劉軼秋，丁家波，李蓓蓓，徐 磊，張瑞婷

(1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241)

《中國獸藥典》二〇一〇年版三部規(guī)定支原體培養(yǎng)基制成后需進行質(zhì)控檢驗，合格后方可用于生物制品的支原體檢驗[1]。用于質(zhì)控檢驗的質(zhì)控菌株分別為滑液支原體(CVCC2960)和豬鼻支原體(CVCC361)?；褐гw用于改良Frey氏液體培養(yǎng)基、改良Frey氏固體培養(yǎng)基的質(zhì)控檢驗;豬鼻支原體用于支原體液體培養(yǎng)基、支原體固體培養(yǎng)基、無血清支原體培養(yǎng)基的質(zhì)控檢驗。為了解兩種質(zhì)控菌株的生長繁殖特性，本試驗通過測定兩種菌株在不同培養(yǎng)時段的CCU(color change unit，CCU)，繪制生長曲線并確定世代時間，為支原體檢驗用培養(yǎng)基的質(zhì)控檢驗提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 滑液支原體(CVCC2960)、豬鼻支原體(CVCC361)，均由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

1.1.2.1 改良Frey氏液體培養(yǎng)基 配方為:氯化鈉(5.0 g/L)，氯化鉀(0.4 g/L)，硫酸鎂(含7個結(jié)晶水)(0.2 g/L)，磷酸氫二鈉(含12個結(jié)晶水)(1.6 g/L)，磷酸二氫鉀(0.2 g/L)，葡萄糖(10.0 g/L)，乳蛋白水解物(5.0 g/L)，酵母粉(5.0 g/L)，1%輔酶I溶液(10.0 mL/L)，1%L-半胱氨酸溶液(10.0 mL/L)，2%精氨酸溶液(20.0 mL/L)，馬血清(100.0 mL/L)，1%酚紅溶液(1.0 mL/L)，青霉素(800 IU/mL)，1%醋酸鉈溶液(10.0 mL/L)，用1 mol/L NaOH調(diào)pH值至7.6～7.8，濾過除菌，置4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2.2 支原體液體培養(yǎng)基 配方為:PPLO肉湯粉(21.0 g/L)，葡萄糖(5.0 g/L)，10%精氨酸溶液(10.0 mL/L)，10 倍 MEM 培養(yǎng)液(10.0 mL/L)，酵母粉(5.0 g/L)，青霉素(800 IU/mL)，1%醋酸鉈溶液(10.0 mL/L)，馬血清(100.0 mL/L)，1%酚紅溶液(1.0 mL/L)，用1 mol/L NaOH調(diào)pH值至7.6～7.8，濾過除菌，置4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 儀器 生物安全柜;37℃恒溫培養(yǎng)箱;電子天平;pH計;濾器;冰柜。

1.2 方法

1.2.1 菌液培養(yǎng)

1.2.1.1 滑液支原體 將-20℃凍存的滑液支原體菌株恢復(fù)原體積后，按5%比例接種到10 mL改良Frey氏液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取培養(yǎng)后的菌液，按照5%比例傳3代，取生長穩(wěn)定的菌液作為待測菌液，按5%比例接種培養(yǎng)基，置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，從0 h開始，每隔6 h進行一次活菌計數(shù)。

1.2.1.2 豬鼻支原體 將-20℃凍存的豬鼻支原體菌株恢復(fù)原體積后，按5%比例接種到10 mL支原體液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取培養(yǎng)后的菌液，按照3%比例傳3代，取生長穩(wěn)定的菌液作為待測菌液，按3%比例接種培養(yǎng)基，置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，從0 h開始，每隔6 h進行一次活菌計數(shù)。

1.2.2 生長曲線繪制 從0 h開始，每隔6 h從待測菌液中取樣，采用10倍系列稀釋計數(shù)法進行計數(shù)。具體方法是:將培養(yǎng)基分裝成每管1.8 mL，第1管加入待測菌液0.2 mL，混勻后，取0.2 mL加入第2管中，再混勻，取0.2 mL加入到第3管中，依此操作一直至第10管，將第10管中混勻后取0.2 mL棄去。每個時間點取樣3份，將試管置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，試驗設(shè)未接種菌液的培養(yǎng)基作為陰性對照。每天觀察試管培養(yǎng)基顏色變化，直至培養(yǎng)基顏色不再變化時，結(jié)束觀察。判定滴度:以培養(yǎng)基顏色變化的最高稀釋度作為待測菌液的生長滴度，即CCU表示[2]。用3份樣品的平均 CCU，n=3)表示該時間點支原體CCU。以取樣時間點為橫坐標，平均 CCU的對數(shù)為縱坐標，繪制生長曲線。

1.2.3 世代時間的計算 世代時間(generation time)[3]，即菌體每繁殖一代所需的時間，用 G表示。分別取滑液支原體、豬鼻支原體生長曲線對數(shù)生長期中的一段，按如下公式計算世代時間:

式中，G為世代時間，t為培養(yǎng)時間，Mo為開始時的活菌數(shù)，Mt為經(jīng)t時間培養(yǎng)后的活菌數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)控菌株在培養(yǎng)基中不同生長時段的CCU結(jié)果如表1、表2所示。從表1可以看出，滑液支原體在改良Frey氏液體培養(yǎng)基中最高可生長至7.0×108CCU/mL，54 h后活菌數(shù)開始下降，直至96 h滴度為0。從表2看出，豬鼻支原體在支原體液體培養(yǎng)基中最高可生長至1.0×109CCU/mL，且在126 h之后活菌數(shù)開始下降，直至216 h滴度為0。

表1 滑液支原體不同生長時段的CCU及對數(shù)值

表2 豬鼻支原體不同生長時段的CCU及對數(shù)值

續(xù)表

2.2 質(zhì)控菌株的生長曲線圖 從圖1可知，滑液支原體菌株在接種后6 h內(nèi)為遲緩期，6～36 h為對數(shù)期，36～54 h為穩(wěn)定期，54 h之后為衰老期。從圖2可知，豬鼻支原體菌株在接種后6 h內(nèi)是遲緩期，6～18 h為對數(shù)期，18～126 h為穩(wěn)定期，126 h之后為衰老期。

2.3 質(zhì)控菌株的世代時間 滑液支原體對數(shù)期在6～36 h，t1=12 h，t2=30 h，代入公式，滑液支原體世代時間G=231.8 min;豬鼻支原體對數(shù)期在6～18 h，t1=6 h，t2=18 h，代入公式，豬鼻支原體世代時間G=117.1 min。

3 討論

3.1 《中國獸藥典》[1]規(guī)定滑液支原體和豬鼻支原體作為支原體培養(yǎng)基檢驗用質(zhì)控菌株，傳代培養(yǎng)均不得超過5代。支原體質(zhì)控菌株開啟后，在適宜液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，為使支原體在培養(yǎng)基中生長穩(wěn)定，連續(xù)培養(yǎng)直至第3代，用第3代菌液培養(yǎng)物作為培養(yǎng)基質(zhì)控菌株的種子液，在用于質(zhì)控檢驗時，將種子液繼續(xù)傳代，用第4代或第5代菌液培養(yǎng)物作為質(zhì)控菌株對培養(yǎng)基進行檢驗。為了保證質(zhì)控菌株在培養(yǎng)過程中生長速度穩(wěn)定、均一，菌液繁殖到第5代終止，不再繼續(xù)傳代。

3.2 支原體是一類缺乏細胞壁的原核微生物，它在液體培養(yǎng)基的生長曲線與細菌相同，可分為遲緩期、對數(shù)生長期、穩(wěn)定期、衰老期[4]。為保證質(zhì)控菌株生長穩(wěn)定，菌株培養(yǎng)后每次傳代，均按照豬鼻支原體3%、滑液支原體5%的比例接種培養(yǎng)基，且每次傳代培養(yǎng)均在108CCU/mL數(shù)量級收獲菌液。從兩個質(zhì)控菌株生長曲線圖分析，滑液支原體菌株最佳收獲時間在培養(yǎng)后36～54 h，豬鼻支原體菌株最佳收獲時間在培養(yǎng)后18～126 h，在此時段內(nèi)收獲的菌液，其CCU均維持在108～109CCU/mL數(shù)量級。但在研究中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)時間相差6～12 h的支原體菌液顏色幾乎沒有差別，而CCU卻相差1～2個數(shù)量級，這就提示在培養(yǎng)菌液過程中，把握好收獲時間至關(guān)重要。如果質(zhì)控菌株不在穩(wěn)定期中收獲，可能導(dǎo)致菌液滴度不夠高，即使使用的是合格的培養(yǎng)基，滴度也達不到合格的標準。所以，本研究提示在穩(wěn)定期及時收獲菌液、及時保存，才能保證支原體檢驗培養(yǎng)基質(zhì)控菌株滴度的穩(wěn)定和均一，保證支原體培養(yǎng)基檢驗結(jié)果的準確。

3.3 培養(yǎng)基質(zhì)量直接影響生物制品檢驗結(jié)果的準確性，所以質(zhì)控菌株作為一個衡量培養(yǎng)基合格與否的標尺，更是起到了至關(guān)重要的作用。目前，現(xiàn)行《中國獸藥典》在質(zhì)控菌株標準化方面還沒有十分具體的規(guī)定。雖然試驗初次通過繪制生長曲線和確定世代時間來探索質(zhì)控菌株的生長規(guī)律，為培養(yǎng)基檢驗及質(zhì)控菌株的使用提供了一定的數(shù)據(jù)參考，但是質(zhì)控菌株的標準化工作還需大量試驗進行驗證，例如質(zhì)控菌株的傳代次數(shù)、菌液接種培養(yǎng)基的適宜比例、生長滴度變化等方面還需進一步確證并作詳細規(guī)定。另外，在質(zhì)控菌株培養(yǎng)方面，傳統(tǒng)上一直采用肉眼觀察的方式對培養(yǎng)液顏色進行判斷，試驗中發(fā)現(xiàn)此方法準確性不高，且不同試驗人員判斷亦存在差異，建議采用酸度計測定取代肉眼觀察方法，使試驗結(jié)果更可信。

[1]中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典二○一○年版三部[S].

[2]Loens K，Mackay W G，Scott C，et al.A multicenter pilot external quality assessment programme to assess the quality of molecular detection of Chlamydophila pneumoniae and Mycoplasma pneumoniae[J].J Microbiol Meth，2010，82(2):131-135.

[3]武漢大學(xué)，復(fù)旦大學(xué)生物系微生物學(xué)教研室.微生物學(xué)[M].3版.北京:高等教育出版社，1989.

[4]吳移謀，葉元康.支原體學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，2008:38.