任大勇，章檢明，曹 婧，劉宏鋒，焉慧潔，楊嫦娥，秦艷青，沈明浩

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，長(zhǎng)春 130118;2.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)春 130062)

胞外多糖(Exopolysaccharides，EPS)是由多數(shù)細(xì)菌與少數(shù)酵母菌及絲狀真菌在生長(zhǎng)代謝過程中分泌到細(xì)胞壁外的水溶性多糖，按其結(jié)構(gòu)可分為同多糖(由一種單糖構(gòu)成)和雜多糖(由兩種以上單糖構(gòu)成)[1]。EPS對(duì)微生物本身具有重要功能，如保護(hù)細(xì)胞免受脫水損傷以及噬菌體吞噬、為微生物提供營(yíng)養(yǎng)、穩(wěn)定細(xì)胞滲透壓、增加菌體對(duì)腸黏膜的黏附性、參與細(xì)胞信號(hào)傳遞等[2]。

乳酸菌(Lactic acid bacterium，LAB)是公認(rèn)的食品級(jí)微生物(GRAS)，具有多種生理功能，與其他細(xì)菌相比，乳酸菌分泌的EPS安全性更高，以腸膜明串珠菌(L．mesenteroides)開發(fā)的右旋糖酐已得到廣泛應(yīng)用[3]。近幾年，新的乳酸菌EPS的開發(fā)與研究成為熱點(diǎn)，產(chǎn)EPS的菌株主要有乳桿菌、乳球菌、鏈球菌、明串珠菌屬、雙歧桿菌等菌屬[4]。乳酸菌EPS是由有分支或無分支的重復(fù)單元組成，每個(gè)重復(fù)單位中含有3～8個(gè)單糖或單糖衍生物，通常是D-葡萄糖、D-半乳糖和L-鼠李糖，有時(shí)在重復(fù)單元中也會(huì)出現(xiàn)其他己糖和戊糖?，F(xiàn)有研究證明，EPS具有多種重要的生理功能，如抗腫瘤、降膽固醇、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等[5-6]。

雖然乳酸菌EPS應(yīng)用前景廣闊，但其產(chǎn)量較低，應(yīng)用受到了一定的限制。因此，提高EPS的產(chǎn)量成為目前研究的熱點(diǎn)。通過篩選優(yōu)良菌種，優(yōu)化發(fā)酵條件，或?qū)N進(jìn)行改良可以在一定程度上提高胞外多糖的產(chǎn)率。其中，優(yōu)化發(fā)酵條件(培養(yǎng)基成分和生長(zhǎng)條件)是提高EPS產(chǎn)量的重要途徑[7]。響應(yīng)面分析法(Response surface methodology，RSM)是通過對(duì)響應(yīng)面等值線的分析尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，采用多元二次回歸方程來擬合多種因素與響應(yīng)值之間函數(shù)關(guān)系的一種統(tǒng)計(jì)方法[8]。RSM廣泛應(yīng)用于優(yōu)化微生物培養(yǎng)基和提取工藝等方面。本研究以前期篩選的產(chǎn)EPS的鼠李糖乳桿菌為對(duì)象，以培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、pH、培養(yǎng)基組成(酵母粉、檸檬酸氫二銨、磷酸氫二鉀)和接種量為因素進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。通過Plackett-Burman法從眾多因素中篩選出影響EPS產(chǎn)量的三個(gè)重要因素，再用Box-Behnken法建立響應(yīng)面模型，以獲得最高的EPS產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 試劑與菌種 主要試劑:酵母粉、檸檬酸氫二銨、磷酸氫二鉀、三氯乙酸、無水乙醇、聚乙二醇(PEG 20000)、苯酚、葡萄糖、濃硫酸。菌種:鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)，由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院毒理學(xué)教研室保存。

1.2 培養(yǎng)基 MRS培養(yǎng)基:蛋白胨10.0 g/L、牛肉膏8.0 g/L、酵母粉4.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、磷酸氫二鉀2.0 g/L、檸檬酸氫二銨2.0 g/L、乙酸鈉5.0 g/L、硫酸鎂0.2 g/L、硫酸錳0.04 g/L、吐溫-80 1.0 mL。

1.3 材料與設(shè)備 超凈工作臺(tái)、高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、高速冷凍離心機(jī)、精密pH計(jì)、精密電子天平、透析袋、722型可見分光光度計(jì)。

1.4 EPS的提取工藝 取菌種5 mL接于100 mL MRS培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，將培養(yǎng)液在6000 r/min、10℃條件下離心15 min去除菌體。向收集的培養(yǎng)上清液中加入三氯乙酸至終濃度為8%，充分?jǐn)嚢韬笥?℃靜置過夜，離心(10000 r/min，4℃，20 min)去除蛋白質(zhì)，收集上清液。向上清液中加入3倍體積90%的乙醇，于4℃靜置過夜。小心吸出上清液，向其中加入無水乙醇進(jìn)行洗滌，直至溶液為無色為止。用蒸餾水溶解洗滌所得的沉淀，并移至透析袋中透析2 d，每天換水3次。用PEG 20000濃縮透析袋中的溶液至25 mL以下，用苯酚-硫酸法[9]測(cè)定多糖含量。

1.5 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì) 本研究選取培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、pH值、酵母粉、磷酸氫二鉀、檸檬酸氫二銨和接種量7個(gè)因素，應(yīng)用軟件Design-Expert 8.0進(jìn)行Plackett-Burman設(shè)計(jì)，從而篩選出影響EPS產(chǎn)量的3個(gè)主要因素。

1.6 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)Plackett-Burman法篩選出的顯著因子效應(yīng)大小設(shè)計(jì)它們的步長(zhǎng)，進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)，尋找最大產(chǎn)區(qū)。

1.7 Box-Behnken優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)用軟件Design-Expert 8.0對(duì)篩選的三個(gè)主要因素進(jìn)行Box-Behnken優(yōu)化設(shè)計(jì)，同時(shí)固定其他非關(guān)鍵因素。

2 結(jié)果

2.1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果 Plackett-Burman設(shè)計(jì)因子水平表及結(jié)果分別見表1和表2。采用Design-Expert軟件對(duì)表2中的EPS產(chǎn)量數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到各影響因子的偏回歸系數(shù)及其重要性(表3)。由表3可知，酵母粉對(duì)鼠李糖乳桿菌產(chǎn)EPS影響最大，重要性為6.73。其次為培養(yǎng)溫度，重要性為1.92。接種量、檸檬酸氫二銨、pH值、磷酸氫二鉀和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)EPS產(chǎn)量的影響依次降低，重要性分別為 1.18、1.08、0.79、0.72 和0.32。酵母粉、接種量、磷酸氫二鉀和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)EPS產(chǎn)量的影響為正相關(guān);培養(yǎng)溫度、檸檬酸氫二銨、pH對(duì)EPS產(chǎn)量的影響為負(fù)相關(guān)。故選取三個(gè)最重要的因素(酵母粉、培養(yǎng)溫度和接種量)做進(jìn)一步優(yōu)化試驗(yàn)。

表1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)因子水平

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

表3 偏回歸系數(shù)及影響因子的顯著性分析

2.2 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果 響應(yīng)面擬合方程只有在考察的臨近區(qū)域里才能充分近似真實(shí)情況，故應(yīng)先逼近最大產(chǎn)區(qū)后再建立有效的擬合方程。根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)篩選出的3個(gè)影響EPS產(chǎn)量的重要因素，運(yùn)用最陡爬坡試驗(yàn)找出EPS產(chǎn)量最大的區(qū)域。最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果見表4。由表4可知，當(dāng)培養(yǎng)溫度為30℃、酵母粉為30 g/L、接種量為6%時(shí)，EPS產(chǎn)量最大，當(dāng)條件處于其兩邊或更遠(yuǎn)時(shí)產(chǎn)量逐漸下降。由此可以確定EPS產(chǎn)量最大值的條件應(yīng)當(dāng)在培養(yǎng)溫度為30℃、酵母粉為30 g/L、接種量為6%附近區(qū)域。

2.3 Box-Behnken優(yōu)化設(shè)計(jì)結(jié)果 根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果，將培養(yǎng)溫度為30℃、酵母粉為30 g/L、接種量為6%作為中心條件采用Box-Behnken法進(jìn)一步優(yōu)化，各因素水平見表5，優(yōu)化設(shè)計(jì)結(jié)果見表6。采用Design-Expert軟件對(duì)表6中的EPS產(chǎn)量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到模擬曲線，對(duì)應(yīng)的模擬方程為:Y=354．05-4．65X1+9．27X5-4．53X6+18．88X1X5+13．87X1X6-9．49X5X6-22．80X21-47．00X25-28．66X26。此模擬方程的擬合度為93.43%，說明試驗(yàn)數(shù)據(jù)能較好的預(yù)測(cè)EPS的實(shí)際產(chǎn)量。對(duì)模擬方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表7。由表7可知，模擬方程的P＜0.05，說明模擬方程對(duì)EPS產(chǎn)量的影響是顯著的。模擬方程的一次項(xiàng)和交叉項(xiàng)對(duì)EPS產(chǎn)量的影響均不顯著，而二次項(xiàng)顯著，其中酵母粉的二次項(xiàng)為極顯著，其余為顯著。這說明各因素與EPS產(chǎn)量的關(guān)系并不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，而是一個(gè)復(fù)雜的二次關(guān)系。

表4 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果

表5 Box-Behnken設(shè)計(jì)各因素水平

表6 Box-Behnken設(shè)計(jì)及結(jié)果

表7 方程中各參數(shù)的回歸系數(shù)

2.4 響應(yīng)面分析 根據(jù)模擬方程，運(yùn)用Design-Expert軟件繪制各因素交互作用對(duì)EPS產(chǎn)量影響的響應(yīng)面曲線圖(圖1)。由圖1A可知，接種量固定為6%時(shí)，當(dāng)溫度不變，EPS產(chǎn)量隨酵母粉的增加先增后減;當(dāng)酵母粉不變時(shí)，EPS產(chǎn)量隨溫度的升高而減少，這與Plackett-Burman試驗(yàn)中溫度呈負(fù)相關(guān)的結(jié)論相一致。由圖1B可知，溫度固定為30℃，當(dāng)酵母粉不變時(shí)，EPS隨接種量的增加先增后減，當(dāng)接種量不變時(shí)，EPS產(chǎn)量隨酵母粉的增加先增后減;由圖1C可知，酵母粉固定為30 g/L時(shí)，當(dāng)溫度不變，EPS產(chǎn)量隨接種量的增加而減少;當(dāng)接種量不變，EPS產(chǎn)量隨溫度的增加而減少。響應(yīng)面曲線存在著EPS產(chǎn)量最大值，運(yùn)用軟件預(yù)測(cè)出產(chǎn)EPS產(chǎn)量最大的條件是:溫度29.7℃、酵母粉30.45 g/L、接種量5.76%，EPS產(chǎn)量可達(dá)到354.97 mg/L。

圖1 各因素交互作用對(duì)EPS產(chǎn)量影響的響應(yīng)面曲線圖

2.5 回歸模型的驗(yàn)證 為了驗(yàn)證響應(yīng)面法是否具有實(shí)用性和可靠性，根據(jù)篩選出的最佳發(fā)酵條件為實(shí)驗(yàn)條件，進(jìn)行了兩次平行實(shí)驗(yàn)，EPS產(chǎn)量分別為349.59 mg/L和352.26 mg/L。實(shí)驗(yàn)值和理論值基本一致，說明響應(yīng)面法具有較好的實(shí)用性和可靠性。

3 討論

乳酸菌胞外多糖(EPS)是乳酸菌在生長(zhǎng)代謝過程中分泌到細(xì)胞壁外常滲于培養(yǎng)基的一類糖類化合物，根據(jù)結(jié)構(gòu)可分為同多糖和雜多糖[1]。乳酸菌EPS的形成除了有利于改善產(chǎn)品的黏度和質(zhì)地外，還具有降血脂、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤等功能[5-6]。因此乳酸菌EPS作為微生物多糖的一個(gè)重要來源成為近年來的研究熱點(diǎn)。

乳酸菌同多糖的生物合成是在細(xì)胞外進(jìn)行的。特異性的糖基轉(zhuǎn)移酶參與合成反應(yīng)，并由蔗糖提供能量。乳酸菌雜多糖的生物合成是在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行的，其過程比較復(fù)雜，涉及多種酶的參與。葡萄糖是雜多糖生物合成所需的糖源，在細(xì)胞內(nèi)可轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸，這是合成EPS的關(guān)鍵中間產(chǎn)物，再經(jīng)磷酸葡萄糖變位酶形成葡萄糖-1-磷酸，后經(jīng)dTDP葡萄糖焦磷酸化酶生成EPS前體——糖核苷酸。糖核苷酸最終聚合成具有重復(fù)單元的EPS，并通過細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移分泌到細(xì)胞外[10]。目前重復(fù)單元的聚合機(jī)制以及聚合體的分泌輸出機(jī)制仍不清楚。

乳酸菌EPS的產(chǎn)量與菌種有密切關(guān)系[2]。菌株不同，EPS的合成能力差別很大，而同一菌株發(fā)酵條件不同，EPS的產(chǎn)量也有明顯差異。此外，培養(yǎng)基的成分(碳源、氮源、無機(jī)鹽等)和生長(zhǎng)條件(溫度、pH、接菌量、培養(yǎng)時(shí)間等)也是影響EPS產(chǎn)量的重要因素[11]，且不同營(yíng)養(yǎng)條件和環(huán)境條件下產(chǎn)生的EPS的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生理功能也有差異[12]。

培養(yǎng)基中氮源對(duì)乳桿菌胞外多糖產(chǎn)量有較大影響。半合成培養(yǎng)基中添加蛋白胨、酵母氮源和酵母提取物能提高乳桿菌EPS的產(chǎn)量[13]。礦物質(zhì)也是影響乳桿菌EPS的重要因素[14]，本研究選用應(yīng)用廣泛的磷酸氫二鉀進(jìn)行研究，結(jié)果影響不顯著，說明礦物質(zhì)與菌株之間具有特異性關(guān)系，有效的礦物質(zhì)還需要進(jìn)一步篩選。發(fā)酵時(shí)間也是影響EPS產(chǎn)量的重要因素之一[9-10]，一般認(rèn)為穩(wěn)定期相比對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期能生產(chǎn)更多的EPS，但隨著培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)，總產(chǎn)量會(huì)降低，這可能與培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分的減少有關(guān)，因此本研究選取26～48 h進(jìn)行研究。溫度對(duì)乳酸菌EPS合成的影響因菌株、培養(yǎng)條件不同而有差異[9-10]。一些菌株在相對(duì)較低的溫度下有利于EPS的合成，這可能是由于在較低溫度下，細(xì)胞壁的合成較慢，從而使較多的磷酸類異戊二烯用于EPS的合成。本研究的最適發(fā)酵溫度為29.7℃，低于菌體最適生長(zhǎng)溫度37℃，與前人結(jié)果一致。不同菌株和培養(yǎng)條件下的EPS合成的最適pH不同。研究證明，乳酸菌產(chǎn)EPS的最適pH值在6～7左右，因此本研究選擇pH 5.9～7.1范圍進(jìn)行研究。接種量是影響EPS產(chǎn)量的另一個(gè)重要因素，本研究選取三個(gè)梯度，結(jié)果表明接種量在6%時(shí)產(chǎn)量最高。

雖然乳酸菌EPS產(chǎn)量依賴于菌種本身特性，但通過優(yōu)化產(chǎn)EPS的最適培養(yǎng)條件，可以在一定程度上提高產(chǎn)量。由于影響EPS產(chǎn)量的因素較多，各種因素并不是孤立地起作用，而是相互影響和相互依賴的關(guān)系，給條件優(yōu)化帶來一定困難。雖然正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)也可找出最優(yōu)條件組合，但它難以直觀地判別優(yōu)化區(qū)域。響應(yīng)面分析方法也是一種最優(yōu)化方法[8]，是研究多種因素間交互作用的回歸分析方法，此方法能給出直觀的圖形，因而也能憑直覺觀察其最優(yōu)化點(diǎn)，它是將體系的響應(yīng)(EPS產(chǎn)量)作為多個(gè)因素(發(fā)酵溫度、氮源、接種量等)的函數(shù)，運(yùn)用圖形技術(shù)將這種函數(shù)關(guān)系顯示出來，可以直觀地分析各因素對(duì)響應(yīng)值(EPS產(chǎn)量)的影響，以及各因素之間的交互作用。要構(gòu)造這樣的響應(yīng)面，必須通過大量的試驗(yàn)數(shù)據(jù)(表6)建立一個(gè)合適的數(shù)學(xué)模型，再用此數(shù)學(xué)模型作圖(圖1)。

本研究首先采用Plackett-Burman法篩選出影響EPS產(chǎn)量的3個(gè)重要因素，再用最陡爬坡試驗(yàn)找出EPS產(chǎn)量最大的區(qū)域，最后用Box-Behnken法做出響應(yīng)面曲線圖。結(jié)果表明，鼠李糖乳桿菌產(chǎn)EPS最佳條件為溫度29.7℃、酵母粉30.45 g/L、接種量5.76%，此時(shí)EPS產(chǎn)量最大，為354.97 mg/L。

[1]Kleerebezem M，Hols P，Bernard E，et al.The extracellular biology of the lactobacilli[J].FEMS Microbiol Rev，2010，34(2):199-230.

[2]Welman A D，Maddox I S.Exopolysaccharides from lactic acid bacteria:perspectives and challenges[J].Trends Biotechnol，2003，21(6):269-274.

[3]Sutherland I.A sticky business.Microbial polysaccharides:current products and future trends[J].Microbiol Today，2002，29:70-71.

[4]Ruas-Madiedo P，Gueimonde M，Margolles A，et al.Exopolysaccharides produced by probiotic strains modify the adhesion of probiotics and enteropathogens to human intestinal mucus[J].Journal of Food Protection，2006，69(8):2011-2015.

[5]Liu C F，Tseng K C，Chiang S S，et al.Immunomodulatory and antioxidant potential of Lactobacillus exopolysaccharides[J].J Sci Food Agr，2011，91(12):2284-2291.

[6]Abd El-Gawad I，El-Sayed E，Hafez S，et al.Inhibitory effect of yoghurt and soya yoghurt containing bifidobacteria on the proliferation of Ehrlich ascites tumour cells in vitro and in vivo in a mouse tumour model[J].Brit J Nutr，2004，92(1):81-86.

[7]Gamar-Nourani L，Blondeau K，Simonet J M.Influence of culture conditions on exopolysaccharide production by Lactobacillus rhamnosus strain C83[J].J Appl Microbiol，1998，85(4):664-672.

[8]Bas D，Boyac i H.Modeling and optimization I:Usability of response surface methodology[J].J Food Eng，2007，78(3):836-845.

[9]馮美琴，邢家溧，張 琦，等.植物乳桿菌胞外多糖發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].食品科學(xué)，2011，(23):215-219.

[10]李盛鈺，曾憲鵬，楊貞耐.提高乳酸菌胞外多糖產(chǎn)量的途徑[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2009，(3):289-293.

[11]Ai L，Zhang H，Guo B，et al.Preparation，partial characterization and bioactivity of exopolysaccharides from Lactobacillus casei LC2W[J].Carbohyd Polym，2008，74(3):353-357.

[12]Ruas-Madiedo P，Hugenholtz J，Zoon P.An overview of the functionality of exopolysaccharides produced by lactic acid bacteria[J].Intern Dairy J，2002，12(2/3):163-167.

[13]De Vuyst L，Degeest B.Heteropolysaccharides from lactic acid bacteria[J].FEMS Microbiol Rev，1999，23(2):153-177.

[14]Cerning J，Bouillane C，Landon M，et al.Isolation and characterization of exopolysaccharides from slime-forming mesophilic lactic acid bacteria[J].J Dairy Sci，1992，75(3):692-699.