高效液相色譜法測(cè)定雞鴨羊組織中環(huán)丙氨嗪殘留量

周 煒，應(yīng)永飛，韋敏玨，羅成江，朱聰英

(浙江省獸藥監(jiān)察所，杭州 310020)

環(huán)丙氨嗪(2-環(huán)丙氨基-4，6-二氨基-S-三嗪，cyromazine)，又名滅蠅胺、滅蛆靈、滅蠅藥或蠅得凈，是一種選擇性昆蟲(chóng)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，可誘使雙翅目幼蟲(chóng)和蛹在形態(tài)上發(fā)生畸變，使成蟲(chóng)羽化不全或受到抑制。2002年我國(guó)農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)環(huán)丙氨嗪為三類新獸藥。通過(guò)飼喂方式進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)的環(huán)丙氨嗪，絕大部分以原形(約99%)及其代謝產(chǎn)物的形式隨糞便排出體外并沉積在糞便中，因而可用于控制動(dòng)物廄舍內(nèi)蠅蛆的生長(zhǎng)發(fā)育，改善畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境衛(wèi)生。盡管環(huán)丙氨嗪毒性較小，但大量研究表明環(huán)丙氨嗪在動(dòng)物體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物是三聚氰胺。據(jù)Melnick R L等[1]的研究表明，三聚氰胺可導(dǎo)致動(dòng)物體重下降、肝臟腫大、血液中血紅蛋白及血細(xì)胞減少、胎兒體重減輕，還可誘導(dǎo)小鼠膀胱腫瘤的形成，可能是一種致癌物質(zhì)。

我國(guó)農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告規(guī)定了:環(huán)丙氨嗪在羊肌肉、脂肪、肝、腎中的最高殘留限量為300 μg/kg;在禽肌肉、脂肪、副產(chǎn)品中的最高殘留限量為50 μg/kg，但對(duì)三聚氰胺尚未制訂最高殘留限量。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)肉雞組織、雞蛋、牛奶、土壤及飼料中環(huán)丙氨嗪及其代謝物——三聚氰胺殘留量的檢測(cè)進(jìn)行了大量研究，但羊組織及禽副產(chǎn)品中環(huán)丙氨嗪殘留量的檢測(cè)鮮有報(bào)道。已有研究表明，在大鼠、猴、羊、母雞體內(nèi)，環(huán)丙氨嗪經(jīng)口服后可被迅速吸收并迅速排泄，其中大于70%的環(huán)丙氨嗪以原型存在于排泄物中，三聚氰胺約為15%，氫氧化環(huán)丙氨嗪、甲基環(huán)丙氨嗪約2%[2]。亦有研究表明:三聚氰胺在動(dòng)物體富集快，但代謝亦快，在低濃度飼喂豬、雞時(shí)，休藥后三聚氰胺即基本代謝完全，殘留量極少[3]。因而，結(jié)合農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告，本研究擬不考慮三聚氰胺的殘留，僅開(kāi)展針對(duì)羊肌肉、脂肪、肝、腎和禽肌肉、脂肪、副產(chǎn)品中環(huán)丙氨嗪殘留檢測(cè)的研究。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 環(huán)丙氨嗪標(biāo)準(zhǔn)品(97.0%)，美國(guó)Sigma公司;混合陽(yáng)離子交換固相萃取柱(MCX，60mg:3mL)，美國(guó)Waters公司;Agilent 1100高效液相色譜儀(配紫外檢測(cè)器)及Agilent化學(xué)分析工作站，美國(guó)Agilent公司;Symmetry C18(4.6 mm×250 mm，5.0 μm)色譜柱、XBridgeTMHILIC(2.1 mm ×150 mm，3.0 μm)色譜柱、Atlantis HILIC(2.1 mm ×150 mm，3.0 μm)色譜柱，美國(guó) Waters公司;XDB C18(4.6 mm ×250 mm，5.0 μm)色譜柱、RX-SIL(2.1 mm ×150 mm，5.0 μm)色譜柱，美國(guó) Agilent公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液 準(zhǔn)確稱取環(huán)丙氨嗪標(biāo)準(zhǔn)品25 mg于25 mL容量瓶中，用甲醇配成濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液;吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.0 mL于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成10.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液;吸取適量體積的標(biāo)準(zhǔn)工作液，用流動(dòng)相稀釋含環(huán)丙氨嗪為0.05、0.10、0.20、0.50、1.0、2.0 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3 色譜條件 色譜柱:XBridgeTMHILIC(2.1 mm×150 mm，3.0 μm);檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm;流動(dòng)相為乙腈/25 mmol/L乙酸銨溶液(4∶96，V/V);柱溫30 ℃;流速0.3 mL/min;進(jìn)樣量20 μL。

1.4 樣品預(yù)處理

1.4.1 樣品提取 稱取(5±0.05)g試料于50 mL離心管中，加入15 mL提取液(乙腈∶1%三氯乙酸溶液，15∶85，V/V)，以 10000 r/min速度勻質(zhì)1 min，再以5000 r/min離心5 min，收集上清液，然后在殘?jiān)性偌尤?0 mL提取液，同樣步驟操作后合并上清液，用30 mL正己烷脫脂一次，收集乙腈相，加入5 mL異丙醇，在50℃水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮至1 mL左右，轉(zhuǎn)移至10 mL刻度離心管中，用2 mL提取液淋洗雞心瓶，合并提取液，待凈化。

1.4.2 樣品凈化 依次用甲醇3 mL和水3 mL活化MCX固相萃取柱，將待凈化液上柱，控制過(guò)柱速度在1 mL/min以內(nèi)。用甲醇3 mL、0.1 mol/L鹽酸溶液3 mL、水3 mL和甲醇3 mL淋洗固相萃取柱，抽干，用5%氨水甲醇溶液5 mL洗脫。洗脫液在50℃下氮?dú)獯蹈?，?.0 mL流動(dòng)相溶解殘?jiān)瑴u旋30 s，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后，上機(jī)測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)條件的優(yōu)化與選擇

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 目前，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中測(cè)定動(dòng)物組織中環(huán)丙氨嗪的方法中，測(cè)定波長(zhǎng)主要為214 nm[4-6]和 230 nm[7]，為了確定最佳檢測(cè)波長(zhǎng)，采用紫外分光光度計(jì)對(duì)最佳檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行了考察。用甲醇稀釋環(huán)丙氨嗪標(biāo)準(zhǔn)品至5 μg/mL溶液，照分光光度法測(cè)定，所得紫外光吸收?qǐng)D譜見(jiàn)圖1。

由圖1可知，環(huán)丙氨嗪在214 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，在230 nm波長(zhǎng)處吸收值較弱，因此，確定214 nm波長(zhǎng)為最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 環(huán)丙氨嗪紫外吸收光譜圖

2.1.2 液相色譜分離條件的確定 由于環(huán)丙氨嗪的極性較強(qiáng)，文獻(xiàn)報(bào)道采用C18柱和氨基柱作為分析柱。本研究根據(jù)魏瑞成等[8]對(duì)豬肉中環(huán)丙氨嗪殘留的提取方法，制備待測(cè)組織的提取液，作為陰性基質(zhì)樣本，隨后通過(guò)基質(zhì)加標(biāo)的方法對(duì)C18柱、氨基柱及HILIC柱的色譜分離性進(jìn)行考察。

結(jié)果顯示，C18柱、氨基柱均無(wú)法實(shí)現(xiàn)環(huán)丙氨嗪與雜質(zhì)的有效分離。而在HILIC柱條件下，當(dāng)流動(dòng)相中乙酸銨溶液/乙腈的比例為96∶4時(shí)，能得到較好的分離效果。羊肉樣品環(huán)丙氨嗪在HILIC色譜柱上的分離效果見(jiàn)圖2。

圖2 環(huán)丙氨嗪在HILIC柱上的高效液相色譜圖

2.1.3 干擾試驗(yàn) 考察在HILIC色譜柱條件下其他類似藥物對(duì)環(huán)丙氨嗪分析方法的干擾。環(huán)丙氨嗪在畜禽體內(nèi)主要代謝產(chǎn)物為三聚氰胺，本標(biāo)準(zhǔn)選用三聚氰胺進(jìn)行了干擾試驗(yàn)，采用環(huán)丙氨嗪的色譜條件，三聚氰胺的保留時(shí)間為8.9 min，不影響環(huán)丙氨嗪的檢測(cè)，三聚氰胺的色譜圖見(jiàn)圖3。

圖3 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液色譜圖

2.2 樣品前處理方法的優(yōu)化

2.2.1 樣品提取條件的確定 本研究比較了不同提取體積和提取次數(shù)下，乙腈/水溶液(95 ∶5、90 ∶10、85 ∶15、80 ∶20，V/V)以及1%三氯乙酸/乙腈溶液(90 ∶10、85∶15，V/V)對(duì)雞肉組織中環(huán)丙氨嗪的提取效能。具體步驟如下:取陰性樣本5.0 g，添加環(huán)丙氨嗪標(biāo)準(zhǔn)工作液適量，使之成為1.0 mg/kg陽(yáng)性添加樣品，分別用10 mL或15 mL提取液進(jìn)行提取，重復(fù)提取三次，提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至5 mL左右，經(jīng)MCX混合陽(yáng)離子交換柱凈化，上機(jī)測(cè)定，外標(biāo)法定量。各試驗(yàn)組均重復(fù)三次，結(jié)果以平均值表示，見(jiàn)表1所示。

表1 提取溶劑選擇及用量對(duì)環(huán)丙氨嗪提取效率的影響

從表1中可見(jiàn)，隨著含水量的增加，提取液的提取效率逐漸提高，但是含水量太高時(shí)，為后續(xù)的濃縮處理增加了難度。三氯乙酸具有明顯的沉淀蛋白作用，同時(shí)能改變提取環(huán)境的酸堿度為酸性，更有利于環(huán)丙氨嗪的提取，故具有更好的提取效率。綜合考慮后，選用三氯乙酸/乙腈溶液(85∶15，V/V)為提取劑。在提取體積的選擇上，發(fā)現(xiàn)無(wú)論是每次10 mL或15 mL提取液用量，總回收率均高于96%，且前兩次的回收率之和均高于94%?？紤]到盡量減少溶劑用量和節(jié)約時(shí)間等因素，本方法采用兩次提取，第一次提取溶液用量15 mL、第二次提取溶液用量10 mL，作為樣品的提取方法。

2.2.2 濃縮凈化條件的確定 目前對(duì)于環(huán)丙氨嗪的凈化方法，主要采用液液分配和固相萃取小柱進(jìn)行凈化，考慮到環(huán)丙氨嗪的極性較強(qiáng)，且容易得到質(zhì)子形成季銨鹽的陽(yáng)離子結(jié)構(gòu)，故本方法采用混合陽(yáng)離子交換柱進(jìn)行凈化。

由于提取液提取完成后，提取液中含有大量的脂肪等干擾物質(zhì)，特別是雞脂肪形成了上下兩層，需采用正己烷脫脂除去大部分的脂肪等干擾物質(zhì)。本方法采用正己烷脫脂的方法，萃取體積為30 mL，脫脂后脂肪層明顯減少，而環(huán)丙氨嗪因水溶性好而沒(méi)有明顯的損失，回收率穩(wěn)定。FSIS等方法采用部分提取直接進(jìn)行SPE凈化，但是由于不同基質(zhì)樣品中含水量不同，取固定體積上柱往往會(huì)影響到最后的體積系數(shù)，回收率不穩(wěn)定。且由于取部分提取液上柱，也在很大程度上降低了方法檢測(cè)限，采用高效液相色譜法無(wú)法達(dá)到雞組織及副產(chǎn)物最高殘留限量中50 μg/kg的要求。故需要先對(duì)提取液進(jìn)行濃縮，取濃縮液全部過(guò)柱的方法來(lái)提高方法的檢測(cè)靈敏度。由于提取液中水分比例較高，需對(duì)濃縮方法進(jìn)行研究，比較氮?dú)獯蹈煞ê托D(zhuǎn)蒸發(fā)法的適用性。采用氮?dú)獯蹈煞ê臅r(shí)費(fèi)力，大大影響檢測(cè)效率，而旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法可通過(guò)控制系統(tǒng)真空度的方法，在提高前處理效率的同時(shí)保證方法的回收率，故本方法采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法將樣品提取液濃縮至1 mL左右，用2 mL左右提取液淋洗雞心瓶二次，合并提取液，充分混勻后，在10000 r/min下冷凍(-4℃)離心10 min，取上清液，備用。

本標(biāo)準(zhǔn)的固相萃取條件主要參考FSIS等方法，結(jié)合混合陽(yáng)離子交換柱(MCX柱)的應(yīng)用條件，建立了以下凈化步驟:取5 mL上清液樣品轉(zhuǎn)移到經(jīng)3 mL甲醇、3 mL水活化的MCX固相萃取柱中，待全部溶液過(guò)柱后，再用3 mL甲醇淋洗、3 mL 0.1%鹽酸溶液淋洗、3 mL水淋洗和3 mL甲醇淋洗并抽干柱子1 min，最后用5 mL 5%氨水/甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，在50℃水浴中用氮?dú)獯蹈桑尤?.0 mL流動(dòng)相溶解，過(guò)濾膜后進(jìn)行HPLC分析。

2.3 檢測(cè)方法的方法驗(yàn)證

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 配置標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液，使其濃度為 0.05、0.10、0.20、0.50、1.0、2.0、5.0 mg/L。在上述色譜條件下，依次注入液相色譜儀進(jìn)行分析，以峰面積y對(duì)濃度x(mg/L)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程:y=411．15x-8．247，R2=0．9999，結(jié)果表明:當(dāng)環(huán)丙氨嗪在0.05～5.0 mg/L的濃度范圍內(nèi)時(shí)，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.3.2 檢測(cè)限和定量限的確定 農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告規(guī)定，羊肌肉、脂肪、肝、腎中環(huán)丙氨嗪的最高殘留限量為300 μg/kg，而禽肌肉、脂肪、副產(chǎn)品中的最高殘留限量為50 μg/kg。為了滿足這個(gè)要求，采用空白樣品中添加濃度25 μg/kg環(huán)丙氨嗪的方法進(jìn)行試驗(yàn)，考察方法的檢測(cè)限和定量限。經(jīng)回收率試驗(yàn)，當(dāng)動(dòng)物組織中添加環(huán)丙氨嗪為25 μg/kg時(shí)，信噪比(S/N)大于10;當(dāng)動(dòng)物組織中添加環(huán)丙氨嗪為10 μg/kg時(shí)，信噪比(S/N)大于3。所以，本方法將動(dòng)物性食品中環(huán)丙氨嗪殘留檢測(cè)的方法定量限確定為 25 μg/kg，檢測(cè)限確定為 10 μg/kg，完全能滿足實(shí)際樣品檢測(cè)的需要。

2.3.3 方法的回收率和精密度 根據(jù)我國(guó)農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告的規(guī)定:羊肌肉、脂肪、肝、腎組織中環(huán)丙氨嗪的最高殘留限量為300 μg/kg，禽肌肉、脂肪中環(huán)丙氨嗪的最高殘留限量為50 μg/kg，因而初定對(duì)25、50、100、300、600 μg/kg 五種空白添加濃度進(jìn)行方法學(xué)考查，不同組織的具體添加濃度及回收率數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

表2 不同動(dòng)物組織中環(huán)丙氨嗪回收率試驗(yàn) %

續(xù)表

續(xù)表

從回收率結(jié)果看出，羊肉、羊肝、羊腎和羊脂肪在25～600 μg/kg添加濃度范圍內(nèi)，回收率為74.4% ～107%，批內(nèi)RSD在0.9% ～11.9%之間，批間RSD在0.3% ～11.1%之間。雞肉、雞肝、雞脂肪和鴨肉在25～600 μg/kg添加濃度范圍內(nèi)，回收率為74.9% ～101%，批內(nèi) RSD在1.9% ～10.7%之間，批間RSD在1.2% ～7.1%之間。由此可見(jiàn)回收率滿足通常70% ～120%的規(guī)定，批內(nèi)RSD＜15%，批間RSD＜20%，說(shuō)明本方法能滿足動(dòng)物性食品中環(huán)丙氨嗪測(cè)定的需要。

2.3.4 實(shí)際樣品檢測(cè) 在本實(shí)驗(yàn)設(shè)定的檢測(cè)步驟和儀器條件下，對(duì)日常監(jiān)測(cè)和市場(chǎng)抽查的15例羊組織(肌肉、脂肪、肝臟)以及26例禽組織(雞肉、鴨肉、雞脂肪、鴨肝)進(jìn)行了檢測(cè)，均未發(fā)現(xiàn)環(huán)丙氨嗪殘留。

3 結(jié)論

研究建立了禽、羊可食性動(dòng)物組織中環(huán)丙氨嗪殘留檢測(cè)方法，采用三氯乙酸/乙腈提取，經(jīng)MCX固相萃取小柱凈化后，上機(jī)檢測(cè)，外標(biāo)法定量，檢測(cè)限為10 μg/kg，定量限為25 μg/kg。提取效果好，回收率在74% ～107%之間，批內(nèi)RSD為0.9～11.9%，批間RSD為0.3% ～11.1%，能充分滿足動(dòng)物性食品中環(huán)丙氨嗪檢測(cè)的需要，可為該藥物的監(jiān)控提供技術(shù)支持和保障，對(duì)保證國(guó)際之間正常貿(mào)易往來(lái)以及保障人類健康，具有十分重要的意義和實(shí)用價(jià)值。

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