槲皮素對人內(nèi)皮祖細胞增殖和凋亡的影響及機制研究

胥光熱，彭永權(quán)，林 靜，劉應(yīng)才

（1.遂寧市中心醫(yī)院 心血管內(nèi)科，四川 遂寧 629000；2.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科，四川 瀘州 646000；3.四川大學(xué)華西醫(yī)院 心血管內(nèi)科，四川 成都 610041）

槲皮素（quercetin，Que）是醋柳總黃酮的主要單體之一，廣泛存在于蔬菜、水果及植物藥中，在心血管保護方面起重要作用。近年來發(fā)現(xiàn)Que具有抗氧化的生物學(xué)活性。研究表明其抗氧化主要表現(xiàn)在促進電子轉(zhuǎn)移，清除自由基（活性氧/活性氮）；螯合過度金屬離子；維持和再生α-生育酚等。Que對冠心病（CHD）具有防治作用已得到研究的充分證實。EPCs對冠狀動脈疾病的內(nèi)皮修復(fù)過程起著重要的作用，其數(shù)量和功能受損可導(dǎo)致內(nèi)皮損傷與修復(fù)之間的動態(tài)平衡破壞。因此，外周血EPCs數(shù)量和功能與冠狀動脈的血管損傷密切相關(guān)，是冠心病的危險因素[1]。氧化應(yīng)激引起EPCs數(shù)量減少和功能減弱，促進冠心病的發(fā)生發(fā)展[2]。但對于Que如何防治冠狀動脈粥樣硬化的進展，目前尚無定論。因此，我們通過體外培養(yǎng)臍血內(nèi)皮祖細胞，觀察Que在氧化應(yīng)激條件下對EPCs的影響，以探討Que治療冠心病可能的機制。

1 材料與方法

1.1 試劑

槲皮素、成纖維細胞生長因子（b-FGF）、DiI標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍祝―iI-ac-LDL）、FITC標(biāo)記的荊豆凝集素-1（FITC-UEA-1）、Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒、Anisomycin購自美國Sigma，人纖連蛋白購自Milipure，血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）購自Pepro Tech，優(yōu)質(zhì)胎牛血清購自Hyclone公司，鼠抗人p-JNK抗體、小鼠SP檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒購自中山金橋，鼠抗人CD133單克隆抗體購自北京博奧森，F(xiàn)ITC-兔抗鼠IgG購自武漢博士德，WST-1檢測試劑盒購自碧云天。

1.2 方法

1.2.1 EPCs的分離、誘導(dǎo)、培養(yǎng) 臍血（每份60 mL）取自瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科足月健康分娩的新生兒，告知產(chǎn)婦用于科學(xué)研究并得到其認可。按1∶3的比例加入明膠，常溫下靜置30min，收集上清液，離心1000 r/min，10min，棄上清液，用無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋混勻后按3∶2加入人淋巴細胞分離液上，離心2000 r/min，20 min，小心吸取中間白膜層單個核細胞，用DMEM培養(yǎng)基離心洗滌2遍，再用M199培養(yǎng)基調(diào)整密度為4×106/mL接種于纖連蛋白包被培養(yǎng)瓶中，另加10%胎牛血清，1%青鏈霉素，VEGF 50 ng/mL，b-FGF 1 ng/mL飽和濕度、5%二氧化碳的37℃孵箱中培養(yǎng)，每3～4 d換夜；繼續(xù)培養(yǎng)至7～8 d，PBS洗滌掉非貼壁細胞，收集貼壁細胞供進一步實驗用。

1.2.2 EPCs鑒定 ①細胞形態(tài)學(xué)鑒定：倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學(xué)變化。②免疫熒光檢測表面標(biāo)志CD133：培養(yǎng)7 d的貼壁細胞行細胞爬片，40 g/L多聚甲醛固定30min后，3%H2O2孵育10 min，用Triton-100打孔，血清封閉后，加鼠抗人CD133抗體（1∶300稀釋），4℃冰箱過夜，滴加FITC標(biāo)記的兔抗鼠IgG，37℃孵育60min，熒光顯微鏡下觀察拍照。③細胞免疫熒光雙染色鑒定：細胞培養(yǎng)至9 d后行細胞爬片。待細胞貼壁完全后進行Dil-ac-LDL熒光染色鑒定。細胞在含Dil-ac-LDL（2.4μg/mL）的培養(yǎng)液中37℃孵育1 h，然后2%的多聚甲醛固定10min，均勻滴加濃度為10μg/mL FITC-UEA-1于上述標(biāo)本上，繼續(xù)在孵箱培養(yǎng)1 h。PBS漂洗后在熒光顯微鏡下觀察顯示紅色熒光為ac-LDL陽性細胞，顯示綠色熒光為UEA-1陽性，染色雙陽性為正在分化的EPCs。

1.3 實驗分組

細胞培養(yǎng)至第7天后用不含EDTA的0.25%胰酶消化貼壁細胞，調(diào)整細胞密度為2×106/mL，按照每孔2mL接種于6孔板，隨機分為空白對照組、H2O2（500μmol/L）氧化應(yīng)激模型組、Que（60、90和120μmol/L）預(yù)處理30min后H2O2再處理8 h共同干預(yù)組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后施加上述不同的干預(yù)因素。

1.4 細胞增殖

將培養(yǎng)7 d的細胞以2×103個均勻接種于96孔板，待細胞完全貼壁后用不含血清的M199培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，使細胞生長同步化。同時再加入各種干預(yù)因素繼續(xù)培養(yǎng)24和48 h后，每孔加入10μL WST-1溶液，繼續(xù)孵育2 h，置酶標(biāo)儀450 nm波長測定OD值。每個實驗組均設(shè)6個復(fù)孔同時進行實驗。

1.5 EPCs凋亡的檢測

雙染免疫熒光法EPCs凋亡的觀察：培養(yǎng)待檢測細胞，PBS洗滌2次后，加入Binding Buffer懸浮細胞，再分別加入5μL的FITC-Annexin-v、PI混勻，室溫避光反應(yīng)10min，將蓋玻片倒置于載玻片上，于熒光顯微鏡雙色濾光片（FITC和羅丹明）下觀察，F(xiàn)ITC-Annexin-v熒光信號呈綠色，PI熒光信號紅色。在1 h內(nèi)上機檢測，同時收集細胞懸浮液，流式細胞儀檢測并計算各組細胞的凋亡率。

1.6 EPCs凋亡機制研究

1.6.1 免疫細胞化學(xué)法檢測EPCs p-JNK蛋白表達 取出培養(yǎng)7 d的細胞在6孔板中爬片，40 g/L多聚甲醛固定30 min鐘后，3%H2O2孵育10 min，用Triton-100打孔，血清封閉后，滴加1∶100稀釋的鼠抗人p-JNK一抗，用PBS緩沖液（0.01 mol/L，pH 7.4）代替一抗作為陰性對照，4℃冰箱過夜，滴加二抗，37℃孵育30min，PBS液代替一抗作陰性對照，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，光鏡觀察陽性信號。

1.6.2 JNK激動劑對EPCs凋亡的影響 將上述細胞隨機分為空白對照組、JNK激動劑Anisomycin 10μmol/L+H2O2（500μmol/L）組、JNK 激動劑 Anisomycin 10μmol/L+Que （60、90 和 120μmol/L）+H2O2（500μmol/L） 組，JNK 激動劑組先加入10μmol/L Anisomycin預(yù)處理1 h后再施加其他干預(yù)因素，流式細胞儀檢測各組的凋亡率。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 EPCs的鑒定

①剛分離的單個核細胞倒置相差顯微鏡下呈圓形，胞體透亮，折光性好，散在分布于培養(yǎng)液中。3～4 d后，圓形細胞逐漸拉長，呈梭形貼壁生長，并有少量細胞突起（見圖1A）。培養(yǎng)7 d后梭形細胞較前明顯增多，細胞體積增大，部分視野可呈集落樣生長，有一定的方向性（見圖1B）。

圖1 內(nèi)皮祖細胞的形態(tài)學(xué)特征（×200）

②早期EPCs以表達CD133、CD34為主，晚期可表達KDR。其中CD133在EPCs向成熟內(nèi)皮細胞分化過程中其數(shù)量迅速減少。因此，可作為EPCs區(qū)別成熟內(nèi)皮細胞的分子標(biāo)志[3]。細胞免疫熒光檢測CD133陽性細胞呈綠色，陽性率達95%以上。見圖2。

③DiI-ac-LDL染色呈紅色（見圖3），F(xiàn)ITC-UEA-1染色呈綠色（見圖4），DiI-ac-LDL和FITC-UEA-1免疫熒光雙染色陽性的細胞呈黃色，定義為內(nèi)皮祖細胞[4]，陽性率＞90%。見圖5。

圖2 CD133陽性細胞的免疫熒光檢測

圖3 DiI-ac-LDL染色

圖4 FITC-UEA-1染色

圖5 內(nèi)皮祖細胞

2.2 Que對EPCs增殖的影響

在正常培養(yǎng)條件下，與空白對照組比較，60～90μmol/L的 Que可以促進 EPCs的增殖，120μmol/L的Que則表現(xiàn)出抑制EPCs增殖的作用，與培養(yǎng)24 h比，在48 h對EPCs的抑制作用較為明顯，差異有顯著性（P ＜0.05）（見表 1）；在氧化應(yīng)激條件下，與空白對照組比較，H2O2組EPCs增殖能力明顯降低，差異有顯著性（P＜0.01），加入60～120 μmol/L的Que處理后，H2O2誘導(dǎo)的EPCs損傷后的細胞增殖能力得到明顯改善，且具有明顯的時間和濃度依賴性，與H2O2組比較，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.01）（見表 2）。

表1 在生理條件下Que對EPCs增殖的影響（，n=6）

表1 在生理條件下Que對EPCs增殖的影響（，n=6）

注：1） 與對照組比較，P ＜0.05；2） 與對照組比較，P ＜0.01；3）與60μM Que組比較，P ＜0.05；4）48 h與 24 h相比，P ＜0.05

OD值24 h 48 h對照組 - 0.2920±0.0112 0.2983±0.0091 Que 60 0.3266±0.00672） 0.3561±0.00612）4）Que 90 0.3416±0.00552）3） 0.3712±0.00752）3）4）Que 120 0.2882±0.01021） 0.2616±0.00382）4）組別劑量/（μmol/L）

2.3 Que對H2O2誘導(dǎo)的EPCs凋亡的影響

免疫熒光觀察結(jié)果顯示綠色的為凋亡早期細胞，紅色為死亡細胞，核桔黃色而膜綠色為凋亡晚期細胞。流式細胞儀檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)Que在60～120μmol/L范圍內(nèi)隨著濃度的增加，且抗EPCs凋亡作用逐漸增強。在60、90、120μmol/L濃度的Que作用下，凋亡率依次為（27.43±0.37）%、（23.12±0.45）%和（22.43±0.16）%，與 H2O2誘導(dǎo)組（36.58±0.45）%的凋亡率比較，差異有顯著性（P＜0.01）；與 90μmol/L Que+H2O2組比較，120μmol/L Que+H2O2組的凋亡率無明顯差異（P＜0.05）（見表3，圖6）。免疫細胞化學(xué)p-JNK陽性表達細胞胞漿和胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒，隨著槲皮素濃度的增加，p-JNK陽性表達產(chǎn)物逐漸減少，染色變得淺淡（見圖7）。Que能夠抑制加入JNK激動劑后EPCs凋亡率的 增 加 ，Anisomycin+Que（60μmol/L、90μmol/L、120μmol/L）+H2O2組的凋亡率依次為 （42.36±0.53）%、（38.32±0.15）%和（35.78±0.27）%，與 Anisomycin+H2O2組（47.35±0.64）%比較，差異有顯著性（P＜0.05）。見表 4，圖8。

表2 在氧化應(yīng)激條件下Que對EPCs增殖的影響（，n=6）

表2 在氧化應(yīng)激條件下Que對EPCs增殖的影響（，n=6）

注：1） 與對照組比較，P ＜0.01；2） 與 H2O2組比較，P ＜0.01；3）與60μM Que組比較，P ＜0.05；4）與 90μM Que組比較，P ＜0.05；5）48 h與24 h比較，P＜0.05

OD值24 h 48 h對照組 - 0.2920±0.0112 0.2983±0.0091 H2O2 500 0.1175±0.00441） 0.1033±0.00551）Que+H2O2 60 0.1336±0.00372） 0.1526±0.00482）5）Que+H2O2 90 0.1568±0.00492）3） 0.1743±0.00492）3）5）Que+H2O2 120 0.1838±0.00512）4） 0.2039±0.00672）4）5）組別 劑量/（μmol/L）

圖6 H2O2誘導(dǎo)的EPCs凋亡的流式細胞儀檢測

圖7 免疫細胞化學(xué)法p-JNK蛋白表達

表3 Que對H2O2誘導(dǎo)的EPCs凋亡的影響（，n=6）

表3 Que對H2O2誘導(dǎo)的EPCs凋亡的影響（，n=6）

注：1） 與對照組比較，P ＜0.01；2） 與 H2O2組比較，P ＜0.01；3）與90μM Que+H2O2組比較，P＜0.05

組別劑量/（μmol/L）凋亡率/%對照組 - 13.52±0.36 H2O2 500 36.58±0.451）Que+H2O2 60 27.43±0.582）3）Que+H2O2 90 23.12±0.372）Que+H2O2 120 22.43±0.162）

表4 JNK激動劑對H2O2誘導(dǎo)的EPCs凋亡的影響（，n=6）

表4 JNK激動劑對H2O2誘導(dǎo)的EPCs凋亡的影響（，n=6）

注：?與 Anisomycin+H2O2組比較，P＜0.05

組別劑量/（μmol/L）凋亡率/%對照組 - 13.52±0.36 Anisomycin+H2O2 - 47.35±0.64 Anisomycin+Que+H2O2 60 42.36±0.53?Anisomycin+Que+H2O2 90 38.32±0.30?Anisomycin+Que+H2O2 120 35.78±0.54?

圖8 JNK激動劑對H2O2誘導(dǎo)的EPCs凋亡的影響

3 討論

內(nèi)皮祖細胞（EPCs）最早由ASAHARA[5]分選出來，隨后的研究發(fā)現(xiàn)，EPCs在周圍血管病變所致的缺血組織和心肌梗死區(qū)的血管新生和血管形成中發(fā)揮著重要的作用。CAROLINE博士的小組對43名正常受試者、44名穩(wěn)定性心絞痛患者以及33名急性冠脈綜合癥患者進行10個月的隨訪后指出冠心病患者外周血內(nèi)皮祖細胞數(shù)量，形成集落數(shù)，細胞增殖能力明顯降低。EPCs數(shù)量和功能受損可導(dǎo)致內(nèi)皮損傷與修復(fù)之間的動態(tài)平衡破壞，其數(shù)量減少是預(yù)示動脈粥樣硬化疾病進展的獨立因素[6]。

目前，Que類藥物正在成為預(yù)防和治療冠心病的手段之一。研究表明，Que的攝入量與冠心病的發(fā)病率和死亡率呈負相關(guān)[7]，Que的內(nèi)皮保護作用可能與抗氧化及抑制炎癥介質(zhì)的作用有關(guān)，Que可以作用于NF-κB和激活蛋白-1（AP-1）而起抗炎作用，保護內(nèi)皮的完整性；Que可以抑制COX-2而起抗炎作用；Que通過抑制單核細胞對血管壁的黏附而起到抗炎保護內(nèi)皮的作用。此外，還有研究表明Que能抑制血管平滑肌細胞的增生肥大。Que具有內(nèi)皮保護作用，但Que對EPCs功能的影響目前尚無相關(guān)研究。以往研究發(fā)現(xiàn)，Que可抑制腫瘤細胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，而對遭受H2O2等氧化刺激因子的正常細胞來說，Que可通過阻斷JNK及ERK兩條途徑達到抑制凋亡的發(fā)生[8]。H2O2誘導(dǎo)EPCs凋亡與氧化還原信號調(diào)節(jié)機制有關(guān)[9]，200μmol/L H2O2可使凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1（ASK1）活化，P38和JNK表達增加，EPCs凋亡增多[10]，而 500μmol/L H2O2可造成EPCs的氧化應(yīng)激損傷模型[11]。Que可通過JNK信號通路抑制細胞凋亡，而H2O2誘導(dǎo)EPCs氧化損傷使JNK活化增加，EPCs凋亡增多。但目前國內(nèi)外尚無有關(guān)Que能否直接影響EPCs數(shù)量和功能的研究。

在本研究中，WST-1結(jié)果示：H2O2組EPCs較正常對照組增殖能力明顯降低，加入60～120μmol/L的Que處理后，H2O2誘導(dǎo)的EPCs損傷后的細胞增殖能力得到明顯改善，且具有明顯的時間和濃度依賴性。而在基礎(chǔ)狀態(tài)下，60～90μmol/L的Que處理的EPCs較正常對照組增殖，而120μmol/L的Que則表現(xiàn)出抑制EPCs增殖的作用?？梢奞ue對不同狀態(tài)的EPCs作用是不同的，對于不同狀態(tài)的EPCs需要尋找最佳的Que濃度。具體機制尚不清楚，可能與高濃度（通常在100μmol/L以上）的Que產(chǎn)生的細胞毒性有關(guān)。H2O2作為活性氧可促進大量氧自由基產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)而誘發(fā)氧化應(yīng)激損傷，抑制細胞功能、促進細胞衰老和凋亡，Que（60～120μmol/L）和H2O2共同干預(yù)組與 H2O2組比較能顯著改善氧化應(yīng)激條件下EPCs增殖功能的抑制，減少EPCs的凋亡，且具有濃度依賴性，這與之前報道的Que呈劑量依賴性的促進H2O2誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞增殖的結(jié)果較一致[12]。但更高濃度的槲皮素對氧化應(yīng)激條件下EPCs增殖和凋亡的影響還有待進一步研究。

此外，本研究還顯示Que在60～120μmol/L范圍內(nèi)隨著濃度的增加，抗H2O2誘導(dǎo)損傷的EPCs凋亡作用均逐漸增強。有學(xué)者認為H2O2可使凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1（ASK1）活化，P38和JNK表達增加，H2O2是誘導(dǎo)者，JNK是氧化損傷的維持因子。本研究中通過免疫細胞化學(xué)檢測H2O2組p-JNK蛋白表達明顯高于其它實驗組，這可能與H2O2使EPCs的ASK1活化增加，導(dǎo)致JNK的持續(xù)激活從而使EPCs凋亡增多有關(guān)。Que能夠抑制加入JNK激動劑后EPCs凋亡率的增加，且免疫組化顯示加入Que后p-JNK陽性表達產(chǎn)物減少，推測Que對EPCs氧化應(yīng)激損傷的保護作用除了與其抗炎、抗氧化、清除氧自由基有關(guān)外，還可能通過JNK信號通路抑制EPCs凋亡。MA[13]等報道氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）可通過Akt/eNOS途徑引起EPCs的凋亡，oxLDL通過下調(diào)Akt的磷酸化水平來抑制其下游eNOS的活性并使其表達水平降低，導(dǎo)致NO產(chǎn)量減少，從而引起EPCs的凋亡。而他汀類藥物促進EPCs動員和改善其功能的分子機制與PI3K-Akt依賴的eNOS活化有關(guān)。研究表明Que可保護H2O2誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞的損傷及修復(fù)，其作用可能與NO水平有關(guān)[14]，而NO由NO合酶（NOS）催化而形成，Que的抗EPCs凋亡的作用機制是否與Akt/eNOS信號通路是是下一步研究探討的重點。

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