在保護(hù)軟骨和治療骨關(guān)節(jié)炎的可能性，本實(shí)驗(yàn)觀察了姜黃素抑制IL-1β刺激兔軟骨細(xì)胞分泌促炎癥因子IL-8、sICAM-1和NO、PGE2的作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

IL-1β、鹽酸萘乙二胺、Ⅱ型膠原酶、胰蛋白酶、透明質(zhì)酸酶為Sigma公司產(chǎn)品。DMEM培養(yǎng)液、Ham F-12培養(yǎng)液為Gibco公司產(chǎn)品。磺胺購(gòu)于上?；瘜W(xué)試劑站。新生小牛血清（FBS）系杭州四季青生物工程材料研究所生產(chǎn)。人IL-8、sICAM-1 ELISA試劑盒（R&D Systems，晶美公司分裝），BSA（華美生物工程公司），PGE2ELISA單克隆試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D Systems化學(xué)公司；NO試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所第一分所；考馬斯亮藍(lán)G-250（Fluka）、全自動(dòng)酶標(biāo)儀（Bio-Rad model 1450，USA）微量高速制冷離心機(jī)（Beckman，USA）、紫外分光光度計(jì)（Beckman，USA）。

常用藥物的配制、貯存及使用方法：rhIL-1β制成200 μg/L濃度溶液，分裝后-20℃保存，用前稀釋?zhuān)褂脻舛葹?10 μg/L。 姜黃素（Alexis Biochemicals，Switzerland）， 純度>99%。 2 mg 溶于 100 μl DMSO中后用無(wú)菌DMEM/F12培養(yǎng)液稀釋成200 mg/L，避光4℃保存。

1.2 方法

1.2.1 軟骨細(xì)胞分離培養(yǎng)

本實(shí)驗(yàn)在南通市人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室完成。取6～8周的新西蘭兔，敲頭處死，截取肩、肘和髖關(guān)節(jié)，用15號(hào)解剖刀削下脛骨近端、股骨遠(yuǎn)端及近端、肱骨近端關(guān)節(jié)表面軟骨，用0.05%透明質(zhì)酸酶常溫消化3 min。將軟骨切成約1 mm×1 mm×1 mm小塊，移入酶消化瓶?jī)?nèi)室，37℃、100 r/min磁力攪拌下，依次用 0.2%胰酶30 min，0.15%膠原酶 60 min兩次消化，1500 r/min離心5 min，收集細(xì)胞，放入含10%小牛血清的Ham F-12培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)，3 d后換液，以后隔日換液。待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，加0.15%胰蛋白酶消化5～10 min，待細(xì)胞間隙變大，加DMEM培養(yǎng)液和PBS吹打，使細(xì)胞分散均勻，每1瓶再分配到3瓶中，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，每3 d換液1次。

1.2.2 試驗(yàn)分組

①I(mǎi)L-1β 誘導(dǎo)組：只加入 rhIL-1β（10 μg/L）；②低劑量姜黃素組：加入 rhIL-1β（10 μg/L）和姜黃素（5 mg/L）；③中劑量姜黃素組：加入 rhIL-1β（10 μg/L）和姜黃素（10 mg/L）；④高劑量姜黃素組：加入rhIL-1β（10 μg/L）和姜黃素（20 mg/L）；⑤空白對(duì)照組：4 ml/L FBS，DMEM/F-12；⑥姜黃素對(duì)照組：只加入10 mg/L姜黃素。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每組均重復(fù)3次。作用時(shí)間為24 h。

1.2.3 IL-8和sICAM-1產(chǎn)生和測(cè)定

干預(yù)結(jié)束時(shí)收集培養(yǎng)上清，測(cè)定IL-8和sICAM-1含量。將24孔板內(nèi)細(xì)胞裂解后收集測(cè)定蛋白含量，按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定IL-8和sICAM-1含量。采用Bradford法測(cè)定細(xì)胞裂解液蛋白含量。IL-8和sICAM-1含量用每孔上清中的蛋白含量與相應(yīng)細(xì)胞蛋白含量之比（ng/g）表示。

1.2.4 NO、PGE2產(chǎn)生和測(cè)定

干預(yù)結(jié)束時(shí)收集培養(yǎng)上清，測(cè)定NO、PGE2含量。

采用硝酸還原酶法測(cè)定NO吸光度值，在550 nm和0.5 cm光徑下，紫外線分光光度計(jì)上測(cè)各管吸光度值。計(jì)算公式為NO（μmol/L）=（測(cè)定管吸光度值-空白管吸光度值）/（標(biāo)準(zhǔn)管吸光度值 -空白管吸光度值）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×樣品測(cè)試前稀釋倍數(shù)。

按照美國(guó)R&D Systems化學(xué)公司提供的PGE2ELISA單克隆試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作步驟測(cè)定PGE2吸光度值。在全自動(dòng)定量繪圖酶標(biāo)儀450 nm處30 min內(nèi)讀取OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品求出標(biāo)準(zhǔn)方程，然后計(jì)算各組PGE2含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)和方差分析（LSD法），顯著性檢驗(yàn)水平為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 軟骨細(xì)胞上清液IL-8、sICAM-1含量

IL-1β誘導(dǎo)組上清液IL-8含量是空白對(duì)照組的20倍（P<0.01）。與IL-1β誘導(dǎo)組比較，低劑量姜黃素組IL-8含量降低了32.09%（P<0.01），中劑量姜黃素組降低了40.01%（P<0.01），高劑量姜黃素組降低了47.92%（P<0.01）。姜黃素對(duì)照組與空白對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異（P>0.05）。

IL-1β誘導(dǎo)組上清液sICAM-1含量是空白對(duì)照組的11倍（P<0.01）。與IL-1β誘導(dǎo)組比較，低劑量姜黃素組sICAM-1含量降低了13.99%（P<0.01），中劑量姜黃素組降低了25.06%（P<0.01），高劑量姜黃素組降低了32.90%（P<0.01）。姜黃素對(duì)照組與空白對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異（P>0.05）。

表1 各組兔軟骨細(xì)胞上清液IL-8、sICAM-1含量比較

2.2 軟骨細(xì)胞上清液NO及PGE2含量

IL-1β誘導(dǎo)組上清液NO含量是空白對(duì)照組的6倍（P<0.01）。與IL-1β誘導(dǎo)組比較，低劑量姜黃素組NO含量降低了20.59%（P<0.01），中劑量姜黃素組降低了35.84%（P<0.01），高劑量姜黃素組降低了52.90%（P<0.01）。姜黃素對(duì)照組與空白對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異（P>0.05）。

IL-1β誘導(dǎo)組上清中PGE2含量是空白對(duì)照組的13倍（P<0.01）。與IL-1β誘導(dǎo)組比較，低劑量姜黃素組PGE2含量降低了27.20%（P<0.01），中劑量姜黃素組降低了53.31%（P<0.01），高劑量姜黃素組降低了72.95%（P<0.01）。姜黃素對(duì)照組與空白對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異（P>0.05）。

表2 各組兔軟骨細(xì)胞上清NO及PGE2含量比較

3 討論

細(xì)胞因子學(xué)說(shuō)已經(jīng)證實(shí)［3］，IL-1β 在 OA 關(guān)節(jié)病變中是發(fā)揮主要作用的細(xì)胞因子，在成年健康人關(guān)節(jié)軟骨中很少出現(xiàn)IL-1β，發(fā)生OA時(shí)，滑膜單個(gè)核細(xì)胞、軟骨細(xì)胞受到一定刺激而產(chǎn)生IL-1β，激活并釋放軟骨中的IL-8、ICAM-1、前纖維蛋白溶酶。有研究表明IL-8和ICAM-1是OA炎癥期的重要細(xì)胞因子［3，4，11］。本實(shí)驗(yàn)中，未受 IL-1β 刺激的兔軟骨細(xì)胞分泌 IL-8和 sICAM-1的量極低，10 μg/L濃度的IL-1β使兔軟骨細(xì)胞分泌的IL-8和sICAM-1分別比未受刺激兔軟骨細(xì)胞增加了20倍和11倍。

姜黃素是傳統(tǒng)的抗炎藥物姜黃的主要藥效成分，因?yàn)槠浯_切的抗腫瘤和抗炎效果，近幾十年得到廣泛關(guān)注和研究。研究表明［12］，姜黃素對(duì)OA軟骨細(xì)胞有一定的保護(hù)功能，可以抑制由軟骨細(xì)胞產(chǎn)生的多種促炎癥因子和分解代謝相關(guān)的因子，如Cox-2、TNF-a、MMP-13 等。 Shakibaei等［13］報(bào)道，姜黃素能抑制由IL-1誘導(dǎo)的整合素的顯著表達(dá)，還可抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡，其機(jī)制均與姜黃素能有效地抑制MAPK信號(hào)途徑和NF-κB的活化有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，姜黃素有效抑制了IL-1β誘導(dǎo)兔軟骨細(xì)胞產(chǎn)生IL-8和sICAM-1。5 mg/L濃度的姜黃素使IL-8含量降低了32.09%，10 mg/L濃度達(dá)到40.01%，20 mg/L濃度則達(dá)到47.92%。5 mg/L濃度的姜黃素使sICAM-1含量降低了13.99%，10 mg/L濃度達(dá)到25.06%，20 mg/L濃度則達(dá)到32.90%，姜黃素對(duì)sICAM-1的抑制似乎弱于IL-8，可能與其本身分泌量小差異不顯著有關(guān)。實(shí)驗(yàn)中對(duì)每孔細(xì)胞都進(jìn)行了蛋白定量，對(duì)培養(yǎng)上清的IL-8和sICAM-1含量進(jìn)行了標(biāo)化，排除了因細(xì)胞量不同造成的差異。

炎癥部位誘導(dǎo)的IL-8和sICAM-1表達(dá)是調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附和炎癥反應(yīng)的重要途徑，如果下調(diào)兩者的表達(dá)或抑制細(xì)胞因子誘導(dǎo)二者表達(dá)，那么炎癥反應(yīng)也將減弱。由于IL-8和sICAM-1在兔軟骨細(xì)胞的構(gòu)成性表達(dá)濃度較低，只有炎性細(xì)胞因子如IL-1β等能誘導(dǎo)它們大量產(chǎn)生［3、4］，那么抑制這個(gè)途徑就可能抑制持續(xù)存在的炎癥反應(yīng)。

IL-1β同時(shí)誘導(dǎo)體外培養(yǎng)兔軟骨細(xì)胞產(chǎn)生大量NO和PGE2，其在較低濃度級(jí)就能誘導(dǎo)NO和PGE2產(chǎn)生。由于關(guān)節(jié)炎癥性疾病以軟骨破壞為主要特征，而軟骨破壞與細(xì)胞因子（主要是IL-1β）密切相關(guān)。因此，尋找有效抑制IL-1β誘導(dǎo)NO和PGE2產(chǎn)生的藥物具有十分重要的意義。關(guān)于姜黃素在軟骨細(xì)胞修復(fù)過(guò)程中以及在對(duì)抗IL-1β的損害過(guò)程中對(duì)NO和PGE2影響的文獻(xiàn)報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，IL-1β可明顯增加軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液NO和PGE2的含量，分別增加了6倍和13倍；姜黃素能降低IL-1β引起的軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液NO和PGE2的升高；5 mg/L濃度的姜黃素使NO含量降低了20.59%，10 mg/L濃度達(dá)到 35.84%，20 mg/L濃度則達(dá)到 52.90%；5 mg/L濃度的姜黃素使PGE2含量降低了27.20%，10 mg/L濃度達(dá)到53.31%，20 mg/L濃度則達(dá)到72.95%。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，姜黃素能夠劑量依賴(lài)性地抑制IL-1β誘導(dǎo)兔軟骨細(xì)胞產(chǎn)生 IL-8、sICAM-1和NO、PGE2，姜黃素對(duì)軟骨細(xì)胞具有一定的保護(hù)功能，這種抑制作用的機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。

［l］Oliviero F，Sfriso P，Baldo G，et al.Apolipoprotein A-I and cholesterol in synovial fluid of patients with rheumatoid arthritis，psoriatic arthritisand osteoarthritis.Clin Exp Rheumatol，2009，27（1）：79-83.

［2］Goldring MB，Goldring SR.Osteoarthritis.J Cell Physiol，2007，213（3）：626-634.

［3］Lawrence RC，Helmick CG，Arnett FC，et al.Estimates of the prevalence of arthritis and selected musculoskeletal disorders in the United States.Arthritis Rheum，1998，41（5）：778-799.

［4］Feydy A，Pluot E，Guerini H，et al.Osteoarthlitis of the wrist and hand，and spine.Radiol Clin North Am，2009，47（4）：723-759.

［5］Farrell AJ，Blake DR，Palmer RM，et al.Increased concentrations of nitrite in synovial fluid and serum samples suggest increased nitric oxide synthesis in rheumatic diseases.Ann Rheum Dis，1992 ，51（11）：1219-1222.

［6］McCartney-Francis N，Allen JB，Mizel DE，et al.Suppression of arthritis by an inhibitor of nitric oxide synthase.J Exp Med，1993，178（2）：749-754.

［7］Grabowski PS ，Macpherson H，Ralston SH.Nitric oxide production in cells derived from the human joint.Br J Rheumatol，1996，35（3）：207-212.

［8］Brouet I，Ohshima H.Curcumin an anti-tumor promoter and anti-inflammatory agent，inhibits induction of nitric oxide synthase in activated macrophages.Biochem Biophys Res Commun，1995，206（2）：533-540.

［9］Huang CD，Tliba O，Panettieri RA，et al.Bradykinin induces interleukin-6 production in human airway smooth muscle cells：modulation by Th2 cytokines and dexamethasone.Am J Respir Cell Mol Biol，2003，28（3）：330-338.

［10］Literat A，Su F，Norwicki M，et al.Regulation of proinflammatory cytokine expression by curcumin in hyaline membrane disease （HMD）.Life Sci，2001，70 （3）：253-267.

［11］Ghasemi H，Ghazanfari T，Yaraee R，et al.Roles of IL-8 in ocular inflammations：a review.Ocul Immunol Inflamm，2011，19（6）：401-412.

［12］Liaeini A，Sylvester J，Li WQ，et al.Inhibition of interleukin-1-stimulated MAP kinases，activating protein-1 （AP-l） and nuelear factor kappa B （NF-kappa B） transcription factors down-reguplates matrix metalloproteinase gene expression in artieular chondroeytes.Matrix Biol，2002，21 （3）：251-362.

［13］Shakibaei M，Mobasheri A，Buhrmann C.Curcumin syner-gizes with resveratrol to stimulate the MAPK signaling pathway in human articular chondrocytes in vitro.Genes Nutr，2011，6（2）：171-179.