清醒大鼠重度失血性休克模型指標(biāo)建立及有效性評(píng)價(jià)*

張 艷 王宇歆 馬 濤 姚麗靜 張 響 楊成民 金學(xué)隆

失血性休克（HS）是由手術(shù)意外、嚴(yán)重創(chuàng)傷后急性失血引起的，是臨床常見的急危重癥[1]。有文獻(xiàn)報(bào)道，約1/3的創(chuàng)傷患者死于入院前失血性休克[2]，其中發(fā)生在創(chuàng)傷后24 h內(nèi)的致死率高達(dá)50%，2 h內(nèi)的致死率為20%[3]。失血量>40%導(dǎo)致的重度失血性休克成為現(xiàn)代創(chuàng)傷學(xué)和輸血學(xué)研究的重點(diǎn)。研究表明，傳統(tǒng)的血流動(dòng)力學(xué)與血液學(xué)參數(shù)尚不能準(zhǔn)確地鑒別重度失血性休克的程度與預(yù)后，尤其對(duì)于失血量超過35%的休克患者[4-5]。本研究采用制作失血量為全身總血量65%的清醒大鼠重度失血性休克模型，建立有效的檢測指標(biāo)，從血?dú)夂脱樗岬冉M織代謝學(xué)方面探討失血性休克的病理生理機(jī)制，為進(jìn)一步評(píng)價(jià)高效血液代用品對(duì)于意外傷害引起的重度失血性休克的院前搶救奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF清潔級(jí)雄性SD大鼠37只，購自天津?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中心，合格證：SCXK（津）2010-002，體質(zhì)量（335.83±21.87）g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。隨機(jī)分為3組：（1）NaCl組（n=12）：輸入0.9%NaCl溶液。（2）全血組（n=12）：輸入大鼠自身抗凝全血。（3）萬汶組（n=13）：輸入6%羥乙基淀粉（商品名：萬汶）。造模成功后立即等量回輸各組樣品。

1.2 主要試劑與儀器 0.9%氯化鈉注射液、5%葡萄糖注射液均購自中國大冢制藥有限公司，萬汶（羥乙基淀粉130/0.4氯化鈉注射液）購自北京費(fèi)森尤斯卡醫(yī)藥有限公司，血清乳酸試劑盒購自南京建成生物工程研究所。超凈臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），NOVAStatprofilephox血?dú)夥治鰞x（NOVA公司，美國），離心機(jī)（上海手術(shù)器械廠），多道生理記錄儀（BIO-PACMP150，美國），TG12M毛細(xì)血管離心機(jī)（長沙市湘儀離心機(jī)儀器有限公司），T-500電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠），756PC紫外可見光分光光度計(jì)（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 建立模型 在大鼠3μL/g的10%水合氯醛進(jìn)行腹腔注射麻醉下，麻醉平穩(wěn)后，乙醇消毒腹股溝、背部皮膚，剪毛備皮，直徑約1cm，碘氟消毒，將PE50導(dǎo)管從背部皮下引至左側(cè)腹股溝皮下。手指觸摸左側(cè)股動(dòng)脈搏動(dòng)，剪1～2cm的切口，從切口處，鈍性分離皮下組織，暴露股動(dòng)脈，插管、結(jié)扎、固定。縫合外皮處敷用云南白藥止血。將背部縫合，固定導(dǎo)管。術(shù)后先用5%葡萄糖注射液（5mL/只），再用青霉素鈉抗感染治療，最后肝素封堵導(dǎo)管。

插管術(shù)后恢復(fù)24h，按體質(zhì)量的6.5%放其全身總血量的65%，流速為0.5mL/min。放血過程分為兩個(gè)階段：第一階段放其全身血量的35%，停置10min；再放其全身血量的30%，平均放血時(shí)間為（65±20）min，使大鼠平均動(dòng)脈壓（MBP）達(dá)到（46±14）mmHg（1mmHg=0.133kPa），造成重度失血性休克。放血完畢后，立即等量回輸各組樣品，分別觀察其復(fù)蘇效果。

1.4 檢測指標(biāo) 分別于放血前、放血末、輸液末及輸液2h后記錄大鼠MBP、呼吸頻率（R）及體溫（T）。于放血前、放血末及輸液2h后取血并測定紅細(xì)胞比容（HCT）；從左側(cè)股動(dòng)脈抽取0.5mL血樣，做血?dú)夥治?，測定pH、血氧分壓[p（O2）]、氧飽和度（SO2）、二氧化碳分壓[p（CO2）]及剩余堿（BE）值。按乳酸試劑盒說明從左側(cè)股動(dòng)脈抽取1mL血液，4000r/min離心5min，取上清液并測定血清乳酸（LacticAcid，LD）。觀察復(fù)蘇后24h與48h的大鼠存活情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)均采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，不同時(shí)點(diǎn)比較采用重復(fù)測量方差分析，不同組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般生理指標(biāo)的變化 大鼠的平均動(dòng)脈壓和體溫在不同時(shí)間和不同處理方式差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.01），在不同的處理方式下不同測量時(shí)間變化的趨勢不同（P<0.01）。放血末，各組大鼠的平均動(dòng)脈壓和體溫均較放血前明顯降低；輸液后動(dòng)脈血壓均有所回升，全血組升高幅度更大。輸液后，全血組大鼠體溫逐漸上升，2h后基本達(dá)到放血前水平，而NaCl組和萬汶組大鼠的體溫持續(xù)下降，但NaCl組下降幅度更大。放血前、末及輸液后各組大鼠的呼吸頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1～3。

Table1 Changesofmeanarterialpressure betweenratgroups表1 各組大鼠平均動(dòng)脈壓變化（mmHg，±s）

Table1 Changesofmeanarterialpressure betweenratgroups表1 各組大鼠平均動(dòng)脈壓變化（mmHg，±s）

F組內(nèi)=154.81**，F(xiàn)組間=8.55**，F(xiàn)交互=11.39**；*P<0.05，**P<0.01，表2～6同

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Table2 Changesofbreathingbetweenratgroups表2 各組大鼠呼吸變化 （次/min，±s）

Table2 Changesofbreathingbetweenratgroups表2 各組大鼠呼吸變化 （次/min，±s）

F組內(nèi)=1.51，F(xiàn)組間=0.28，F(xiàn)交互=0.217

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Table3 Changesoftemperaturebetweenratgroups表3 各組大鼠體溫變化 （℃，±s）

Table3 Changesoftemperaturebetweenratgroups表3 各組大鼠體溫變化 （℃，±s）

F組內(nèi)=25.16**，F(xiàn)組間=8.39**，F(xiàn)交互=58.6**

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2.2 HCT的變化 大鼠HCT在不同時(shí)間存在組內(nèi)差異（P<0.01），隨不同處理方式存在組間差異（P<0.05），且在不同的處理方式下不同測量時(shí)間變化的趨勢不同（P<0.01）。清醒大鼠放血末，HCT均明顯降低。輸液后2h，全血組HCT較萬汶組和NaCl組升高（均P<0.001），見表4。

Table 4 Changes of HCT between rat groups表4 各組大鼠HCT的變化 （%，±s）

Table 4 Changes of HCT between rat groups表4 各組大鼠HCT的變化 （%，±s）

F組內(nèi)=286.97**，F(xiàn)組間=4.38*，F(xiàn)交互=40.82**

全血組（2）萬汶組（3）F 12 13 35.60±3.59 37.33±3.28 1.202 25.00±3.83 27.33±2.96 1.075 29.20±4.37 15.67±2.02 59.689**（1）∶（3）（2）∶（3）0.735<0.001

2.3 血?dú)庾兓?除p（CO2）組間效應(yīng)和SO2交互作用差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，大鼠動(dòng)脈血?dú)庠诓煌瑫r(shí)間存在組內(nèi)差異（P<0.01），隨不同處理方式存在組間差異（P<0.01），且在不同的處理方式下不同測量時(shí)間變化的趨勢不同（P<0.01）。放血末，各組大鼠p（O2）、SO2較放血前有所升高。輸液后2 h，NaCl組的p（O2）持續(xù)升高，SO2明顯降低；全血組和萬汶組p（O2）明顯下降，全血組在恢復(fù)p（O2）方面優(yōu)于萬汶組，但均未達(dá)放血前水平，SO2無明顯恢復(fù)。

放血末，各組pH、p（CO2）及BE均明顯下降。輸液后2 h，NaCl組p（CO2）明顯恢復(fù)，但仍未達(dá)放血前水平，而pH和BE無明顯改善；全血組與萬汶組pH、p（CO2）及BE較放血末均明顯升高，且全血組恢復(fù)效果優(yōu)于萬汶組，基本恢復(fù)到放血前水平，見表5、6。

Table 5 Changes of arterial blood gas between rat groups表5 各組大鼠動(dòng)脈血?dú)獾淖兓?（±s）

Table 5 Changes of arterial blood gas between rat groups表5 各組大鼠動(dòng)脈血?dú)獾淖兓?（±s）

n項(xiàng)目pH p（CO2）（mm Hg）p（O2）（mm Hg）SO2 BE（mmol/L）組別NaCl組全血組萬汶組NaCl組全血組萬汶組NaCl組全血組萬汶組NaCl組全血組萬汶組NaCl組全血組萬汶組12 12 13 12 12 13 12 12 13 12 12 13 12 12 13放血前7.51±0.06 7.52±0.03 7.53±0.03 36.68±4.50 35.54±3.17 33.54±3.02 80.13±10.17 83.65±5.89 86.38±5.48 0.95±0.02 0.95±0.01 0.97±0.07 6.28±1.52 6.27±2.89 6.26±1.98放血末7.47±0.06 7.47±0.05 7.45±0.07 19.40±3.82 20.15±3.98 21.93±5.30 118.60±5.15 119.13±17.52 112.16±8.22 0.97±0.01 0.96±0.01 0.98±0.01-7.12±3.89-6.62±3.99-6.55±4.07輸液后2 h 7.41±0.12 7.53±0.02 7.52±0.03 27.11±4.87 33.19±2.37 31.81±3.07 136.34±18.30 97.67±9.10 109.43±11.91 0.95±0.03 0.96±0.01 0.98±0.02-8.27±4.49 6.19±1.78 4.28±2.65

2.4 血乳酸的變化 大鼠血清乳酸鹽在不同時(shí)間存在組內(nèi)差異（P<0.01），隨不同處理方式存在組間差別（P<0.05），且在不同的處理方式下不同測量時(shí)間變化的趨勢不同（P<0.05）。放血末，各組大鼠的血清乳酸鹽的水平均明顯升高，大于放血前的4倍；輸液后2 h，各組大鼠血乳酸水平逐漸恢復(fù)，全血組和萬汶組的血乳酸水平明顯降低，基本達(dá)到放血前的水平；而NaCl組，血乳酸水平無明顯恢復(fù)，見表7。

Table 6 Blood gas values between rat groups表6 各組大鼠血?dú)庾兓慕y(tǒng)計(jì)量

Table7 Changesof arterial lactacidemia levelsin severehemorrhagic shock consciousrats表7 清醒大鼠重度失血性休克后動(dòng)脈血乳酸水平的變化（mmol/L，±s）

Table7 Changesof arterial lactacidemia levelsin severehemorrhagic shock consciousrats表7 清醒大鼠重度失血性休克后動(dòng)脈血乳酸水平的變化（mmol/L，±s）

F組內(nèi)=92.05**，F(xiàn)組間=3.74*，F(xiàn)交互=3.398*

組別 n 放血前 放血末 輸液后2 h 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理P NaCl組（1）全血組（2）萬汶組（3）F 12 12 13 2.15±0.95 2.13±0.64 2.13±0.47 0.269 9.38±3.34 9.58±2.33 9.56±0.64 1.654 6.17±2.68 2.31±0.96 2.86±1.44 10.743**組比（1）∶（2）（1）∶（3）（2）∶（3）<0.001 0.003 0.623

2.5 存活率 NaCl組、全血組及萬汶組大鼠24 h的存活率分別為25%（3只）、91.7%（11只）和69.2%（9只）；48 h存活率為16.7%（2只）、91.7%（11只）和53.8%（7只）。

3 討論

超半數(shù)全身血容量的丟失可降低全身灌注壓，直接導(dǎo)致血流動(dòng)力學(xué)的改變。本研究清醒大鼠失血量達(dá)全身總血量的65%，突破了以往在麻醉狀態(tài)下制作模型的情況，避免了麻醉劑對(duì)機(jī)體各生理指標(biāo)的干擾，與臨床情況更相符。

本研究表明，放血后，大鼠平均動(dòng)脈壓和體溫迅速下降，說明大鼠血流動(dòng)力學(xué)明顯衰退，血容量明顯不足，基礎(chǔ)代謝顯著下降。血流動(dòng)力學(xué)衰退致使微循環(huán)血流明顯減少、HCT顯著降低，說明紅細(xì)胞含量明顯減少，組織從血液中攝取氧的能力下降[6]。因此，失血后大鼠表現(xiàn)出皮膚與肢端蒼白、神志不清等缺血、缺氧表現(xiàn)；還輸液體后，全血組大鼠的平均動(dòng)脈壓明顯升高，體溫在輸液后2 h基本達(dá)到放血前水平，較萬汶組和NaCl組更能明顯改善大鼠的血流動(dòng)力學(xué)。通過觀察動(dòng)脈血?dú)庵械膒（O2）、p（CO2）、pH、BE以及血清乳酸鹽水平在清醒大鼠重度失血性休克過程中的變化情況，從呼吸和代謝兩個(gè)方面對(duì)動(dòng)物組織氧供狀況進(jìn)行研究。結(jié)果表明，放血末，各組大鼠的p（O2）和SO2值并未下降，反而升高，p（CO2）明顯下降，提示通氣頻率和潮氣量沒有相應(yīng)改變，外呼吸功能沒有受到影響，這與鄭東友等[7]的研究結(jié)果一致，可能的原因：（1）血容量下降直接刺激交感神經(jīng)系統(tǒng)，使機(jī)體發(fā)生一系列變化，包括心率增快、外周血管收縮，使血液重新分布以維持有效的循環(huán)血容量。（2）低血容量反射性興奮呼吸中樞，呼吸加深加快，代償性通氣增強(qiáng)，利于從外界攝取更多的氧以提高肺泡氧分壓和動(dòng)脈血氧分壓。（3）血容量下降，使組織灌注降低，代謝下降，CO2產(chǎn)生減少；輸液后2 h，與NaCl組相比，全血組和萬汶組的p（O2）和p（CO2）值得到明顯改善，基本達(dá)到休克前水平。放血末，各組大鼠的pH、BE值降低，血清乳酸鹽水平升高，產(chǎn)生代謝性酸中毒，這與Maier等[8]的研究結(jié)果一致。其可能原因：（1）休克時(shí)，大量失血使紅細(xì)胞數(shù)量減少、紅細(xì)胞變形性下降、血液黏度增高以及血液攜氧與二氧化碳能力下降，而血流量降低使微循環(huán)血流減少致微循環(huán)障礙，進(jìn)一步加重組織缺氧、組織細(xì)胞內(nèi)糖無氧酵解增強(qiáng)，引起乳酸增加，發(fā)生乳酸性酸中毒。（2）失血過程中，血管內(nèi)血流減緩導(dǎo)致乳酸鹽運(yùn)輸?shù)礁?、腎組織的量減少，因此降低了乳酸鹽的清除[9-10]。（3）由于失血量達(dá)全身血容量的65%，屬重度失血性休克，肝、腎缺血性損害導(dǎo)致乳酸不能被清除，進(jìn)一步加重乳酸酸中毒[11]。研究表明，當(dāng)乳酸鹽濃度升高是源于組織灌注不足時(shí)，機(jī)體的緩沖系統(tǒng)不能中和代謝性酸中毒的發(fā)生，機(jī)體呈失代償，pH和BE降低[12]。因此，失血性休克時(shí)出現(xiàn)的酸堿平衡紊亂主要是由于代謝性酸中毒，而酸中毒又可加劇微循環(huán)障礙，進(jìn)而導(dǎo)致組織氧供與氧需求失衡。輸液后2 h，與NaCl組比較，全血組和萬汶組可以顯著提高pH、p（CO2）及BE，明顯降低動(dòng)脈血乳酸濃度，糾正酸中毒、改善組織灌注，這表明具有攜氧功能的全血和新一代代血漿萬汶能明顯改善失血性休克時(shí)機(jī)體的組織氧供。

本研究發(fā)現(xiàn)，休克復(fù)蘇后全血組和萬汶組在提升平均動(dòng)脈壓，糾正酸中毒等方面的性能優(yōu)于生理鹽水，復(fù)蘇后大鼠24 h與48 h的存活率全血組最高，萬汶次之，NaCl組最差，表明該模型能夠客觀地反映不同復(fù)蘇液的抗休克性能。

動(dòng)脈血?dú)夥治瞿軌驕?zhǔn)確的檢測出血液中的酸堿度、p（O2）和p（CO2），可為組織血流灌注或評(píng)估缺氧程度提供可靠的參考指標(biāo)；血乳酸是體內(nèi)糖無氧酵解的特異性代謝產(chǎn)物，能直接反映無氧代謝和組織氧合代謝狀況，是組織供氧不足的可靠指標(biāo)；而存活時(shí)間能綜合反映低血容量狀態(tài)下動(dòng)物各器官及其功能的受損程度，是缺血、缺氧和代謝性酸堿失衡的綜合體現(xiàn)，所以監(jiān)測動(dòng)脈血?dú)?、血乳酸及觀察存活率對(duì)于診斷失血性休克、評(píng)估休克的嚴(yán)重程度及預(yù)后具有十分重要的意義。

[1]許會(huì)彬,趙蓮,尤國興，等.失血性休克條件下大鼠血漿代謝組學(xué)分析[J].醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志,2008,5(2):105-109.

[2]Villela NR,Tsai AG,Cabrales P,etal.Improved resuscitation from hemorrhagic shock with Ringer’slactatewith increased viscosity in the hamster windowchamber Model[J].JTrauma,2011,71(2)：418-424.

[3]Lomas-Niera JL,Perl M,Chung CS,etal.Shock and hemorrhage:an overview of animal models[J].Shock,2005,24(1):33-39.

[4]Paladino L,Sinert R,Wallace D,etal.The utility of base deficit and arterial lactate in differentiating major from minor injury in trauma patients with normal vital signs[J].Resuscitation，2008,77（3）:363-368.

[5]Meredith A.Lactate and acid base as a hemodynamic monitor and markers of cellular perfusion[J].Pediatr Crit Care Med，2011,12(4):S43-49.

[6]Sheng C，Yu YH，Zhao KS,etal.Hypotensive resuscitation com?bined with polydatin improve microcirculation and survival in a rab bit model of uncontrolled hemorrhagic shock in pregnancy[J].J Surg Res，2011，168(1):103-110.

[7]鄭東友，遲靜茹，林長賦.三種膠體對(duì)失血性休克組織代謝的影響[J].中國急救醫(yī)學(xué),2003,23(6):377-379.

[8]Maier S,Holz-H?lzl C,Pajk W,etal.Microcirculatory parameters after isotonic and hypertonic colloidal fluid resuscitation in acute hemorrhagic shock[J].JTrauma，2009 ，66(2):337-345.

[9]Abt R,Lustenberger T,Stover JF,etal.Base excess determined within one hour of admission predicts mortality in patients with se?vere pelvic fractures and severe hemorrhayic shole[J].Eur JTrauma Emerg Surg，2009,35（5）:429-436.

[10]Wilson M,Davis DP,Coimbra R.Diagnosis and monitoring of hem?orrhagic shock duringtheinitial resuscitation of multiple trauma pa?tients:areview[J].Emerg Med ，2003，24(4):413-422.

[11]Akira T,Minori S,Shinya U,etal.Effects of arterial oxygen content on oxidative stress during resuscitation in a rat hemorrhagic shock model[J].Resuscitation，2011,82(1):110-114.

[12]Smith I,Kumar P,Molloy S,etal.Base excess and lactate as prog?nostic indictors for patients admitted to intensive care[J].Intensive Care Med，2001,27（1）:74-83.