eNOs基因T786C多態(tài)性與原發(fā)性高血壓的關(guān)系*

梁蓉王偉

原發(fā)性高血壓的發(fā)生具有復(fù)雜性和多源性，受環(huán)境和遺傳因素的共同影響。隨著遺傳學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對原發(fā)性高血壓的病因研究進(jìn)入到了分子階段，高血壓發(fā)病的基因因素成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOs）基因?qū)ρ獕赫{(diào)節(jié)的作用目前很受關(guān)注。本文通過研究eNOs基因T786C多態(tài)性與原發(fā)性高血壓的相關(guān)性，旨在從分子水平探討原發(fā)性高血壓的發(fā)病機(jī)制。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2003年6月—2004年6月入住我院的原發(fā)性高血壓患者266例（高血壓組）。其中男135例，女131例，平均年齡（49.89±8.74）歲。所有患者均符合1999 WHO/ISH高血壓診斷標(biāo)準(zhǔn)：在未服用抗高血壓藥的情況下收縮壓≥140 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa），或（和）舒張壓≥90 mm Hg，且至少3次非同日血壓達(dá)到以上標(biāo)準(zhǔn)；或已確診為高血壓且正在服用抗高血壓藥物者。排除繼發(fā)性高血壓、凝血功能異常性疾病、血栓性疾病、腦血管疾病、外周血管性疾病、風(fēng)濕性瓣膜病、先天性心臟病、心肌病及心力衰竭者。同時(shí)選取在我院體檢的健康人群100例為對照組，其中男50例，女50例，平均年齡（48.05±8.04）歲，其本人和一級親屬均無原發(fā)性高血壓、2型糖尿病、心腦血管病或內(nèi)分泌代謝疾病。

1.2 方法

1.2.1 資料收集 所有受試者入院后空腹12 h抽取肘正中靜脈血4 mL，常規(guī)測定生化及凝血功能等各項(xiàng)指標(biāo)。并紀(jì)錄其身高、體質(zhì)量、入院當(dāng)天血壓、吸煙（每日5支以上，超過5年）史及飲酒（每日飲乙醇50 g以上，超過5年）史。

1.2.2 eNOs基因T786C的PCR擴(kuò)增 以提取的DNA為模板，根據(jù)設(shè)計(jì)的引物，上游5′-ATGCTCCCACCAGGGCAT CA-3′，下游5′-GTCCTTGAGTCTGACATTAGGG-3′；用PCR方法進(jìn)行特異性擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系總體積為25μL，其中含模板0.5μL，引物各0.5μL，Buffer F 5μL，dNTPs 0.5μL，Taq DNA聚合酶 1.25 U。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸60 s，35個循環(huán)，最后72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物用3%的瓊脂糖電泳測定PCR擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.3 eNOs基因T786C的PCR酶切 該反應(yīng)體系12.7μL，包括Buffer 1.25μL，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10μL，限制性內(nèi)切酶NgoM Ⅳ0.2μL，dH2O 1.25μL，37℃水浴8 h，反應(yīng)終止后，用3%瓊脂糖電泳分析eNOs基因T786C的基因多態(tài)性。

1.2.4 eNOS基因T786C基因型分析 受檢者DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增為237 bp的片段，若此片段存在786T?C位點(diǎn)突變，則產(chǎn)生限制性內(nèi)切酶NgoMⅣ的切點(diǎn)。酶切后得到大小為204 bp和33 bp的2個片段，為CC型；不含T?C位點(diǎn)突變，酶切后只得到1個大小為237 bp的片段，為TT型；酶切后得到237、204和33 bp3個片段者，為CT型，見圖1。

Figure1 Electrophotogram of eNOsgene T786Cpolymorphism圖1 eNOS基因T786C多態(tài)性基因型電泳圖

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 資料均采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn)，多組間的計(jì)量資料比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料采用卡方（χ2）檢驗(yàn)，采用多因素Logistic回歸分析影響高血壓發(fā)病的因素，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組一般資料比較 高血壓組的年齡、收縮壓、舒張壓、體質(zhì)量指數(shù)及有飲酒史者均高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）；其他指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表1。

2.2 2組eNOS基因T786C基因型和等位基因頻率比較 2組TT、TC及CC基因型分布和T、C等位基因頻率分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表2。

Table1 Comparison of clinical data between two groups表1 2組一般資料比較

Table 2 Comparison of eNOST786C genotype and allele frequency between two groups表2 2組eNOS基因T786C基因型和等位基因頻率比較例（%）

2.3 不同eNOS基因T786C基因型患者的血壓比較 因CC基因型檢出率過低，故將TC、CC基因型合并為一組，為C等位基因攜帶組。高血壓組患者中C等位基因攜帶者的收縮壓及舒張壓與TT基因型者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表3。

Table 3 Comparison of blood pressure in patients with T786CeNOSgenotype表3 eNOS基因T786C基因型患者血壓比較（mm Hg，±s）

Table 3 Comparison of blood pressure in patients with T786CeNOSgenotype表3 eNOS基因T786C基因型患者血壓比較（mm Hg，±s）

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2.4 影響高血壓的多因素Logistic回歸分析 以有無高血壓（無：0；有：1）為應(yīng)變量，以年齡、性別（女：0；男：1)、空腹血糖、總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、纖維蛋白原、吸煙（否：0；是：1）、飲酒（否：0；是：1）、體質(zhì)量指數(shù)、T786C基因型（TT型：0，CC/TC型：1）為自變量進(jìn)行二元Logistic回歸分析，結(jié)果顯示影響高血壓的因素有年齡、性別和體質(zhì)量指數(shù)，見表4。

Table 4 Results of Logistic regression analysison risk factors of EH表4 高血壓影響因素的多因素Logistic回歸分析結(jié)果

3 討論

1980年Furchgjott等發(fā)現(xiàn)NO作為內(nèi)皮衍生的舒張因子發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。一氧化氮合酶（NOs）是NO合成的限速因子。在人類基因組有3種不同的基因編碼NOs，分別為內(nèi)皮型NOs（eNOs）基因、誘導(dǎo)型NOs基因和神經(jīng)元型NOs基因。它們在不同細(xì)胞的刺激下合成NO，發(fā)揮不同的作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞生成的NO擴(kuò)散至血管平滑肌細(xì)胞和血流中，導(dǎo)致肌肉舒張、血管擴(kuò)張和血流量增加，對于調(diào)節(jié)血管的張力和血壓，維持動脈彈性具有重要作用[1]。其中eNOs是結(jié)構(gòu)型NOs在上皮細(xì)胞的表達(dá)，在NOs基因與高血壓關(guān)系的研究中，eNOs基因被予以特別關(guān)注。動物實(shí)驗(yàn)研究顯示，該基因?qū)ρ獕旱恼{(diào)節(jié)起重要作用[2-3]；抑制NOs可使健康人的血壓升高。eNos基因在人類染色體上定位于7q35-q36區(qū)，大小約21 kb，含有26個外顯子和25個內(nèi)含子。迄今發(fā)現(xiàn)在eNOS基因的5′側(cè)翼區(qū)檢測到3個單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)：-1468T/A、-922A/G和-786T/C變異。

國內(nèi)外許多對T786C基因多態(tài)性與原發(fā)性高血壓關(guān)系的研究結(jié)果不同[4]。Nakayama等[5]研究發(fā)現(xiàn)T786C突變可以降低啟動子的活性，從而降低eNOS基因轉(zhuǎn)錄起始過程的效率，使eNOS合成減少，其還發(fā)現(xiàn)eNos基因啟動子的T786C突變減少基因的轉(zhuǎn)錄并與冠狀痙攣性心絞痛及心肌梗死有關(guān)。為明確基因轉(zhuǎn)錄減少的機(jī)制，Miyamoto等[6]在Hela細(xì)胞純化出特異地與突變等位基因結(jié)合的蛋白，這一純化的蛋白被證實(shí)是復(fù)制蛋白A1（RPA1），其認(rèn)為在T786C突變中，RPA1通過與突變等位基因結(jié)合，從而使eNOs基因轉(zhuǎn)錄減少。Kajiyama等[7]隨后進(jìn)行的T786C突變與高血壓關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn)高血壓組與對照組的T786C突變頻率相似。Tsujita等[8]對4 055例日本人研究也未發(fā)現(xiàn)高血壓組與正常組的T786C基因型分布不同，3種基因型的血壓水平也未見差異。其同時(shí)對轉(zhuǎn)染-786T及-786C等位基因的牛內(nèi)皮細(xì)胞研究，未發(fā)現(xiàn)啟動子活性有顯著不同。后來Hyndman等[9]研究了705例成年男性原發(fā)性高血壓患者，發(fā)現(xiàn)eNOs的5′-側(cè)翼區(qū)的T786C變異與EH明顯相關(guān)，其認(rèn)為研究結(jié)果的差異可能是不同人種的T786C突變情況不同，白人中C等位基因較普遍。

本研究結(jié)果顯示高血壓組與對照組TT、CT、CC基因型分布和T、C等位基因分布差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明T786C基因多態(tài)性與高血壓發(fā)生無相關(guān)性。但進(jìn)一步將高血壓與危險(xiǎn)因素結(jié)合起來分析，發(fā)現(xiàn)血壓明顯受體質(zhì)量指數(shù)影響。提示C等位基因可能增強(qiáng)了機(jī)體對某些環(huán)境因素刺激的反應(yīng)，存在環(huán)境-基因相互作用，共同影響血壓的水平。

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