章金鳳 李佳林 張麗華
(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)烏蘭察布市第二醫(yī)院,內(nèi)蒙古集寧 012000;2.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010017;3.內(nèi)蒙古自治區(qū)天奇藥業(yè)有限公司,內(nèi)蒙古赤峰024000)
組方由酸棗仁、丹參、五味子3味草藥組成,具有補心養(yǎng)肝,安神益智的作用。用于心肝血虛,神經(jīng)衰弱引起的失眠健忘,頭暈,頭痛。為使本產(chǎn)品質(zhì)量更加可控,經(jīng)多次試驗,確立了本品中丹參有效成分丹參素鈉含量測定方法,陰性無干擾,經(jīng)方法學(xué)考察,方法的重復(fù)性、穩(wěn)定性、精密度、回收率試驗均符合有關(guān)規(guī)定。
高效液相色譜儀:儀器型號 Lab Alliance;檢測器:Model 500;泵:Series III;色譜工作站:ANASTAR;迪馬Column Dimension柱(4.6×250mm ,5μm);AB135-S電子天平;Model C3860A超聲波儀(上海超聲儀器廠)。對照品:丹參素鈉對照品(含量測定用 批號110855-200507)(中國藥品生物制品鑒定所)。試劑:甲醇、乙腈、磷酸為色譜純,水為二次蒸餾水。
2.1 波長的選擇:取丹參素鈉對照品適量,加甲醇溶液配成每1mL含0.102mg的溶液,在200~500nm的波長范圍內(nèi)掃描。結(jié)果本品在281nm處有最大吸收。
2.2 色譜條件:色譜柱:迪馬Column Dimension柱(4.6×250mm,5μm),流動相:甲醇 -乙腈 -磷酸三乙胺水溶液(取純凈水約800mL,置1000mL量瓶中,精密加入磷酸1.70mL振搖,精密加入三乙胺1.80mL,加純凈水稀釋至刻度,搖勻,即得)(5:1:94)
2.3 溶液的制備
對照品溶液的制備:取丹參素鈉對照品適量,精密稱定,加甲醇制成每1mL含206μg的溶液,即得。
供試品溶液的制備:取本品適量,研細,取約2.0g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇50mL,密塞,稱定重量,加熱回流1h,放冷,再稱定重量,用甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。
陰性干擾試驗:取除丹參外其它藥材按樣品制備方法制成樣品,按供試品溶液的制備方法制成丹參陰性樣品溶液。
精密吸取供試品溶液、陰性液、對照品溶液各10μL,注入液相色譜儀中,繪制液相色譜圖,由色譜圖提示,在對照品色譜相應(yīng)的位置上,供試品溶液具有相同保留時間的色譜峰,陰性液在此峰位無吸收,對本品中丹參含量測定無干擾,方法專屬性良好,見圖(1~3)。
圖1 丹參素鈉對照品HPLC圖譜
圖2 三味益肝顆粒陰性樣品HPLC圖譜
圖3 三味益肝顆粒樣品HPLC圖譜
2.4 提取溶劑的選擇:取本品適量,研細,取約2.0g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇50mL,密塞,稱定重量,加熱回流1h,放冷,再稱定重量,用甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。
取本品適量,研細,取約2.0g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入稀乙醇25mL,密塞,稱定重量,加熱回流1h,放冷,再稱定重量,用稀乙醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。
精密吸取上述溶液各10μL,按擬定的色譜條件進樣,結(jié)果如下:
表1 提取溶劑的考察結(jié)果
2.5 線性范圍考察精密稱取丹參素鈉對照品于25mL量瓶中加甲醇稀釋至刻度。精密吸取上述對照品溶液1、2、3、4、5mL 置10mL 量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,制得 41.2,22.4,123.6,164.8,206μg·mL-1的對照品溶液,分別進樣10μL,測得色譜峰面積,以峰面積為縱坐標(biāo),以濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算得回歸方程:
Y=4009X -4235 ,r=0.9999。試驗結(jié)果如下:
表2 線性范圍考察結(jié)果
試驗結(jié)果表明丹參素鈉在 41.2 ~206μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積程良好的線性關(guān)系。
2.6 穩(wěn)定性性試驗:取樣品(批號081211)研細,取粉末0.5g,精密稱定,按正文[2.3溶液的制備]項下制備供試液,精密吸取同一供試液,分別于0、2、4、6、8 h進樣分析,測定色譜峰面積,測定結(jié)果見表3。
表3 穩(wěn)定性試驗考察結(jié)果
試驗結(jié)果提示:供試液制備后8h內(nèi)測定,色譜峰面積無明顯變化,在此時間內(nèi),待測組分化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。
2.7 精密度試驗:取同一份供品溶液10μl,連續(xù)進樣5次,記錄色譜圖。結(jié)果如下:測定結(jié)果表明,本品精密度試驗符合有關(guān)規(guī)定。
表4 精密度試驗測定結(jié)果
2.8 重復(fù)性試驗:取本品(批號081211),研細,分別取粉末2.0g,5份,精密稱定,分別按正文[2.3溶液的制備]項下方法操作,測定,測定結(jié)果見表10。
表5 重現(xiàn)性試驗測定結(jié)果
測定結(jié)果表明,本試驗重現(xiàn)性良好。
2.9 回收率試驗考察:精密稱取本品(批號081211,含量2.00mg·g-1)5份,分別精密加入對照品于樣品中,按[2.3溶液的制備]項下制備供試品溶液,按上述色譜條件依法測定,結(jié)果如下:
表6 回收率試驗測定結(jié)果
測定結(jié)果提示:本方法回收率在99.79% ~102.3%之間,RSD為0.24%,符合有關(guān)規(guī)定。
表7 樣品中丹參素鈉含量
2.10 樣品含量測定數(shù)據(jù):經(jīng)采用[2.3溶液的制備]項下方法,測定十批樣品中丹參素鈉的含量,測定結(jié)果見下表。
本品工藝摸索中,10批丹參藥材丹參素含量均高于3%,因此確定丹參含量限度為本品含丹參素不得少于3%。
根據(jù)上述測定結(jié)果,參照工藝中制定的丹參含量限度,我們?nèi)】偲骄康?0%作為本制劑丹參素的限量確定本品每袋含丹參以丹參素計不得低于2.2mg。
3.1 本制劑處方處方中的丹參含有丹參酚酸,丹參酮Ⅱ和丹參素等成分,但前兩者為醇溶性物質(zhì),而本制劑為水提,所以選用水溶性的丹參素來測定本品的含量。
3.2 檢測波長的選擇:經(jīng)紫外光譜掃描丹參素鈉在281nm有最大吸收,故選用281nm為檢測波長。
3.3 流動相的選擇:參照《中國藥典》2005年版一部丹參藥材含量測定項下及文獻報道[1],采用甲醇-乙腈-磷酸三乙胺水溶液(5:2:93)和甲醇-乙腈-磷酸三乙胺水溶液(5:1:94)為流動相,進行色譜圖分析,通過實驗發(fā)現(xiàn)后者較前者分離效果好,丹參素鈉與雜質(zhì)峰分離度符合規(guī)定。故選用甲醇-乙腈-磷酸三乙胺水溶液(5:1:94)為流動相。
3.4 樣品提取方法的選擇[2-4]:三味益肝顆粒丹參中丹參素的提取受提取溶劑影響較大,如在相同的提取時間下分別用甲醇及稀乙醇作為提取溶劑,可發(fā)現(xiàn)兩種溶劑提取丹參素鈉含量相差較大,用甲醇提取較為完全,故選用甲醇為提取溶劑。
方法學(xué)研究表明,采用HPLC法對處方中丹參的丹參素含量進行測定,結(jié)果準(zhǔn)確,重復(fù)性好,可作為三味益肝顆粒質(zhì)量控制指標(biāo)之一。
[1]中華人民共和國國家藥典委員會.中國藥典[S].2005年版
[2]陳發(fā)奎.常用中草藥有效成分含量測定[M].人民衛(wèi)生出版社1997.
[3]中華人民共和國國家藥典委員會.衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)(中藥成分制劑)[S].1998.50.
[4]陰健,郭力弓.中藥現(xiàn)代研究與臨床應(yīng)用(1)[M].北京:學(xué)苑出版社,1995.168,196,352,468.