李詩草，李宏名，楊 紅，馬玉潔，蒲 剛（中國醫(yī)藥集團(tuán)四川抗菌素工業(yè)研究所，成都 610051）

氫可酮為半合成的麻醉、鎮(zhèn)痛和鎮(zhèn)咳藥物，臨床應(yīng)用的上市品均為氫可酮的復(fù)方制劑，如氨酚氫可酮片、復(fù)方重酒石酸氫可酮/布洛芬片等。目前，重酒石酸氫可酮尚未載入《中國藥典》2010年版，《美國藥典》（USP）及《歐洲藥典》（EP）均有本品收載，但現(xiàn)行版USP 32[1]本品項下無有關(guān)物質(zhì)檢查，而現(xiàn)行版EP 6.0[2]本品標(biāo)準(zhǔn)中列入了有關(guān)物質(zhì)檢查項，方法為梯度洗脫反相高效液相色譜（RP-HPLC）法。本研究依據(jù)EP 6.0的有關(guān)物質(zhì)檢查方法，再結(jié)合實際生產(chǎn)工藝路線和產(chǎn)品有關(guān)物質(zhì)檢查結(jié)果，建立了有效可控的檢查重酒石酸氫可酮中有關(guān)物質(zhì)的方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1200型HPLC儀（美國Agilent公司）；HPLC系統(tǒng)，包括LC-20 AB泵、SPD-20 A檢測器、SIL-20 AC自動進(jìn)樣器、LC solution色譜工作站（日本Shimadzu公司）；XS205型十萬分之一分析天平（瑞士Mettler公司）；PHS-3 C型酸度計（天津大學(xué)精密儀器廠）。

1.2 試藥

重酒石酸氫可酮原料藥（四川抗菌素工業(yè)研究所與國藥集團(tuán)工業(yè)有限公司廊坊分公司共同制備，批號：070601、070602、070603，純度：98.8%、99.6%、98.9%）；雜質(zhì)A嗎啡對照品（批號：171201-200822，純度：99.8%）、雜質(zhì)B酒石酸雙氫可待因?qū)φ掌罚ㄅ枺?71252-200401，純度：100.0%）、雜質(zhì)I蒂巴因?qū)φ掌罚ㄅ枺?71216-200403，純度：100.0%）均來自中國食品藥品檢定研究院；雜質(zhì)C磷酸可待因?qū)φ掌罚▏幖瘓F(tuán)工業(yè)有限公司廊坊分公司，批號：LK100303，純度：99.4%）；雜質(zhì)D鹽酸羥考酮對照品（北京華素制藥股份有限公司，批號：0908261，純度：99.3%）；雜質(zhì)E可待因酮對照品（德國LGC Gmbh公司，批號：04.02.09.19，純度：99.0%，供實驗室使用）；雜質(zhì)F甲基可待因?qū)φ掌罚W洲藥品質(zhì)量管理局，批號：3.1，純度：99.0%，供實驗室使用）；雜質(zhì)H二苯甲酮對照品（天津市博迪化工有限公司，化學(xué)純）；重酒石酸氫可酮對照品（四川抗菌素工業(yè)研究所，批號：021201，純度：99.5%）；酒石酸（L（+），天津開發(fā)區(qū)海光化學(xué)制藥廠，批號：031102，純度：＞99.5%）；乙腈為色譜純，水為自制純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-2（150 mm× 4.6 mm，5μm）；流動相：A為辛烷磺酸鈉1.08 g，加水約950 mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH值2.0，加水稀釋至1000mL，B為乙腈，梯度洗脫，流速：1.5mL·min－1；檢測波長：283 nm；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：10μL。梯度洗脫程序見表1。

表1 HPLC梯度洗脫程序Tab 1 HPLC gradient elution procedure

2.2 溶液制備

取本品適量，加流動相A溶解并稀釋制成10.0 mg·mL－1的溶液，作為供試品溶液。分別取重酒石酸氫可酮對照品和鹽酸羥考酮對照品（雜質(zhì)D）約5 mg，置于5 mL量瓶中，加流動相A溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為系統(tǒng)適用性試驗溶液（a）。精密量取1 mL供試品溶液，置于100 mL量瓶中，加流動相A稀釋至刻度，搖勻，再精密量取1 mL，置于10 mL量瓶中，用流動相A稀釋至刻度，作為對照溶液（b）。取二苯甲酮對照品（雜質(zhì)H）約20 mg，置于50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，精密量取1 mL，置于20 mL量瓶中，加流動相A稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液（c）。取各有關(guān)物質(zhì)對照品A、B、C、D、E、F、H、I與重酒石酸氫可酮對照品制成濃度分別約為0.2 mg·mL－1的混合溶液，作為對照溶液（d）。取酒石酸適量，用流動相A溶解并稀釋制成每1 mL中含3.0 mg的溶液，作為空白溶液。

2.3 有關(guān)物質(zhì)測定

取系統(tǒng)適用性試驗溶液（a）10μL進(jìn)樣，記錄色譜圖，羥考酮與氫可酮色譜峰之間的分離度應(yīng)大于3.0。取對照溶液（d）10μL進(jìn)樣，記錄色譜圖，各有關(guān)物質(zhì)與氫可酮的相對保留時間為：嗎啡（雜質(zhì)A，0.32）、雙氫可待因（雜質(zhì)B，0.57）、可待因（雜質(zhì)C，0.61）、羥考酮（雜質(zhì)D，0.84）、可待因酮（雜質(zhì)E，1.1）、甲基可待因（雜質(zhì)F，1.5）、二苯甲酮（雜質(zhì)H，3.1）、蒂巴因（雜質(zhì)I，2.1）。

取對照溶液（b）10μL進(jìn)樣，調(diào)節(jié)檢測靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約為滿量程的10%，精密量取供試品溶液與對照溶液（b）、（c）和空白溶液各10μL，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。供試品溶液的色譜圖中，除與空白溶液相同位置的色譜峰外，如有與雜質(zhì)相對保留時間一致的色譜峰，雜質(zhì)A、B、C、D、E、F、H、I的峰面積不得大于對照溶液（b）中氫可酮峰面積的2倍（0.2%），雜質(zhì)I峰面積乘以0.2的校正因子后其值不得大于對照溶液（b）中氫可酮的峰面積（0.1%），雜質(zhì)H的峰面積不得大于對照溶液（c）中二苯甲酮峰面積的0.5倍（0.1%），單個未知雜質(zhì)的峰面積不得大于對照溶液（b）中氫可酮的峰面積（0.1%），各雜質(zhì)峰面積和不得大于對照溶液（b）中氫可酮峰面積的10倍（1%），供試品溶液中任何小于對照溶液（b）中氫可酮峰面積0.5倍以下的雜質(zhì)小峰可忽略不計（0.05%）。

2.4 專屬性試驗

2.4.1 本品與有關(guān)物質(zhì)的分離。照“2.2”、“2.3”項下方法試驗，氫可酮與8個有關(guān)物質(zhì)混合分離的情況見圖1。

圖1 分離試驗高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms of separation tests

圖1 結(jié)果表明，氫可酮與羥考酮分離度為3.25，符合EP要求分離度不得小于3的規(guī)定，8個有關(guān)物質(zhì)與氫可酮完全分離，各雜質(zhì)峰的相對保留時間與EP方法基本一致。

2.4.2 破壞性試驗。（1）酸破壞。取本品（批號：070601）20 mg置于10 mL量瓶中，加1 mol·L－1鹽酸溶液2 mL，于熱水浴中加熱5 h，冷卻后，用1 mol·L－1氫氧化鈉中和，用流動相A稀釋至刻度，搖勻。（2）堿破壞。取本品（批號：070601）20 mg置于10 mL量瓶中，加1 mol·L－1氫氧化鈉溶液2 mL，于熱水浴中加熱5 h，冷卻后，用1 mol·L－1鹽酸中和，用流動相A稀釋至刻度，搖勻。（3）氧化破壞。取本品（批號：070601）20 mg置于10 mL量瓶中，加3%過氧化氫溶液12mL，室溫26℃放置5h。（4）光照破壞。取經(jīng)4500 lx強(qiáng)光連續(xù)10 d照射后的樣品（批號：070601）適量，用流動相A溶解并稀釋制成每1mL中含2.0mg的溶液。（5）高溫破壞。取本品（批號：070601）經(jīng)120℃烘烤3 h處理后，呈熔融狀，取適量，用流動相A制成約10 mg·mL－1溶液。

分別精密量取上述溶液10 μL進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果重酒石酸氫可酮經(jīng)各種條件破壞，產(chǎn)生的雜質(zhì)峰與主成分峰均能有效分離，表明方法的專屬性強(qiáng)，詳見圖2。

圖2 專屬性試驗高效液相色譜圖Fig 2 HPLC chromatograms for the specificity tests

2.5 線性關(guān)系試驗

取重酒石酸氫可酮適量，精密稱定，用流動相A溶解并稀釋成1.02、5.10、10.20、15.31、20.41μg·mL－1的系列溶液，進(jìn)樣分析。以氫可酮峰面積（y）對濃度（x）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程y＝1.2208 x+0.0523（r＝0.9997），結(jié)果表明，氫可酮檢測濃度線性范圍為1.02～20.41μg·mL－1。

取雜質(zhì)I（蒂巴因）適量，精密稱定，用流動相A溶解并稀釋成0.51、1.02、5.08、10.17、15.25、20.34μg·mL－1的系列溶液，進(jìn)樣分析，同樣得回歸方程y＝12.546 x－0.6004（r＝0.9999），結(jié)果表明，蒂巴因檢測濃度線性范圍為0.51～20.34μg·mL－1。

取雜質(zhì)H（二苯甲酮）適量，精密稱定，制備成0.10、0.50、1.00、5.00、10.00、20.00、30.00、40.00μg·mL－1的系列溶液，進(jìn)樣分析，同樣得回歸方程y＝10.151 x+3.577（r＝1.0000），結(jié)果表明，二苯甲酮檢測濃度線性范圍為0.10～40.00μg·mL－1。

2.6 檢測限和定量限試驗

分別將氫可酮、蒂巴因、二苯甲酮的對照品溶液逐步稀釋后進(jìn)行測定，信噪比按3∶1計，得氫可酮、蒂巴因、二苯甲酮檢測限分別為0.05、0.005、0.005μg；信噪比按10∶1計，三者定量限分別為0.15、0.015、0.015μg。

2.7 對照溶液進(jìn)樣精密度試驗

分別精密量取“2.2”項下的對照溶液（b）和對照溶液（c）連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，結(jié)果，氫可酮和二苯甲酮對照溶液峰面積的RSD分別為0.097%和1.54%，表明進(jìn)樣精密度良好。

2.8 中間精密度試驗

照“2.3”項下有關(guān)物質(zhì)測定方法，對同一樣品（批號：070601）在不同日期、不同儀器、不同操作人員進(jìn)行中間精密度試驗，結(jié)果，樣品中總雜質(zhì)平均含量為0.02%，RSD為4.0%。由于雜質(zhì)含量很低，所以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差較大，但檢查方法的精密度完全能滿足本品有關(guān)物質(zhì)限度檢查的要求。

2.9 雜質(zhì)漏檢與色譜峰純度的考察

為測定主峰純度因子，對樣品及A、B、C、D、I、H雜質(zhì)混合溶液在190～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行二極管陣列紫外掃描檢測。結(jié)果，主成分與有關(guān)物質(zhì)在190～330 nm波長范圍都有相似的紫外吸收譜，且末端吸收較大，在283 nm波長處都有特征吸收峰；在283 nm波長測定峰純度數(shù)據(jù)顯示，樣品測定中氫可酮保留時間為13.045min（批號：070601）的主峰純度因子為999.668（大于980），表明主峰為單峰，可推測方法基本無雜質(zhì)漏檢。

2.10 耐用性試驗

選用6種不同品牌不同長度的C18色譜柱，照有關(guān)物質(zhì)檢查方法進(jìn)行測定。結(jié)果表明，使用不同品牌及規(guī)格的色譜柱進(jìn)行分析時，其分離效果、檢出雜質(zhì)峰個數(shù)及有關(guān)物質(zhì)檢查結(jié)果均吻合，說明所建方法耐用性較好。

2.11 樣品的有關(guān)物質(zhì)檢查結(jié)果

2.11.1 HPLC法。將生產(chǎn)規(guī)模長期留樣考察4年的3批穩(wěn)定性樣品，按“2.3”項下方法進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)檢查，結(jié)果3批樣品中單個雜質(zhì)均為0.01%，總雜質(zhì)最高的為0.03%。樣品中未檢出已知雜質(zhì)峰，未知雜質(zhì)含量很低，樣品符合EP雜質(zhì)限度規(guī)定，也說明樣品穩(wěn)定性較好。

2.11.2 薄層色譜（TLC）法。將生產(chǎn)規(guī)模室溫留樣的3批穩(wěn)定性考察樣品，照《中國藥典》TLC法（附錄ⅤB）[3]（本品臨床標(biāo)準(zhǔn)的有關(guān)物質(zhì)檢查法）進(jìn)行檢查，結(jié)果，3批樣品均無雜質(zhì)斑點。

3 討論

3.1 關(guān)于線性考察化合物的確定

由于在EP中，雜質(zhì)H是用雜質(zhì)對照品的外標(biāo)法規(guī)定其限度，雜質(zhì)I是用加校正因子的主成分自身對照法規(guī)定其限度，其他雜質(zhì)均用不加校正因子的主成分自身對照法限制含量，故本試驗只選取了重酒石酸氫可酮、雜質(zhì)H和雜質(zhì)I進(jìn)行線性考察。

3.2 有關(guān)物質(zhì)檢查方法選擇及雜質(zhì)限度確定依據(jù)

由于HPLC方法有明顯的優(yōu)點，所以建議在重酒石酸氫可酮生產(chǎn)申報質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，將TLC有關(guān)物質(zhì)檢查方法改為RPHPLC梯度洗脫方法，并根據(jù)樣品有關(guān)物質(zhì)檢查的實際結(jié)果，即在已知雜質(zhì)的相應(yīng)保留時間處未檢出有雜質(zhì)峰，而檢出的未知雜質(zhì)含量很低，單個雜質(zhì)及總雜質(zhì)完全符合EP雜質(zhì)限度規(guī)定，因此在標(biāo)準(zhǔn)中制訂了控制這些已知雜質(zhì)的限度（與EP限度一致），使該標(biāo)準(zhǔn)能有效控制產(chǎn)品質(zhì)量。

3.3 色譜柱的選擇

通過耐用性試驗，結(jié)果顯示規(guī)格為250 mm×4.6 mm、粒度為5μm的色譜柱分離的主峰保留時間較長，2個主峰的分離度較高；而規(guī)格為150 mm×4.6 mm、粒度為5μm的色譜柱分離的主峰保留時間較短，當(dāng)調(diào)整流速為1.2 mL·min－1時，短柱分離保留時間較適宜，與EP主峰保留時間和各雜質(zhì)的相對保留時間基本一致。因此，在使用不同品牌及規(guī)格的色譜柱進(jìn)行分析時，僅對流速稍加調(diào)整就能達(dá)基本一致的分離效果。

3.4 檢測波長選擇

選擇在283、240、230、220nm不同波長處對樣品（批號：070601）和空白溶液進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果顯示雖然在低波長處雜質(zhì)檢查靈敏度較高，但溶劑峰干擾較大，加之樣品雜質(zhì)含量極少，所以選低波長對雜質(zhì)含量的準(zhǔn)確測定影響較大。又因在氫可酮特征吸收的高波長283 nm處檢出的有關(guān)物質(zhì)峰個數(shù)與其他低波長處相同，且已知雜質(zhì)也在283 nm波長處有相同的特征吸收，而該波長測定能排除溶劑峰干擾，因此選擇283 nm波長作為檢測波長。

3.5 酒石酸空白溶劑峰的扣除

試驗發(fā)現(xiàn)酒石酸空白溶液與樣品中1.38 min處出現(xiàn)的小峰基本一致，所以雜質(zhì)含量計算需扣除酒石酸空白溶液峰。以有關(guān)物質(zhì)檢查方法供試品溶液濃度為10.0 mg·mL－1時，按分子式中酒石酸與氫可酮比例為1∶1，推算相當(dāng)?shù)木剖峥瞻兹軇┲苽錆舛仁?.0 mg·mL－1（以流動相A制備）。

本法與EP法相比，色譜條件基本相同，流速稍有差別，色譜柱長度不同。對于檢查方法中的各雜質(zhì)保留時間定位，EP方法中沒有雜質(zhì)溶液的制備方法，筆者規(guī)定制備成各雜質(zhì)混合溶液，一次進(jìn)樣定位，使方法省時、簡便。另對照溶液的制備方法也不同，在不影響雜質(zhì)檢查結(jié)果準(zhǔn)確的前提下，筆者將雜質(zhì)對照品取樣量減少一半制備溶液，從而降低了購買昂貴雜質(zhì)對照品的成本。本文還比較了TLC法與HPLC 2種有關(guān)物質(zhì)檢查的結(jié)果，結(jié)果表明HPLC法比TLC法專屬性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好。因此，RP-HPLC梯度洗脫方法更適宜于重酒石酸氫可酮有關(guān)物質(zhì)的檢查。

[1]The United States Pharmacopoeial Convention.USP32-NF27[S].Rockville：the United States Pharmacopoeial Convention，2009：2568.

[2]European Directorate for the Quality of Medicines.European Pharmacopeia 6.0（Vol 2）[S].Strasbourg：European Directorate for the Quality of Medicines，2008：2087-2093.

[3]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄27.