申 遠(yuǎn) 陳樂(lè)玥 華 欣 申貴雋＊ 于愛民

（1吉林大學(xué) 化學(xué)學(xué)院，長(zhǎng)春130012；2大連大學(xué) 人才建設(shè)辦公室，大連116622；3大連大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，大連116622；4大連大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，大連116622）

1 前言

冬蟲夏草是中國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥，為麥角菌科真菌冬蟲夏草（CordycepssinensisSace），寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座及幼蟲尸體的復(fù)合體。因其價(jià)格昂貴，目前市場(chǎng)上常有偽品亞香棒蟲草出現(xiàn)，其來(lái)源為麥角科真菌霍克斯蟲草（CordycepshawkesiiGray），寄生在鱗翅目昆蟲幼蟲的子囊菌，由蟲體和頭部長(zhǎng)出的子座組成。真品冬蟲夏草含有核苷、多糖、甾醇、氨基酸等多種活性成分，傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為具有補(bǔ)肺益腎、止血化痰等功效。除此之外還具有調(diào)節(jié)免疫力、抗腫瘤、降血糖、抗氧化等多種藥理作用［1－2］。核苷類物質(zhì)（腺苷、尿苷、鳥苷）為冬蟲夏草有效成分之一，尤以腺苷具有明顯的藥理作用，2005年版《中國(guó)藥典》［3］將其作為指標(biāo)成分應(yīng)用于冬蟲夏草的質(zhì)量控制中。

近年來(lái)，市場(chǎng)上隨著冬蟲夏草類保健品數(shù)量的增多，其有效成分分離、測(cè)定的研究也變得十分活躍。有報(bào)道水溶性核苷類成分主要集中在子座部分，蟲體含量甚低，并且從子座的水浸液分離得到微量的次黃嘌呤、鳥嘌呤、腺嘌呤和核苷［4］。有人從西藏產(chǎn)冬蟲夏草中分離得到了尿嘧啶、腺嘌呤和腺嘌呤核苷［5］。劉靜明等從我國(guó)長(zhǎng)春蛹冬蟲夏草菌絲中分離得到腺苷、腺嘌呤和冬蟲夏草素，其中腺嘌呤和冬蟲夏草素首次從菌絲體中分離得到［6］。陳玉婷等用RP－HPLC法測(cè)定了子座（即幼蟲子座）、蟲體（即幼蟲尸體）和全草（即幼蟲子座和幼蟲）中腺嘌呤核苷的含量［7］。郭懷忠等用整體毛細(xì)管電泳柱測(cè)定了冬蟲夏草中胞苷與腺苷的含量［8］。由于這些方法涉及儀器昂貴而且操作復(fù)雜、測(cè)試成本高，為此采用多壁碳納米管修飾電極［9－11］，依據(jù)循環(huán)伏安法技術(shù)測(cè)定冬蟲夏草膠囊中腺嘌呤核苷的含量。研究結(jié)果與色譜方法相比，不僅靈敏度高、簡(jiǎn)單、快速、重現(xiàn)性好、干擾小，而且節(jié)能、環(huán)保，無(wú)污染物排放。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

ZF－4電位掃描信號(hào)發(fā)生器、ZF－10B數(shù)據(jù)采集存儲(chǔ)器、ZF－9恒電位或恒電流儀均購(gòu)自上海正方電子電器有限公司，AS230型數(shù)控超聲波清洗器（奧特寶恩斯儀器公司），AL204型電子天平（上海梅特勒－托利多儀器有限公司），PH2C型精密酸度計(jì)（上海雷磁儀器廠），金電極和飽和甘汞電極購(gòu)自上海辰華儀器公司，鉑絲電極。

多壁碳納米管（MWNT）購(gòu)自中科院成都有機(jī)所，N，N－二甲基甲酰胺（DMF）和腺苷均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，冬蟲夏草膠囊購(gòu)自天津天獅生物制品有限公司，磷酸鹽緩沖溶液（PBS），其他試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

2.2 MWNT的純化與功能化

將MWNT在濃鹽酸中超聲7.5h進(jìn)行純化，純化后的MWNT加濃硝酸在140℃下回流8h，用二次蒸餾水洗至中性，100℃烘干研成粉末，備用。

2.3 MWNT／Au修飾電極的制備

稱取2.2中所得功能化的MWNT粉末2.0mg超聲分散于10mL DMF中，形成黑色懸濁液備用。把金電極先用0.05μm Al2O3拋光粉拋光成鏡面，然后依次在蒸餾水、硝酸（1＋1）水溶液、無(wú)水乙醇、蒸餾水中分別超聲3min，用微量進(jìn)樣器取定量的懸濁液滴加在金電極表面，紅外燈下烘干，得MWNT／Au修飾電極。實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)懸濁液的濃度從0.2mg／mL增加到1.0mg／mL時(shí)峰電流顯著增大，當(dāng)由1.0mg／mL增加到2.5mg／mL時(shí)，峰電流逐漸降低，這是由于富集物厚度過(guò)大，阻礙了腺苷與電板的電子交換，因此MWNT用量以2.5mg／mL為最佳。

2.4 實(shí)驗(yàn)方法

在（25±2）℃下，采用三電極體系：以MWNT／Au修飾電極為工作電極，鉑絲電極為輔助電極，飽和甘汞電極為參比電極。以循環(huán)伏安法研究了腺苷在不同條件下 MWNT／Au電極上的化學(xué)行為，用循環(huán)伏安法研究了峰電流與腺苷濃度的線性關(guān)系及最低檢出限，并用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定了腺苷樣品含量。

3 結(jié)果與討論

3.1 電極修飾前后對(duì)比

圖1中曲線A、B分別是裸Au電極和MWNT／Au電極在pH值為7.0的PBS底液中腺苷濃度為50nmol／L時(shí)的循環(huán)伏安（CV）圖，由CV圖可以看出，A圖出現(xiàn)了兩個(gè)波峰，無(wú)法定量分析，B圖有良好波形。

3.2 掃描速率的影響

腺苷（50nmol／L）在pH 值為7.0的PBS底液中進(jìn)行CV測(cè)定。掃描速率從5mV／s開始依次增加至200mV／s時(shí)，峰電流增加，還原峰電位負(fù)移。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在掃描速率為100mV／s時(shí)，有良好的還原峰，結(jié)果見圖2。

圖1 腺苷（50nmol／L）在裸金電極和碳納米管修飾金電極上的循環(huán)伏安圖Figure 1. Cyclic voltammograms of 50nmol／L adenosine recorded using a bare gold electrode and a MWNT modified gold electrode.

圖2 不同掃描速率時(shí)腺苷的循環(huán)伏安圖Figure 2. Cyclic voltammograms of adenine at different scanning rates.

3.3 底液的選擇

按如前所述的電化學(xué)方法，在磷酸、醋酸鈉－醋酸和PBS等不同種底液條件下分別對(duì)腺嘌呤核苷的電極氧化還原過(guò)程進(jìn)行了對(duì)比實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有腺苷在PBS緩沖溶液中出現(xiàn)良好的還原峰，結(jié)果見圖3。

3.4 碳納米管修飾液濃度的選擇

分別對(duì)比實(shí)驗(yàn)了在修飾液濃度為：0.5，1.0，1.5，2.0和2.5mg／mL 時(shí)腺嘌呤核苷的電化學(xué)響應(yīng)狀態(tài)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在金電極上修飾不同濃度的多壁碳納米管時(shí)，出現(xiàn)了不同形狀的還原峰，當(dāng)碳納米管的濃度為1mg／mL時(shí)，其峰電流最大而且峰型最佳、重現(xiàn)性也最好。

3.5 底液pH值對(duì)極化電流的影響

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，腺嘌呤核苷在底液PBS為不同的pH值情況下會(huì)出現(xiàn)不同形狀的還原峰。當(dāng)PBS的pH值為7.0時(shí)，其峰型和極化電流值最佳，結(jié)果見圖4。

圖3 腺嘌呤核苷在不同底液中的循環(huán)伏安圖Figure 3. Cyclic voltammograms of adenine in different buffer solutions.

圖4 不同酸度底液的循環(huán)伏安圖Figure 4. Cyclic voltammograms of adenine in the buffer solutions at different pHs.

3.6 線性范圍、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，分別依次檢測(cè)濃度為1.0×10－1，1.0×10－2，1×10－3，1.0×10－4，1.0×10－5，1.0×10－6，1.0×10－7，1.0×10－8和 1.0×10－9mol／L腺嘌呤核苷的極化電流。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，腺嘌呤核苷的最高氧化峰電流與其濃度在1.0×10－1～1.0×10－8mol／L的范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，線性方程：I（mA）＝0.0431－0.0046C（mol／L），相關(guān)系數(shù)R2＝0.9947。

將該修飾電極室溫下保存14d，其氧化峰電流基本不變。對(duì)于1.0×10－4mol／L的腺嘌呤核苷溶液，連續(xù)平行測(cè)定5次的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.8%，檢出限為1.0×10－6mol／L。

3.7 樣品含量的測(cè)定

按上述優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件取5個(gè)不同批次樣品進(jìn)行平行測(cè)定，所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果處理見表1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所測(cè)5個(gè)批次樣品的平均回收率為101.5%，RSD為1.5%。該產(chǎn)品標(biāo)示含量與所測(cè)結(jié)果基本相符，可以認(rèn)為所測(cè)定樣品質(zhì)量合格。

表1 冬蟲夏草膠囊中腺嘌呤核苷含量的測(cè)定結(jié)果Table 1 The determination results of adenine contents in Cordyceps sinensis capsules

4 結(jié)論

用滴涂法制備了一種多壁碳納米管修飾金電極并研究了腺嘌呤核苷在修飾電極上的電化學(xué)行為。研究結(jié)果表明，以1mg／mL的碳納米管修飾金電極為工作電極、鉑片電極為對(duì)電極、飽和甘汞電極為參比電極，在pH為7.0的PBS底液中，當(dāng)掃描速率為100mV／s時(shí)腺嘌呤核苷的極化電流較高并且峰形最佳，適合定量分析。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)得其極化電流與腺嘌呤核苷濃度在1.0×10－4～1.0×10－8mol／L 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系 （R2＝0.9947），檢出限為1.0×10－9mol／L。所測(cè)的5批樣品的平均回收率為101.5%，RSD為1.5%。與同類方法相比，該方法具有靈敏度高、簡(jiǎn)單、快速、重現(xiàn)性好，干擾小等特點(diǎn)。實(shí)際樣品的對(duì)照分析結(jié)果令人滿意。

［1］李紹平，李萍，季暉，等.天然與發(fā)酵培養(yǎng)冬蟲夏草中核苷類成分的含量及其變化［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2001，36（6）：436－439.

［2］李紹平，季暉，李萍，等.冬蟲夏草抗腫瘤作用研究進(jìn)展［J］.中草藥，2001（4）：373－375.

［3］國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典：一部［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

［4］徐文豪，薛智，馬建民.冬蟲夏草的水溶性成分－核苷類化合物的研究［J］.中藥通報(bào)，1988，13（4）：34－36.

［5］呂瑞綿，楊永春，岳德超，等.蟲草菌1號(hào)深層培養(yǎng)產(chǎn)物的化學(xué)成分［J］.微生物學(xué)通報(bào)，1981，16（9）：166－168.

［6］劉靜明，鐘裕容，楊智，等.蛹蟲草化學(xué)成分研究［J］.中國(guó)中藥雜志，1989，14（10）：32－35.

［7］陳玉婷，朱曼萍，王丹紅，等.HPLC測(cè)定冬蟲夏草不同藥用部位腺苷的含量［J］.中國(guó)中藥雜志，2007，9（5）：857－858.

［8］郭懷忠，畢開順，孫毓慶.毛細(xì)管電色譜及其在藥物分析中的應(yīng)用［J］.藥物分析雜志，2005，25（6）：735－741.

［9］侯曉蘭，申貴雋，孟梁，等.多巴胺和抗壞血酸在十六烷基三甲基溴化銨／碳納米管電極上的檢測(cè)［J］.分析試驗(yàn)室，2010（11）：87－90.

［10］Hou Xiaolan，Shen Guijun，Meng Liang，et al.Multiwalled Carbon Nanotubes Modified Glass Carbon Electrode andits Electrocatalytic Activity towards Oxidation of Paracetamol［J］.Russian Journal of Electrochemistry，2011，11（47）：1262－1267.

［11］劉冠山，侯曉蘭，申貴雋 .對(duì)乙酰氨基酚在多壁碳納米管修飾電極上的電化學(xué)行為［J］.分析科學(xué)學(xué)報(bào)，2010（6）：681－684.