蔣淑君 刁匯玲 馬中女 (濱州醫(yī)學院生理學教研室，山東 煙臺 264003)

局灶性腦缺血小鼠皮層HSP60、HSP70表達的時序性變化

蔣淑君 刁匯玲 馬中女 (濱州醫(yī)學院生理學教研室，山東 煙臺 264003)

目的 探討熱休克蛋白(HSP)60、HSP70在局灶性腦缺血小鼠腦缺血后不同時間點(1 h、2 h、3 h)皮層缺血核心區(qū)和半影區(qū)的蛋白表達變化。方法 健康雄性BALB/c小鼠，建立腦中動脈阻塞缺血模型(MCAO)，利用蛋白印跡技術分析HSP60、HSP70蛋白表達量在腦缺血1、2、3 h的時序性變化。結(jié)果 與假手術組比較，MCAO小鼠腦皮層HSP60、HSP70的蛋白表達量明顯升高(P＜0.05)，HSP60隨缺血時間延長呈持續(xù)升高趨勢，HSP70在缺血后1 h增加，2 h達高峰，3 h降低。結(jié)論 HSP60、HSP70是神經(jīng)細胞損傷和耐受的敏感標志，局灶性腦缺血能引起HSP60、HSP70表達的時序性變化，為認識局灶性腦缺血損傷提供理論依據(jù)。

局灶性腦缺血;大腦中動脈阻塞模型;熱休克蛋白60(HSP60);熱休克蛋白70(HSP70);時序性變化

腦缺血可導致嚴重的遲發(fā)性神經(jīng)元損傷，影響患者的愈后和功能的恢復。缺血缺氧后早期腦中蛋白質(zhì)合成普遍降低，在某些神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)多種基因的誘導表達。熱休克蛋白(HSP)是一類在生物進化過程中極為保守的蛋白質(zhì)，廣泛存在于原核、真核細胞中，當機體受到各種有害刺激(如缺血、高滲、腫瘤發(fā)生等)，胞內(nèi)HSP合成增多〔1〕。HSP在缺血缺氧性腦損傷過程中的特殊改變，使其成為該方面的研究熱點之一。其中HSP70、HSP60分布相當廣泛，應激后生成最為顯著，是主要的應激蛋白，本實驗利用大腦中動脈阻塞(MCAO)小鼠局部腦缺血模型，觀察局灶性腦缺血不同時間點HSP70、HSP60在小鼠皮層缺血核心區(qū)和半影區(qū)表達的時序性變化。

1 材料與方法

1.1 動物及MCAO模型的制備

健康BALB/c小鼠(雄性，18～22 g，8～10周齡，SPF級，濱州醫(yī)學院實驗動物中心)。首先隨機分為假手術組、MCAO缺血模型組，MCAO缺血模型組又分為缺血1 h組、缺血2 h組和缺血3 h組。根據(jù)文獻報道進行小鼠MCAO腦缺血模型制備〔2〕。腹腔注射戊巴比妥鈉(0.06 g/kg)麻醉小鼠，顯微鏡下游離左側(cè)頸總動脈、頸外動脈及頸內(nèi)動脈，結(jié)扎頸總動脈的近心端和頸外動脈的遠心端;將頭端直徑0.23 mm、主干直徑0.18 mm的栓塞線，由頸外動脈插入至大腦中動脈(深度約12.0 mm)，并固定線栓，造成局灶性腦缺血。假手術組只進行手術操作，不插入線栓。整個手術過程平均20 min完成，此間保持小鼠體溫。

1.2 Nissl染色

腦組織切片經(jīng)0.5%焦油紫工作液染色10～15 min，梯度酒精脫色，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察。

1.3 蛋白樣品的制備及Western印跡檢測

參照文獻〔3〕，抽提MCAO缺血模型組皮層缺血核心區(qū)(Ic)半影區(qū)(P)組織的胞溶(Cytosolic)、膜相關(Particulate)等蛋白組分。BCA法蛋白定量后，樣品在-20℃保存?zhèn)溆?。在進行Western印跡檢測時，每組分別取25 μg蛋白樣品進行蛋白電泳(10%SDS-PAGE，4℃、20～30 mA)和轉(zhuǎn)膜(NC 膜，400 mA、3 h)。用 HSP60(1∶1 000，兔 源 性，Cell Signalling Technology)，HSP70 抗 體(1∶1 000，鼠 源 性，Santa Cruz)的 一 抗 和 內(nèi) 參 照 β-actin(1∶1 000，鼠源性單克隆抗體，Sigma aldrich公司)辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗、山羊抗小鼠二抗(1∶1 000，Chemicon)和ECL反應底物(Chemicon公司)進行雜交。所得X線膠片結(jié)果用Gel Doc凝膠成像系統(tǒng)掃描分析。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 HPC對小鼠皮層神經(jīng)元形態(tài)的影響

Nissl染色結(jié)果顯示，缺血區(qū)對側(cè)皮層神經(jīng)細胞尼氏染色清晰均勻，胞體輪廓及尼氏體清晰可見，細胞形態(tài)完整。缺血核心區(qū)細胞層次紊亂，排列不規(guī)則，結(jié)構(gòu)模糊，神經(jīng)元腫脹，胞質(zhì)淡染，體積增大，部分神經(jīng)元胞體開始縮小，呈三角形，可見核固縮、核溶解，尼氏小體溶解、消失。半影區(qū)細胞胞體輪廓及尼氏體較清晰，細胞形態(tài)基本完整，有少量細胞腫脹及核固縮。見圖1。

圖1 Nissl染色示MCAO小鼠神經(jīng)元形態(tài)(×200)

2.2 小鼠皮層膜相關成分中HSP60的表達

MCAO手術后隨缺血時間延長小鼠皮層缺血核心區(qū)及半影區(qū)HSP60的蛋白表達明顯增加，尤其半影區(qū)HSP60表達呈明顯增加，缺血3 h半影區(qū)與假手術組比較表達量增加(6.5±0.29)倍。見圖2。

2.3 小鼠皮層胞質(zhì)成分中HSP70的表達

假手術組皮層組織HSP70的表達量很少，MCAO手術后小鼠皮層缺血核心區(qū)及半影區(qū)HSP70的蛋白表達在1 h即開始升高，2 h達高峰，3 h降低，但仍高于假手術組。見圖3。

圖2 腦缺血1、2、3 h小鼠皮層組織HSP60的蛋白表達

圖3 腦缺血1、2、3 h小鼠皮層組織HSP70的蛋白表達

3 討論

在局灶性腦缺血模型中，根據(jù)血供減少的程度可分為缺血核心區(qū)和半影區(qū)，輕中度缺血的半影區(qū)是腦保護的關鍵。近年大量研究表明，缺血性腦損傷引起的細胞死亡可能通過凋亡和壞死兩條途徑〔4〕。神經(jīng)元的死亡在缺血灶中心區(qū)域以壞死為主，而在缺血半暗帶以凋亡為主，缺血半暗帶的保護是治療腦缺血損傷的重點。HSP是一類在生物進化過程中極為保守的蛋白質(zhì)，廣泛存在于原核、真核細胞中，當機體受到各種有害刺激(如缺血、高滲、腫瘤發(fā)生等)，胞內(nèi)HSP合成增多〔1〕。許多應激原均可引起HSP的生成增加，誘生的HSP主要與應激時受損蛋白質(zhì)的修復和移除有關，從而在蛋白質(zhì)代謝水平對機體起保護、防御作用，增強機體對多種應激原的耐受能力。HSP70、HSP60分布相當廣泛，是主要的應激蛋白，HSP60是反映線粒體應激和損傷程度的敏感指標，HSP70被視為細胞受到缺血損傷的敏感指標，又與缺血耐受有關。因而我們選擇了HSP70、HSP60作為局灶性腦缺血損傷及耐受的觀測指標。

HSP60主要存在于真核細胞的線粒體內(nèi)，胞質(zhì)內(nèi)含量較少。正常狀態(tài)下HSP60主要以穩(wěn)定狀態(tài)存在于線粒體基質(zhì)中，在機體處于應激狀態(tài)時可過表達或異位表達，因此，HSP60被認為是反映線粒體應激和損傷程度的指標〔5〕。本研究結(jié)果顯示，在MCAO誘導的缺血模型中，缺血1 h小鼠皮層缺血核心區(qū)及半影區(qū)HSP60表達就開始增高，隨著缺血時間延長，HSP60表達持續(xù)增加，尤其在缺血半影區(qū)HSP60表達水平明顯升高，提示神經(jīng)細胞在缺血/低氧狀態(tài)下未折疊蛋白毒性堆積及線粒體應激導致神經(jīng)損傷加重。

HSP70作為一種非特異性細胞內(nèi)源性保護蛋白，可以防止應激引起的細胞損害并使受損細胞恢復，主要功能是發(fā)揮分子伴侶作用與新生、未折疊、錯折疊或聚集的蛋白質(zhì)相結(jié)合，使某些蛋白質(zhì)聚集物解離，加速正確的肽鏈折疊和重折疊，維持某些肽鏈的伸展狀態(tài)以利其跨膜轉(zhuǎn)位，在線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等不同的區(qū)域內(nèi)發(fā)揮作用，同時還促進某些變性蛋白的降解和清除，重新激活某些酶的作用，以維護細胞的功能和生存〔6〕。近年研究表明，正常生理情況下，HSP70蛋白在腦內(nèi)無表達或呈非常弱的表達。應激情況下，HSP70表達增加，顯示具有保護腦細胞，增加腦對缺氧的耐受性，抵抗進一步致死損傷的作用〔7〕。我們的實驗結(jié)果觀察到各缺血組HSP70表達率總的趨勢為1 h出現(xiàn)增高，2 h達高峰，至3 h呈逐漸下降趨勢，顯示缺血低氧刺激使受損細胞產(chǎn)生變性蛋白誘導HSP70的合成，同時也獲得暫時的對隨后致死性缺血性損傷的耐受，缺血2 h內(nèi)受損腦組織的應激和抗損傷能力較強，但隨著腦組織缺血低氧時間的延長，腦細胞受損的加重，能夠產(chǎn)生HSP70的能力也大大下降。該作用可能與HSP70保護細胞線粒體免遭活性氧化產(chǎn)物的攻擊、抑制促炎癥因子如TNF-α、IL-1等誘導的呼吸爆發(fā)有關〔8〕。

綜上所述，HSP60、HSP70在缺血低氧刺激時的皮層組織中呈高表達，并隨缺血時間延長呈現(xiàn)不同的表達趨勢。本研究觀察了局灶性腦缺血時HSP60、HSP70的表達規(guī)律，對探討局灶性腦缺血的分子機制有重要意義，而HSP60、HSP70表達能否作為腦缺血診斷治療的靶標及在腦缺血/低氧損傷中如何發(fā)揮作用等有待更深入的研究。

1 Welch WJ.Mammalian stress response：cell physiology，structure/function of stress proteins，and implication for medicine and disease〔J〕.Immunogenetics，1994;39(1)：93-100.

2 蔣淑君，張 楠，卜祥寧，等.P38MAPK磷酸化增高參與HPC降低MCAO所致小鼠缺血性腦損傷〔J〕.基礎醫(yī)學與臨床，2009;29(7)：691-6.

3 Wexler EJ，Peters EE，Gonzales A，et al.An objective procedure for ischemic area evaluation of the stroke intraluminal thread model in the mouse and ra〔tJ〕.J Neurosci Methods，2002;113(1)：51-8.

4 Giffard RG，Xu L，Zhao H，et al.Chaperones，protein aggregation，and brain protection from hypoxic/ischemic injury〔J〕.J Exp Biol，2007;207(18)：3213-20.

5 Yin W，Signore AP，Iwai M，et al.Rapidly increased neuronal mitochondrial biogenesis after hypoxic-ischemic brain injury〔J〕.Stroke，2008;39(11)：3057-63.

6 Bao XQ，Liu GT.Bicyclol a novel antihepatitis drug with hepatic heat shock protein 27/70 inducing activity and cytoprotective effects in mice〔J〕.Cell Stress Chaperones，2008;13(3)：348.

7 Weinstein PR，Hong S，Sharp FR.Molecular identification of the ischemic penumbra〔J〕.Stroke，2004;35(11)：2666-70.

8 Sun XC，Xian XH，Li WB，et al.Activation of p38 MAPK participates in brain ischemic tolerance induced by limb ischemic preconditioning by upregulating HSP 70〔J〕.Exp Neurol，2010;224(2)：347-55.

Sequential changes of HSP60 and HSP70 expressions in mice with focal cerebral ischemia

JIANG Shu-Jun，DIAO Hui-Ling，MA Zhong-Nü.
Department of Physiology，Binzhou Medical University，Yantai 264003，Shandong，China

Objective To investigate sequential changes of HSP60 and HSP70 expression at 1，2，3 h in the ischemic core and the penumbra of cortex in the mice with focal cerebral ischemia.Methods Focal cerebral ischemia was induced by middle cerebral artery occlusion in mice，healthy male BALB/c mice weighted 18～20 g were randomly divided into 4 groups：sham，ischemia 1 h，ischemia 2 h，ischemia 3 h groups.Western blot combined with Gel Doc imagine systems were applied to examine the changes in HSP60 and HSP70 protein expression levels in the cerebral of mice.Results Protein expression levels of HSP60 and HSP70 in the ischemic core and penumbra were increased significantly in response to the repetitive of ischemia time when compared with sham group(P＜0.05，n=6 for each group).Protein expression level of HSP60 showed a continous increasing trend with the ischemia time，while that of HSP70 was increased at 1 hour point，reached climax at 2 hour point，but decreased at 3 hour point.Conclusions HSP60 and HSP70 are the sensitive markers for nerve injury，and focal cerebral ischemia can result in the sequential changes of HSP60 and HSP70 expression，which provides evidence for the recognition and protection of focal cerebral ischemia.

Focal cerebral ischemia;Middle cerebral artery occlusion(MCAO);Heat shock protein 60(HSP60);Heat shock protein 70(HSP70);Sequential change

R373

A

1005-9202(2012)23-5189-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.23.040

山東省衛(wèi)生發(fā)展科技計劃項目(No.2009HW006)

蔣淑君(1971-)，女，在讀博士，副教授，主要從事神經(jīng)生理學研究。

〔2011-10-24收稿 2012-03-10修回〕

(編輯 曹夢園)