韓道財(cái)，洪鵬志，*，楊萍

（1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東 湛江 524025；2.廣東省高等學(xué)校水產(chǎn)品深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524025）

均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化羅非魚(yú)肉富肽酶解液制備工藝

韓道財(cái)1，2，洪鵬志1，2，*，楊萍1，2

（1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東 湛江 524025；2.廣東省高等學(xué)校水產(chǎn)品深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524025）

為得到高肽含量羅非魚(yú)肉酶解液，以水解度及肽含量為指標(biāo)，從胃蛋白酶、胰蛋白酶、Alcalase 2.4L、中性蛋白酶及木瓜蛋白酶中篩選出中性蛋白酶為最適用酶。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化中性蛋白酶酶解條件。得到最高肽含量酶解條件為：加酶量1.38%，料液比1∶3（g/mL），溫度50℃，自然pH，時(shí)間7 h，此時(shí)肽含量（以每克魚(yú)肉計(jì)）為（37.71±0.11）mg。

羅非魚(yú)；酶解；均勻設(shè)計(jì)；肽含量；水解度

羅非魚(yú)原產(chǎn)非洲，又名非洲鯽魚(yú)，屬鱸形目、麗魚(yú)科、羅非魚(yú)屬。羅非魚(yú)食性雜，繁殖能力強(qiáng)，味道鮮美，是聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織向世界推薦的優(yōu)良養(yǎng)殖魚(yú)類之一[1]。我國(guó)是羅非魚(yú)養(yǎng)殖大國(guó)，2010年產(chǎn)量約為120萬(wàn)t[2]，廣東省產(chǎn)量約占全國(guó)的1/2。目前，羅非魚(yú)加工產(chǎn)品主要是凍羅非魚(yú)片[3]，技術(shù)含量不高、附加值低。酶解魚(yú)蛋白可以得到生物活性肽[4-6]及具有優(yōu)良吸收性的小肽[7]，羅非魚(yú)肉酶解液具有抗氧化[8-9]、降血壓[10-11]等生物活性。有研究者[12-13]以肽含量為指標(biāo)對(duì)酶解羅非魚(yú)肉進(jìn)行了研究，均以三氯乙酸-雙縮脲法測(cè)肽含量。本實(shí)驗(yàn)采用超濾-雙縮脲法測(cè)定肽含量，以肽含量為主要指標(biāo)，優(yōu)化酶解羅非魚(yú)肉制備高肽含量酶解液的工藝參數(shù)，以期為羅非魚(yú)肉高值化加工與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

羅非魚(yú)：廣東湛江霞山水產(chǎn)品市場(chǎng)，將羅非魚(yú)去頭、去鱗、去鰭、去內(nèi)臟，洗凈，于采肉機(jī)中采肉后-18℃凍藏；胃蛋白酶、胰蛋白酶、Alcalase2.4L：Sigma公司；中性蛋白酶、木瓜蛋白酶：南寧龐博生物有限公司；均為食品級(jí)。

水浴恒溫振蕩器：江蘇金壇市佳美儀器有限公司；電子分析天平：日本島津公司；CR22GⅡ高速冷凍離心機(jī)：日本日立公司；UV-8000紫外分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；pHS-3C型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)：上海偉業(yè)儀器廠；5K MWCO超濾離心管：上海摩速科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 酶解

在水浴恒溫振蕩器中酶解，酶解完成后沸水浴滅酶10 min，8000 r/min、4℃離心20 min得到上清液即為酶解液。

1.2.2 蛋白酶活力的測(cè)定

蛋白酶活力的測(cè)定采用福林法[14]。

1.2.3 水解度的測(cè)定

電位滴定法[15]測(cè)α-氨態(tài)氮含量。魚(yú)肉總氮含量的測(cè)定采用半微量凱氏定氮法[16]。

1.2.4 肽含量的測(cè)定

用截留限為5K的超濾離心管對(duì)酶解液進(jìn)行超濾，雙縮脲法測(cè)定超濾透過(guò)液肽含量。采用胰島素做標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：y=0.0532x-0.0278（R2=0.9999）。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶的篩選

酶的篩選，見(jiàn)表1。

表 1 蛋白酶的酶解條件Table 1 Experimental conditions of proteases

選擇5種蛋白酶在相同酶活力單位添加量及各自的適宜條件下（表1）酶解2 h，測(cè)得水解度及肽含量如圖1所示。

由圖1可知，水解度由高到低依次為中性蛋白酶>胰蛋白酶>Alcalase2.4L>木瓜蛋白酶>胃蛋白酶。肽含量由高到低依次為木瓜蛋白酶>中性蛋白酶>Alcalase2.4L>胰蛋白酶>胃蛋白酶。中性蛋白酶酶解液肽含量?jī)H次于木瓜蛋白酶，水解度最高且價(jià)格較低，綜合考慮，選擇中性蛋白酶為最適用酶。

2.2 中性蛋白酶酶解條件的單因素試驗(yàn)

中性蛋白酶一般在pH6～7穩(wěn)定，而且實(shí)際生產(chǎn)中調(diào)節(jié)pH難以操作，所以單因素試驗(yàn)中只考慮加酶量、料液比、溫度和時(shí)間單因素對(duì)水解度及肽含量的影響。

2.2.1 加酶量的影響

在料液比1∶1（g/mL），溫度50 ℃，自然pH條件下酶解2 h，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，水解度隨加酶量的增加而增加。當(dāng)加酶量由0.4%升到0.8%時(shí)，肽含量逐漸增加，加酶量在0.8%到1.2%之間時(shí)，肽含量變化不大。這說(shuō)明在其它條件一定的情況下，在一定范圍內(nèi)肽含量隨酶濃度的增加而增加，超過(guò)一定范圍時(shí)肽含量則不再增加，這或許是因?yàn)樵诘孜锏牧恳欢〞r(shí)，過(guò)多的酶也不能增加肽含量的緣故。

2.2.2 料液比的影響

在加酶量1.0%，溫度50℃，自然pH條件下酶解2 h，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，水解度隨料液比的增加而增加。當(dāng)料液比為1∶1.5（g/mL）時(shí)，肽含量最高。料液比的增加意味著底物濃度與酶濃度的同時(shí)降低，在一定范圍內(nèi)，肽含量會(huì)隨料液比的增加而增加，超過(guò)一定范圍，肽含量則會(huì)隨料液比的增加而不斷下降。

2.2.3 溫度的影響

在加酶量1.0%，料液比1∶1.5（g/mL），自然pH條件下酶解2 h，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，溫度為45℃時(shí)水解度最高，溫度為50℃和55℃時(shí)，肽含量最高且無(wú)顯著差異（p＞0.05）。溫度因素對(duì)酶解過(guò)程的影響包括對(duì)酶活力的影響以及對(duì)底物的影響2個(gè)方面。對(duì)酶活力的影響方面，當(dāng)溫度為最適溫度時(shí)，酶活性最高，低于或高于最適溫度，酶活性降低甚至失活。對(duì)底物的影響方面，當(dāng)溫度高于一定值時(shí)，底物魚(yú)蛋白開(kāi)始變性，變性程度隨溫度的變化而變化。不同的變性程度意味著蛋白暴露位點(diǎn)的不同，同時(shí)酶解效果也不同。

2.2.4 時(shí)間的影響

在加酶量1.0%，料液比1∶1.5（g/mL），溫度50 ℃，自然pH條件下進(jìn)行酶解，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，水解度隨時(shí)間的增加而增加，3 h之后增速減緩，這可能是由于底物濃度降低及酶活力下降共同造成的。1 h～2 h時(shí)肽含量增加較多，2、3、5 h相差不大，5 h到7 h下降較多。說(shuō)明酶解初始階段大分子降解為小分子肽的速度大于游離氨基酸的生成速度，酶解末尾階段則相反。

2.3 均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化酶解條件

單因素試驗(yàn)顯示，中性蛋白酶的熱穩(wěn)定性較差，因此在溫度50℃，自然pH條件下采用U10（108）均勻設(shè)計(jì)表[17]擬水平法進(jìn)行加酶量、料液比、時(shí)間3因素5水平試驗(yàn)，試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

表 2 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experiment program and results of uniform design

利用JMP 7軟件對(duì)均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程如下：

回歸方程及系數(shù)的顯著性分析結(jié)果如表3所示。

表 3 回歸方程及系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 3 Significance test of regression equations and its

由回歸方程顯著性可知，兩方程均顯著。由回歸系數(shù)顯著性可知，對(duì)水解度高低的影響由大到小依次為：時(shí)間>料液比>加酶量，對(duì)肽含量高低的影響由大到小依次為：加酶量>時(shí)間>料液比，兩者并不相同。

水解度預(yù)測(cè)值如圖6所示。

當(dāng)加酶量為1.15%，料液比為1∶3（g/mL），時(shí)間為5.53 h時(shí)，水解度最大，為19.39%。肽含量預(yù)測(cè)值如圖7所示。

當(dāng)加酶量為1.38%，料液比為1∶3（g/mL），時(shí)間為7 h時(shí)，肽含量最高，為37.80 mg（以每克魚(yú)肉計(jì)）。

優(yōu)化條件下分別做3次驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得水解度為（19.18±0.12）%，與預(yù)測(cè)值相差1.1%[此時(shí)肽含量（以每克魚(yú)肉計(jì)）為24.58 mg]，測(cè)得肽含量（以每克魚(yú)肉計(jì)）為（37.71±0.11）mg，與預(yù)測(cè)值相差0.24%（此時(shí)水解度為18.40%），兩方程均預(yù)測(cè)準(zhǔn)確。

3 結(jié)論

以水解度和肽含量為指標(biāo)，對(duì)胃蛋白酶、胰蛋白酶、Alcalase 2.4L、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶進(jìn)行篩選，選出中性蛋白酶為酶解羅非魚(yú)肉蛋白的最適用酶。

對(duì)中性蛋白酶酶解羅非魚(yú)肉的酶解工藝進(jìn)行單因素試驗(yàn)和均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化試驗(yàn)，得到最高水解度酶解條件：加酶量1.15%，料液比1∶3（g/mL），溫度50 ℃，自然pH，時(shí)間5.5 h，最高肽含量酶解條件：加酶量1.38%，料液比1∶3（g/mL），溫度50 ℃，自然pH，時(shí)間7 h。驗(yàn)證試驗(yàn)證明回歸方程可以較好的預(yù)測(cè)試驗(yàn)結(jié)果。

[1]曾紹東，吳建中，歐仕益，等.羅非魚(yú)酶解液中揮發(fā)性成分分析[J].食品科學(xué)，2010，31(18)：342-346

[2]吳郁麗.羅非魚(yú)下腳料酶解液風(fēng)味改善的研究[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2011，32(4)：62-66

[3]段振華，易美華，汪菊蘭，等.羅非魚(yú)碎魚(yú)肉酶解液的脫腥技術(shù)及其機(jī)理探討[J].食品工業(yè)科技，2007，28(2)：65-67

[4]Ali Bougatef,Naima Nedjar-Arroume.Purification and identification of novel antioxidant peptides from enzymatic hydrolysates of sardinelle（Sardinella aurita）by-products proteins[J].Food chemistry,2010,118(3):559-565

[5]Jae-young je,Pyo-jam park.A novel Angiotensin I converting enzyme inhibitory peptide from Alaska Pollack（Theragra chalcogramma）frame protein hydrolysate[J].J Agric Food Chem,2004,52(26):7842-7845

[6]吳繼衛(wèi).富含短肽的海洋蛋白酶解物的制備及功能評(píng)價(jià)[D].山東大學(xué)，2005:39-44

[7]Morato A F，Carreira R L，Junqueira R G，et al.Optimization of casein hydrolysis for obtaining high contents of small peptides:use of subtil is in and trypsin[J].Journal of food composition and analysis,2000,13(5):843-857

[8]Evelien Dekkers,Sivakumar Raghavan,Hordur G Kristinsson,et al.Oxidative stability of mahi mahi red muscle dipped in tilapia protein hydrolysates[J].Food chemistry,2011,124(2):640-645

[9]閻欲曉.羅非魚(yú)活性肽分離及抗氧化能力研究[J].水產(chǎn)科學(xué)，2009，28(5):276-279

[10]Sivakumar Raghavan,Hordur G.Kristinsson.ACE-inhibitory activity of tilapia protein hydrolysates[J].Food chemistry,2009,117(4):582-588

[11]朱志偉，曾慶孝，林奕封，等.采用控制酶解法從羅非魚(yú)肉中制備血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2004，30(12)：71-76

[12]丁利君，黃小梅，何穎基.羅非魚(yú)蛋白制取多肽酶解條件的優(yōu)化[J].食品與機(jī)械，2008，24(2)：15-18

[13]朱志偉，曾慶孝，林奕封.羅非魚(yú)肉的酶法水解控制和復(fù)合研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2002，29(7)：55-58

[14]須鳳高.SB/T 10317-1999蛋白酶活力測(cè)定法[S].北京：國(guó)家國(guó)內(nèi)貿(mào)易局，1999:230-233

[15]寧正祥.食品成分分析手冊(cè)[M].北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，1997：120

[16]衛(wèi)生部食品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗(yàn)所.GB/T 5009.5-2003食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定[S].北京：中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部，2003:35-39

[17]李云雁，胡傳榮.試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)處理[M].2版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2008:235

Preparation of High Peptide Content Hydrolysate from Tilapia by Uniform Design

HAN Dao-cai1，2，HONG Peng－zhi1，2，*，YANG Ping1，2
（1.Food Science and Technology College，Guangdong Dong Ocean University，Zhanjiang 524025，Guangdong，China；2.Key Laboratory of Guangdong Higher Education Institutions for Advanced Processing of Aquatic Product，Zhanjiang 524025，Guangdong，China）

Neutral protease was chosen the best for obtaining high peptide content tilapia flesh hydrolysate from pepsin，trypsin，Alcalase2.4 L，neutral protease and papain，while the degree of hydrolysis and peptide content as the indicators.Based on the results of single－factor experiments，the uniform design experiment had been done to optimize the enzymatic conditions of neutral protease.The optimum conditions for peptide content were that the enzyme quantity 1.38%，the solid－liquid ratio 1∶3（g/mL），the temperature 50 ℃，the inherent pH and the time 7 h.And the peptide content was（37.71±0.11）mg（per gram fish flesh）at the optimum conditions.

tilapia；enzymatic hydrolysis；uniform design；peptide content；degree of hydrolysis

廣東省粵港關(guān)鍵領(lǐng)域重點(diǎn)突破項(xiàng)目（2009A020700004）；廣東省海洋漁業(yè)科技推廣專項(xiàng)項(xiàng)目[A2009002-01（a）]

韓道財(cái)（1988—），男（漢），在讀碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)品高值化加工與利用。

*通信作者

2011-07-05