陳福華 隆雪明 易建希 譚美英 周玉潔 （農(nóng)業(yè)部畜禽產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心 湖南 長沙 410006）

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牛奶中三聚氰酸殘留檢測方法的研究

陳福華 隆雪明 易建希 譚美英 周玉潔 （農(nóng)業(yè)部畜禽產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心 湖南 長沙 410006）

用高效液相色譜法，226nm為檢測波長，乙腈作提取液，5mmol/L四丁基溴化銨和5mmol/L磷酸氫二鈉溶液(1:1)作水相(pH為7.0)，乙腈作有機(jī)相，水相:有機(jī)相=91:1，測定進(jìn)行牛奶中三聚氰酸殘留量。結(jié)果表明，其檢出線為0.5mg/kg；在0.5~50mg/kg范圍內(nèi)，呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r為0.9998；添加濃度為2.0mg/kg、4.0mg/kg、8.0mg/kg的條件下，三聚氰酸的殘留回收率在73.5%~99.6%之間，組內(nèi)、組間變異系數(shù)小于10%，均達(dá)到了歐盟和我國殘留檢測的相關(guān)規(guī)定。

牛奶 三聚氰酸 液相色譜法 檢測

三聚氰酸(Cyanuric acid，CYA)，又名氰尿酸，異氰脲酸，是略有苦味的無色無臭晶體，分子式：C3H3N3O3，分子量：129.07，分子結(jié)構(gòu)如下：

該物質(zhì)溶于熱水、熱醇、吡啶、濃鹽酸及硫酸而不分解，溶于氫氧化鈉和氫氧化鉀水溶液，不溶于冷醇、醚、丙酮、苯和氯仿。三聚氰酸作為重要的化工原料，常用作高分子材料合成前體、材料粘合劑以及殺菌消毒劑。2007年3月，美國的貓、狗中毒事件[1]，2008年9月國內(nèi)的“毒奶”事件，都與三聚氰酸有莫大的關(guān)系。通過對毒寵物飼料分析發(fā)現(xiàn)，其含有5.3%三聚氰酸[2]。經(jīng)亞慢性口毒性研究顯示，三聚氰酸造成腎組織損傷，包括腎小管擴(kuò)張、腎小管上皮壞死或增生、嗜堿性腎小管增加、中性粒細(xì)胞浸潤、礦化和纖維化。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，三聚氰酸易致泌尿系結(jié)石，最終引起腎功能損害。

調(diào)查發(fā)現(xiàn)，三聚氰酸進(jìn)入牛奶大致有四個途徑：其一，人為添加；其二，飼料中的三聚氰酸；其三，包裝材料中的三聚氰酸；其四，生產(chǎn)設(shè)備中的三聚氰酸。前兩個途徑往往會使三聚氰酸在牛奶中大量殘留，而后兩種途徑的殘留量是極低的。

1 材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀：配有紫外檢測器或二極管陣列檢測器；分析天平：感量0.00001g和0.001g；固相萃取裝置；旋渦混勻器；離心機(jī)；超聲波清洗機(jī)；氮吹儀；pH計：精度為0.02；微孔濾膜：0.22μm，有機(jī)膜；SPE柱：陰離子固相萃取柱，60mg/3 ml。

1.2 試劑和試液 乙腈、甲醇、甲酸，色譜純；正己烷、四丁基溴化銨、十二水磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氨水為分析純；5%氨水水溶液：將5ml氨水與95ml水混合均勻，得到5%氨水水溶液，使用前配制；緩沖溶液：分別稱取四丁基溴化銨、十二水磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉0.537g、0.596g、0.260g，加水溶解后定容到1L，用1mol/L的氫氧化鈉調(diào)pH至7.0；4%甲酸甲醇溶液：將4ml甲酸與96ml甲醇混合均勻；乙腈水溶液：將80ml乙腈與20ml水混合均勻即得。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 三聚氰酸，純度大于98.0%；標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制：稱取三聚氰酸標(biāo)準(zhǔn)品0.01g(精確到0.00001g)置于10ml容量瓶中，加乙腈水溶液超聲溶解并定容，配制成濃度為1.0mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。4℃下避光保存；標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制：準(zhǔn)確移取適量三聚氰酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用流動相配成0.50、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2 試驗方法

2.1 試驗方法 稱取試樣2g(精確到0.001g)，置于50ml離心管中，加入8ml乙腈，渦旋混合，超聲提取10min，靜置，離心5min(5000r/min)。取全部上清液置另一離心管，加入5ml正己烷，渦旋混勻2min，離心5min(5000r/min)，去上層液，氮氣吹至近干，用5ml 5%氨水水溶液溶解。將SPE柱依次用甲醇5ml、5%氨水水溶液5ml活化，將提取液過柱，依次用5%氨水水溶液3ml、甲醇3ml淋洗，抽干，用4%甲酸甲醇溶液5ml洗脫，收集洗脫液，50℃水浴，氮氣吹干。用流動相1.0ml溶解殘留物，過0.22mm微孔濾膜，供高效液相色譜分析。

2.2 色譜條件 色譜柱：C18柱(250×4.6mm，5μm)；流動相：緩沖溶液:乙腈=91:9；流速：1.0ml/min。進(jìn)樣量：20.0ml；檢測波長：226nm。

3 結(jié)果

試驗結(jié)果表明，該方法操作簡單，按信噪比大于3計算，求得該方法三聚氰酸的檢測限為0.5mg/kg，達(dá)到了殘留檢測的相關(guān)規(guī)定。為驗證此方法的準(zhǔn)確性、精密度和重現(xiàn)性，在空白牛奶中分別添加2.0mg/kg、4.0mg/kg、8.0mg/kg三聚氰酸三個濃度水平，每個水平設(shè)五個平行，并設(shè)空白對照。按樣品前處理方法處理后進(jìn)行HPLC分析，根據(jù)各組的峰面積計算其濃度和回收率。

試驗結(jié)果表明：在空白牛奶中添加2.0mg/kg、4.0mg/ kg、8.0mg/kg三聚氰酸三個濃度水平，測得的回收率分別在：73.5%~97.9%(81.3±3.5)，77.8%~97.5%(83.8±1.8)，77.2%~99.6%(90.1±5.5)，批內(nèi)變異系數(shù)分別為：3.6%~ 8.8%、3.6%~8.9%、4.4%~7.2%；批間變異系數(shù)分別為：4.3%、2.2%、6.1%，均小于10%，均達(dá)到了歐盟和我國殘留檢測方法的相關(guān)要求，表明該方法穩(wěn)定性、精密度、重現(xiàn)性好，能滿足牛奶中三聚氰酸分析的要求。

4 討論

4.1 提取溶劑的選擇 三聚氰酸溶于熱水、熱乙醇、吡啶、濃鹽酸及硫酸，也溶于氫氧化鈉和氫氧化鉀水溶液，不溶于冷乙醇、醚、丙酮、苯和氯仿。1g能溶于約200ml水中。用乙腈水(1:1)、乙腈水(4:1)、甲醇、甲醇水、酸化甲醇、二乙胺：水：乙腈(1:4:5)、二乙胺：水：乙腈(1:2:7)等提取，通過試驗比較各種溶劑的回收率。發(fā)現(xiàn)，乙腈水(4:1)與二乙胺:水:乙腈(1:2:7)均能較好的提取牛奶中的三聚氰酸，但二乙胺刺激性大，危害高，且一般實驗室沒有此條件；故用乙腈直接提取，除雜效果好、操作方便、快捷。

4.2 去脂肪 牛奶中含有大量蛋白和脂肪，用乙腈可以去除部分的蛋白與脂肪。試驗中發(fā)現(xiàn)，用乙腈直接提取過陰離子SPE柱，會嚴(yán)重的影響柱保留。為進(jìn)一步去除雜質(zhì)，把提取液用氮氣吹至近干，用氨水水溶液溶解，乙腈飽和正己烷去脂去雜，再過SPE小柱，可提高回收率。

4.3 固相萃取柱的選擇 用乙腈提取目標(biāo)化合物時，提取液中還含有一定量脂肪和蛋白質(zhì)。采用常規(guī)方法，即正己烷除脂肪，有一定的效果，但依然有許多雜質(zhì)存在，故應(yīng)選擇合適的固相萃取小柱除去脂肪和水溶性雜質(zhì)。

根據(jù)文獻(xiàn)報道與SPE小柱特性，分別采用普通C18柱、Florisil、堿性氧化鋁柱、Strata-X-C柱、MCX、MAX對標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白樣品進(jìn)行凈化效果和回收率考察(以峰面積表示)；發(fā)現(xiàn)MAX能較好的保留三聚氰酸，其回收率達(dá)到92%左右，且能較好的去除空白樣品中的雜質(zhì)。

4.4 流動相的選擇 三聚氰酸呈弱酸性，有較強(qiáng)的極性，在反相色譜柱上的保留時間極短，故在流動相中加入離子對試劑[2]，以延遲三聚氰酸出峰時間，實現(xiàn)更好的分離和較好的峰形。使用離子對試劑三乙胺、四丁基溴化銨對三聚氰酸標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行色譜分析，四丁基溴化銨的使用效果最佳。

緩沖液pH值、緩沖鹽濃度和有機(jī)相的濃度均影響三聚氰酸的保留時間。當(dāng)緩沖液pH值從4.0升至7.4時，三聚氰酸保留時間從12.327min提前至6.412min，而其響應(yīng)值逐步提高；綜合考慮色譜柱的耐受能力與檢測限的需要，故選擇pH7.0；流動相緩沖鹽濃度增大可使三聚氰酸保留時間縮短。采用5mmol/L四丁基溴化銨與5mmol/L磷酸氫二鈉溶液1:1(v:v)混勻，5mmol/L的磷酸二氫鈉調(diào)節(jié)pH值為7.0，可實現(xiàn)較好的分離。

三聚氰酸極性大，采用反相HPLC時，有機(jī)相的比例對三聚氰酸的峰保留影響相當(dāng)大；選擇一種合適的有機(jī)溶劑是必要的。甲醇在低波長有一定吸收，而乙腈在此波長下無吸收，故采用乙腈作為有機(jī)相，較好的保證目標(biāo)物的出峰時間，且基線較好。

隨著流動相中乙腈比例的加大，三聚氰酸的保留時間縮短。為避開雜質(zhì)的干擾，試驗比較了15%、12%、9%、8%、5%等五種乙腈濃度流動相的色譜圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用5%、8%乙腈濃度，目標(biāo)峰后面有一干擾峰，當(dāng)?shù)蜐舛鹊臅r候，干擾很明顯；而采用9%乙腈濃度可有效避免干擾峰；采用15%和12%乙腈濃度時保留時間太短，易受干擾峰影響。綜合考慮乙腈濃度選擇9%。

4.5 檢測波長的優(yōu)化 對三聚氰酸進(jìn)行190~400nm全波長掃描，光譜圖見圖1。

圖1 三聚氰酸光譜圖

三聚氰酸最佳吸收波長為214nm，在214nm波長下，其響應(yīng)值最高。但在三聚氰酸檢測中，214nm波長下，檢測基線不平，雜質(zhì)響應(yīng)高，干擾物質(zhì)影響大，試樣中三聚氰酸214nm波長條件下色譜圖見圖2。

而波長在226nm時，干擾小，基線平且能滿足試驗檢測限的需要，試樣中三聚氰酸在226nm波長條件下色譜圖見圖3。

圖2 在214nm波長下三聚氰酸的色譜圖

圖3 在226nm波長下三聚氰酸的色譜圖

綜合考慮各方面的因素，確定檢測最佳波長為226nm。

4.6 方法的檢測限 方法的檢測限是殘留檢測中重要的技術(shù)指標(biāo)之一。本方法采用在空白牛奶中添加三聚氰酸，經(jīng)提取、凈化、色譜柱分離和儀器測定，外標(biāo)法定量，評價整個方法的檢測限。按信噪比大于3計算，求得該方法三聚氰酸的檢測限為0.5mg/kg；按信噪比大于10計算，定量限為2mg/kg。三聚氰酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖、空白牛奶等色譜圖見圖4、圖5、圖6。

圖4 三聚氰酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

圖5 空白牛奶色譜圖

4.7 方法的線性響應(yīng) 在相同色譜條件下，將標(biāo)準(zhǔn)工作液依次從低濃度到高濃度進(jìn)樣，每一濃度進(jìn)樣三針，按其所得峰面積的平均值與對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度(mg/L)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程及相關(guān)系數(shù)。實驗測得三聚氰酸在濃度0.5~50mg/L范圍內(nèi)色譜峰面積與濃度呈線性相關(guān)，其回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表1、圖7。

圖6 空白牛奶添加2三聚氰酸的色譜圖

表1 三聚氰酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程和相關(guān)系數(shù)

圖7 HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線(峰面積—標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度)色譜圖

4.8 三聚氰胺的干擾研究 為探索三聚氰胺是否對本方法中三聚氰酸的檢測有干擾，我們分別做了三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品、三聚氰酸標(biāo)準(zhǔn)品、空白牛奶試樣、空白牛奶試樣中添加三聚氰酸和三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品(按本方法操作)、三聚氰胺和三聚氰酸混標(biāo)的液相色譜分析。結(jié)果表明，在226nm波長下，三聚氰胺和三聚氰酸都有吸收，但沒有干擾。三聚氰胺的出峰時間為3.3min左右，而三聚氰酸的出峰時間為6min左右，在不同基質(zhì)中，出峰保留時間穩(wěn)定，相互之間沒有干擾。同時，按本方法檢測，三聚氰胺在經(jīng)過SPE時，沒有保留。具體見圖8、圖9。

圖8 三聚氰胺與三聚氰酸混標(biāo)色譜圖

圖9 空白牛奶中添加三聚氰酸與三聚氰胺色譜圖

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（2012–05–19）

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1007-1733(2012)09-0004-04