兒茶素抑制肝癌細胞增殖、誘導凋亡作用研究

趙 新

（新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 內(nèi)科，新疆 烏魯木齊 830011）

茶是一種由山茶科植物葉片制成的飲料[1]。其中，綠茶在亞洲地區(qū)尤其是我國深受人們青睞。近年來，國內(nèi)外眾多研究者對綠茶中的提取物進行了大量的研究，其中的細胞培養(yǎng)等研究提示綠茶對人體大多數(shù)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有抑制作用[2]。綠茶干重的30%～42%是兒茶素（catechins）包括表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG），表沒食子兒茶素（epigallocatechin，EGC），表兒茶素沒食子酸酯（Epicatechin gallate，ECG），表兒茶素（Epicatechin，EC）[3]。其中，表沒食子兒茶素沒食子酸酯的抗癌作用尤為顯著。一系列動物實驗的結(jié)果證明EGCG對多種腫瘤均存在抑制作用[4]。EGCG可能通過干擾癌細胞生存所需的信號傳導而發(fā)揮其抗腫瘤作用[5-6]。該實驗旨在通過MTT法檢測EGCG對HepG2細胞增殖的影響，同時通過免疫細胞化學檢測及Western blot法觀察EGCG作用后HepG2細胞中Cyclin D1、Bcl-2的表達，探討EGCG發(fā)揮抗腫瘤作用的可能機制是否與其在體外引起細胞周期阻滯及細胞凋亡，但卻不引起明顯的細胞毒性有關(guān)，從而為肝癌化療新藥的開發(fā)提供可靠的實驗室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HepG2購于武漢細胞庫。RPMI 1640購自Gibco BRL。FBS購自杭州四季青公司。EGCG購于ALEXIS BIOCHEMICALS（純度＞95%，高效液相色譜法），DMS0 購自 Sigma。MTT，鼠抗人 Cyclin D1，Bcl-2，Beta-actin單抗，SP 試劑盒，96孔板，6孔板購自武漢薈萃生物公司。

1.2 儀器與設備

二氧化碳培養(yǎng)箱（2406-2），美國SHELLAB公司；倒置相差顯微鏡（DM3000），德國Leica公司；全自動酶標儀（ELX800），奧地利DIALAB公司；凝膠分析儀（GelDoc2000），美國BIO-RAD公司。

1.3 主要方法

HepG2常規(guī)培養(yǎng)、增殖、傳代、擴增以備用。細胞呈上皮樣貼壁生長，當生長至70%～80%融合時胰酶消化傳代，以培養(yǎng)液吹打制成細胞懸液，按不同實驗所需濃度接種。

1.3.1 MTT法檢測藥物對細胞增殖的影響 取對數(shù)生長期的HepG2按每孔1×105個接種于96孔板，每孔終體積為100μL。待12 h細胞完全貼壁后加入不同濃度（1、5、25 和 125mg/L）并設不接種細胞的空白對照。每一濃度做6個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。每孔加入MTT 20μL，37℃孵育4 h 3000 r/min離心10 min后小心吸棄上清。每孔加入DMSO 150μL輕輕震蕩10min，在490 nm波長酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔OD值，求平均值。細胞抑制率=（對照組-實驗組）/對照組×100%。

1.3.2 免疫細胞化學檢測Cyclin D1，Bcl-2的表達對數(shù)生長期HepG2消化制成細胞懸液后，調(diào)密度為5×104個/mL，每孔1mL細胞懸液接種于事先放置好蓋玻片的6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后分別加入5、25mg/L的EGCG，設不加藥的對照組。培養(yǎng)24 h后取出玻片，PBS洗后4%多聚甲醛固定10min，正常羊血清室溫封閉30min，滴加一抗（1∶50）4℃冰箱中過夜，滴加生物素化二抗室溫孵育30min，滴加SP復合物室溫孵育30min，DAB顯色，蘇木素復染，脫水，透明，封片，觀察照像。

1.3.3 W estern blot法檢測 Cyclin D1，Bcl-2 的表達 收集藥物作用后的HepG2各組細胞，提取總蛋白，用超微量紫外分光光度儀定量蛋白。取40μg總蛋白進行電泳后，蛋白轉(zhuǎn)移至0.22μm PVDF膜。然后一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1.5 h。ECL化學發(fā)光試劑發(fā)光，X線膠片進行顯影、定影、圖像分析。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 EGCG對HepG2細胞增殖的影響

不同濃度的EGCG作用HepG2細胞48 h后，MTT法測定吸光度（OD）值，結(jié)果顯示細胞生長受到不同程度的抑制，這種抑制作用呈濃度依賴性，隨著濃度的增大，OD值明顯減少，增殖抑制率明顯升高且與對照組相比差異有顯著性（P＜0.05）。見附表。

附表 EGCG對HepG2細胞增殖的影響 （n=6，）

附表 EGCG對HepG2細胞增殖的影響 （n=6，）

注：?與對照組相比，差異有顯著性，P＜0.05

組別 OD 抑制率/%對照組 0 1.187±0.05藥物EGCG 10.749±0.03? 7.750.602±0.02? 9.625 0.458±0.02? 47.7125 0.147±0.03? 80.8

2.2 免疫組化SP方法測定Cyclin D1和Bcl-2的表達

分別用5和25mg/L的EGCG處理HepG2細胞24 h后，免疫細胞化學染色發(fā)現(xiàn)對照組細胞染色強，Cyclin D1位于胞核，Bcl-2位于胞漿，染色后可見均勻的棕黃色顆粒；而處理組細胞Cyclin D1（圖1），Bcl-2（圖2）的表達水平與對照組的比較則有明顯下降。

2.3 Western blot法檢測Cyclin D1，Bcl-2的表達

EGCG處理HepG2細胞24 h后，提取蛋白，用Western Blot法檢測Cyclin D1和Bcl-2的表達情況。結(jié)果顯示，與空白對照組相比，EGCG處理組Cyclin D1和Bcl-2的表達明顯降低（圖3）。

圖1 不同實驗組HepG2細胞中Cyclin D1的表達（×400）

圖2 不同實驗組HepG2細胞中Bcl-2的表達（×400）

圖3 Cyclin D1及Bcl-2表達的變化

3 討論

肝細胞癌是世界五大惡性腫瘤之一，具有高死亡率、早期癥狀隱匿、預后差等特點[7]。其分子發(fā)病機制以及臨床治療的特異性靶點已成為當前人們普遍關(guān)注和迫切需要解決的問題。對腫瘤發(fā)病機制的深入研究顯示，細胞增殖和細胞凋亡平衡的破壞可導致腫瘤發(fā)生。研究細胞周期蛋白以及凋亡抑制蛋白在肝癌組織中的表達情況對研究肝癌的發(fā)生和發(fā)展具有重要意義，對肝癌的治療有潛在的價值。

近年來，關(guān)于EGCG的抗瘤作用，已經(jīng)成為人們研究的熱點。YU等[8]研究發(fā)現(xiàn)含有兒茶素成分的非成熟李子提取物可以明顯誘導HepG2凋亡。該研究證實在體外EGCG可以通過抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用。MTT比色法顯示EGCG呈濃度依賴性抑制肝癌HepG2細胞的增殖。為了進一步探討EGCG抗腫瘤的作用機制，通過免疫細胞化學以及Western blot法分析EGCG對Cyclin D1，Bcl-2表達的影響，用EGCG處理肝癌HepG2細胞后，各處理組分別出現(xiàn)Cyclin D1、Bcl-2的表達下調(diào)。細胞周期調(diào)控異常導致細胞的異常增殖是腫瘤發(fā)生的基礎。在細胞周期的進程中，關(guān)系到整個細胞周期啟動的G1→S轉(zhuǎn)換即真核細胞中的檢查點，是保證基因組復制和分離忠實性的重要調(diào)控點。細胞是否能無限增殖，在一定程度上是基于其是否能順利通過檢查點。細胞周期蛋白D家族（Cyclin D）是一種重要的G1/S期正性調(diào)控分子，包括3個亞型：Cyclin D1、Cyclin D2與Cyclin D3，能促進細胞增殖，加快細胞周期進程，當Cyclin D由于基因結(jié)構(gòu)或功能異常而表達失調(diào)，G1期縮短，細胞周期加快，使發(fā)生突變的基因組DNA得不到修復、細胞亦不發(fā)生凋亡，則有可能導致細胞無限增殖而誘發(fā)腫瘤。Cyclin D1是細胞周期啟動因子，作用于G1/S期轉(zhuǎn)換過程，促使細胞從G1期進入S期。Cyclin D1的超表達可使細胞發(fā)生難于控制的持續(xù)性增殖。近年來，有不少研究表明Cyclin D1基因參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，并被認為是一種原癌基因[9-10]。Cyclin D1過表達可見于乳腺癌、食管癌、胃癌、肺癌、頭頸部腫瘤、子宮癌、膀胱癌等多種腫瘤組織中。

EGCG可能通過下調(diào)Cyclin D1的表達，即檢查點重要正性調(diào)控分子Cyclin D1減少，從而使細胞無法從G1期順利的進入到S期，細胞周期的進程受到阻止。

正常細胞的增殖和凋亡是受到極其精細調(diào)控的基本生命現(xiàn)象。然而，惡性腫瘤細胞卻具有以下基本特征：一是細胞增殖失控，二是細胞凋亡紊亂。細胞凋亡（Apoptosis）是由于細胞內(nèi)外環(huán)境變化或死亡信號觸發(fā)以及在基因調(diào)控下所引起細胞主動死亡的過程，這一過程對于消除機體內(nèi)老化細胞或具有潛在性異常生長的細胞，以至于保持機體處于穩(wěn)定狀態(tài)起著至關(guān)重要的作用。體內(nèi)細胞凋亡調(diào)控機制發(fā)生紊亂將引起人體發(fā)生多種腫瘤的形成。細胞凋亡主要通過兩種途徑進行：一種是通過激活細胞表面的凋亡受體，進一步活化Caspase8，最終激活Caspase3而引起凋亡；另一種途徑則是各種刺激因子作用于線粒體時，線粒體膜釋放細胞色素C并激活Caspase9從而引起凋亡。bcl-2是細胞凋亡研究中最受重視的癌基因之一。Bcl-2能促進細胞存活，抑制細胞凋亡。Bcl-2是阻斷細胞凋亡最后共同通路的關(guān)鍵蛋白，在其表面的疏水性溝能與促凋亡BH3域結(jié)合，該二聚體對凋亡的調(diào)節(jié)至關(guān)重要[11]。Bcl-2抑制細胞凋亡亦可通過抑制細胞色素C的釋放和抑制Caspase的活化而實現(xiàn)[12-13]。

EGCG可能通過多種機制誘導凋亡，HAYAKAWA等[14]研究表明EGCG能與Fas結(jié)合，啟動Fas介導的凋亡過程，活化Caspase8，從而誘導人單核細胞白血病U937凋亡。吳育晶等[15]發(fā)現(xiàn)EGCG誘導凋亡機制可能與其下調(diào)HepG2細胞內(nèi)Bcl-2蛋白的表達，上調(diào)Bax蛋白的表達，從而促進Caspase3活化有關(guān)。LEONE等[11]研究發(fā)現(xiàn)EGCG因具有獨特的gallate基團而能與Bcl-2、Bcl-xL的疏水域緊密結(jié)合，故可直接有效抑制抗凋亡Bcl-2家族成員，從而促進腫瘤細胞的凋亡。

EGCG還可能一方面通過下調(diào)抗凋亡基因bcl-2的表達，使凋亡基因的表達相對而言占優(yōu)勢，最終發(fā)揮其抗癌作用；另一方面如同白藜蘆醇誘導凋亡與細胞周期調(diào)控系統(tǒng)破壞相關(guān)[16]，EGCG對凋亡的誘導亦可能與其阻止細胞周期進程，破壞細胞周期調(diào)控系統(tǒng)有關(guān)，故EGCG誘導細胞凋亡是否存在途徑選擇性，目前仍有待進一步的研究。

該實驗采用不同濃度的EGCG對肝癌HepG2細胞進行干預。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EGCG不僅抑制肝癌HepG2細胞的增殖，同時還明顯下調(diào)肝癌HepG2細胞中Cyclin D1和Bcl-2的表達。因此，可以推測EGCG可能通過對細胞增殖和細胞凋亡的調(diào)節(jié)而發(fā)揮其抗腫瘤的作用。

目前，關(guān)于EGCG如何影響細胞增殖的機制仍不十分清楚。HASTAK等[17]通過對前列腺癌LNCaP細胞的研究發(fā)現(xiàn)EGCG通過使p53蛋白的穩(wěn)定性增強并且上調(diào)p53表達，從而使其下游蛋白p21WAF1和Bax活性增強，使Bax/Bcl-2朝有利于腫瘤細胞凋亡的比例改變，從而誘導腫瘤細胞凋亡發(fā)揮其抗瘤作用。GUPTA等[18]認為EGCG的抗癌作用主要在于干擾細胞周期的進程導致腫瘤細胞周期阻滯，與此同時朱寶和等[19]指出EGCG可以抑制VEGF誘導的血管生成，從而抑制腫瘤生長和血管生成。

綜上所述，近幾年EGCG已成為抗癌藥物研發(fā)的又一熱點，該實驗初步探討了EGCG可能的抗癌機制，然而關(guān)于EGCG抗癌的確切機制仍有待更多實驗室依據(jù)的證明和進一步的闡明。

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