王志偉

（上海質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院，上海 200233）

不同沙門氏菌及干擾菌的分離鑒定

王志偉

（上海質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院，上海 200233）

使用3種沙門氏菌（豬霍亂沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌）和2種干擾菌（弗氏檸檬酸桿菌和奇異變形桿菌）分別接種分離培養(yǎng)基，觀察生長(zhǎng)和顯色情況。研究沙門氏菌和干擾菌在常規(guī)分離培養(yǎng)基BS、XLD、DHL、HE、BGA和顯色培養(yǎng)基CAS上的形態(tài)特征及生化試驗(yàn)結(jié)果，比較分離鑒別效果。研究發(fā)現(xiàn)甲型副傷寒沙門氏菌具有延遲產(chǎn)H2S特性，弗氏檸檬酸桿菌和奇異變形桿菌均有產(chǎn)H2S現(xiàn)象，顯色培養(yǎng)基CAS的鑒別效果最好，BGA的分離鑒別效果最差。在實(shí)際檢測(cè)工作中，不能以是否產(chǎn)H2S作為鑒定沙門氏菌的唯一依據(jù)，利用顯色培養(yǎng)基可以顯著提高檢測(cè)效率和準(zhǔn)確度。

沙門氏菌；干擾菌；分離培養(yǎng)基；顯色培養(yǎng)基

沙門氏菌是腸桿菌科中一種重要的人畜共患病原菌,不僅能導(dǎo)致雞白痢、雞傷寒、副傷寒、仔豬副傷寒、流產(chǎn)等多種動(dòng)物疾病，而且在世界各地的食物中毒中，沙門氏菌引起的中毒病例占首位或第二位[1]。引起沙門氏菌食物中毒最常見的是鼠傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、腸炎沙門氏菌，同時(shí)也可見于其他血清型的沙門氏菌[2]。根據(jù)國(guó)際慣例,要求對(duì)易受沙門氏菌污染的食品進(jìn)行分類管理,以使大多數(shù)食物不含沙門氏菌,從而有效預(yù)防沙門氏菌病[3]。因此，沙門氏菌檢測(cè)已作為食品安全與質(zhì)量檢測(cè)的重要指標(biāo)。

就沙門氏菌的檢測(cè)方法而言，盡管目前已出現(xiàn)了免疫熒光標(biāo)記法、酶聯(lián)免疫吸附法、核酸探針和以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的PCR法等快速沙門氏菌檢測(cè)技術(shù)，但在患者的治療和流行病學(xué)研究中，使用傳統(tǒng)的檢測(cè)方法分離到病原體是非常重要的，而且常規(guī)檢測(cè)方法仍然是目前國(guó)內(nèi)外所普遍采用的標(biāo)準(zhǔn)方法。常規(guī)沙門氏菌的檢測(cè)方法主要包括預(yù)增菌、選擇性增菌、選擇和鑒別性平板分離培養(yǎng)、生化實(shí)驗(yàn)和血清學(xué)分型鑒定等5個(gè)步驟。其中選擇性平板分離培養(yǎng)和生化實(shí)驗(yàn)又是檢測(cè)過(guò)程中初步分離篩選沙門氏菌的重要環(huán)節(jié)。雖然沙門氏菌具有一些典型的生化反應(yīng)特征，如不發(fā)酵乳糖、產(chǎn)生H2S等，但在實(shí)際的檢測(cè)操作中，往往由于干擾菌的影響和不同沙門氏菌之間存在的差異，進(jìn)而影響了檢驗(yàn)人員的判斷。文中主要對(duì)3種沙門氏菌及2種干擾菌在不同選擇分離平板上的生長(zhǎng)顯色情況及生化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了分析研究。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株來(lái)源

豬霍亂沙門氏菌ATCC14028、鼠傷寒沙門氏菌AS1.1194、甲型副傷寒沙門氏菌CMCC50001、弗氏檸檬酸桿菌AS1.1732、奇異變形桿菌CMCC49005，以上菌株均由上海質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院食化所微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

亞硫酸鉍瓊脂（BS）、膽硫乳瓊脂（DHL）、酚紅煌綠瓊脂（BGA）、HE 瓊脂（HE）、XLD瓊脂（XLD）：均由OXOID公司提供；沙門氏菌顯色培養(yǎng)基（CAS）：由法國(guó)科馬嘉公司（CHROMagar）提供；三糖鐵瓊脂（TSI）、尿素酶瓊脂（URE）、賴氨酸脫羧酶瓊脂（LIA）、蛋白胨水培養(yǎng)基（SAA）和營(yíng)養(yǎng)肉湯（NB）：均由北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司提供。所有培養(yǎng)基和試劑均在有效期內(nèi)使用并通過(guò)了有效性驗(yàn)證。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基制備

沙門氏菌常規(guī)分離培養(yǎng)基、顯色培養(yǎng)基及生化試驗(yàn)所用培養(yǎng)基均按商品說(shuō)明書制備。

1.3.2 研究用標(biāo)準(zhǔn)菌株的復(fù)蘇與接種

從5支標(biāo)準(zhǔn)菌株保藏管中各挑取一環(huán)菌苔，分別接到裝有5 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯的試管中，37℃培養(yǎng)16 h～20 h。將復(fù)蘇后的標(biāo)準(zhǔn)菌株分別劃線接種于沙門氏菌常規(guī)分離培養(yǎng)基和顯色培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)24 h～48 h后觀察結(jié)果。從分離平板上挑取單個(gè)菌落分別接種于三糖鐵瓊脂（TSI）、尿素酶瓊脂（URE）、賴氨酸脫羧酶瓊脂（LIA）、蛋白胨水培養(yǎng)基（SAA）生化管中，37℃培養(yǎng)18 h～24 h后觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 沙門氏菌和干擾菌在6種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)和顯色情況

3種沙門氏菌在24 h～48 h內(nèi)都在6種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，結(jié)果見表1。豬霍亂沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌分別在24 h和48 h觀察結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在不同分離平板上的生長(zhǎng)情況大致相同，在BS、XLD、DHL、HE平板上均有黑色中心菌落產(chǎn)生，說(shuō)明有H2S的產(chǎn)生；而甲型副傷寒沙門氏菌在24 h觀察結(jié)果時(shí)并未有明顯的H2S的產(chǎn)生，菌落不帶黑色中心，但在培養(yǎng)48 h后，菌落產(chǎn)生了明顯的的黑色中心，這說(shuō)明甲型副傷寒沙門氏菌是延遲產(chǎn)H2S的。3種沙門氏菌在CAS顯色平板上均為紫紅色菌落。

表 1 3種沙門氏菌的菌株在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)和顯色情況Table 1 The growth and color of three kinds of Salmonella strains in different media

2種干擾菌在24 h～48 h內(nèi)都在6種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，結(jié)果見表2。

表 2 2種干擾菌在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)和顯色情況Table 2 The growth and color of two kinds of interfering bacteria in different media

弗氏檸檬酸桿菌在DHL分離平板上的形態(tài)特征與沙門氏菌相似，奇異變形桿菌在XLD和HE培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)和沙門氏菌相似。弗氏檸檬酸桿菌在CAS顯色平板上為藍(lán)色菌落，可以和沙門氏菌明顯的區(qū)別開來(lái)。奇異變形桿菌在CAS顯色平板上則被抑制不生長(zhǎng)。兩種干擾菌在BGA平板上均顯示出粉紅色菌落，這與沙門氏菌在BGA平板上的菌落顏色形態(tài)均一致，無(wú)法明顯區(qū)分。因此對(duì)比發(fā)現(xiàn)，顯色培養(yǎng)基CAS的選擇性最強(qiáng)，而BGA培養(yǎng)基的選擇性相對(duì)較差。

2.2 沙門氏菌和干擾菌的生化試驗(yàn)情況

結(jié)果判定方法如下，H2S：TSI生化管中產(chǎn)生黑色為陽(yáng)性、無(wú)黑色產(chǎn)生為陰性;URE：培養(yǎng)基變?yōu)榧t色為陽(yáng)性，變?yōu)辄S色為陰性；LIA:上層呈紫色，下層呈淡紫色或全管紫色為陽(yáng)性，黃色為陰性；SAA：加入靛基質(zhì)試劑后產(chǎn)生紅環(huán)為陽(yáng)性，無(wú)紅環(huán)產(chǎn)生為陰性。

3種沙門氏菌和2種干擾菌在生化管中培養(yǎng)18h～24 h的結(jié)果見表3。其中甲型副傷寒沙門氏菌的生化管延長(zhǎng)培養(yǎng)至48 h。從表3可以看出，甲型副傷寒沙門氏菌的生化試驗(yàn)中也出現(xiàn)了延遲產(chǎn)H2S現(xiàn)象；而弗氏檸檬酸桿菌和奇異變形桿菌的生化試驗(yàn)中也均出現(xiàn)了產(chǎn)H2S現(xiàn)象；在3種沙門氏菌當(dāng)中，唯有甲型副傷寒沙門氏菌的LIA反應(yīng)為陰性。

表 3 生化試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Biochemical test results

3 結(jié)論

首先，通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，雖然產(chǎn)H2S是沙門氏菌的一個(gè)重要特征，但并不是唯一判定標(biāo)準(zhǔn)，在實(shí)際檢測(cè)工作中并不能以此為依據(jù)簡(jiǎn)單的進(jìn)行沙門氏菌的篩選。例如腸桿菌科中弗氏檸檬酸桿菌和奇異變形桿菌的產(chǎn)H2S現(xiàn)象就是很好的證明，如果食品中同時(shí)存在著這些干擾菌，在沙門氏菌的檢測(cè)中就應(yīng)該加大注意，盡可能多的挑取可疑菌落進(jìn)行后續(xù)測(cè)試，結(jié)合生化試驗(yàn)來(lái)分析判斷。如果有條件的話，可以用顯色培養(yǎng)基來(lái)分離沙門氏菌。通過(guò)對(duì)比不難發(fā)現(xiàn)，干擾菌在顯色培養(yǎng)基上呈現(xiàn)藍(lán)色或被抑制不生長(zhǎng)，而沙門氏菌在其上顯現(xiàn)出特殊的紫紅色，這樣可以顯著提高檢測(cè)效率和準(zhǔn)確度。

其次，甲型副傷寒沙門氏菌與典型的豬霍亂沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌也有一些不同，無(wú)論是在分離培養(yǎng)基上的形態(tài)或是生化試驗(yàn)結(jié)果。尤其值得注意的是甲型副傷寒沙門氏菌的延遲產(chǎn)H2S現(xiàn)象，因此，在實(shí)際檢測(cè)中，分離平板的培養(yǎng)時(shí)間應(yīng)掌握好，必要時(shí)可延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，一般培養(yǎng)48 h左右再觀察，減少誤判，防止產(chǎn)生假陰性結(jié)果。

最后，在進(jìn)行沙門氏菌的生化試驗(yàn)鑒定中，同樣也不能以是否產(chǎn)H2S作為唯一判定標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)結(jié)合其他反應(yīng)綜合判斷。只有出現(xiàn)TSI反應(yīng)是斜黃底黃，同時(shí)LIA反應(yīng)為陰性的情況下才可以排除沙門氏菌的可能性[4]。另外一個(gè)需要注意的甲型副傷寒沙門氏菌的LIA反應(yīng)結(jié)果為陰性，這與一些文獻(xiàn)中提到的甲型副傷寒沙門氏菌是沙門菌屬中唯一賴氨酸脫羧酶陰性的菌型相符合[5-6]。

綜上所述，由于食品中存在大量非沙門氏菌的干擾菌，而且不同的沙門氏菌之間也存在著差異，因此在實(shí)際檢測(cè)工作中一方面應(yīng)科學(xué)客觀的判斷測(cè)試結(jié)果，同時(shí)使用幾種不同的分離鑒別培養(yǎng)基進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)于可疑的菌落，應(yīng)結(jié)合生化試驗(yàn)綜合判斷；另一方面可以采用具有較高敏感性和特異性的顯色培養(yǎng)基來(lái)分離沙門氏菌[7]，提高檢測(cè)效率和準(zhǔn)確度，減少誤判。

[1]王章云.腸炎沙門氏菌引起的食物中毒細(xì)菌學(xué)調(diào)查[J].中國(guó)人畜共患病雜志,1999,15(3)：115

[2]趙月蘭，秦建華.沙門氏菌對(duì)動(dòng)物性食品的污染與檢測(cè)[J].張家口農(nóng)專學(xué)報(bào)，1995，11(4)：40

[3]彭麗萍,陳博文.食品沙門氏菌檢測(cè)方法進(jìn)展[J].中國(guó)人獸共患病雜志,1999,15(5):89-91

[4]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.GB4789.4-2010食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010：4

[5]何曉青.衛(wèi)生防疫細(xì)菌檢驗(yàn)[M].南昌：新華出版社,1989:175-185

[6]Krieg N R,Brenner D J,Staley J T.Bergey's Manual of Systematic Bacteriology[M].Baltimore/London：Williams and wilkins，1984:408-516

[7]陳茂義，胡婕，劉建昭，等.科馬嘉顯色培養(yǎng)基和XLD、SS、HE分離食品中沙門菌效果比較[J].公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué)，2008，19(4)：14

Isolation and Identification to Different Salmonellas and Interference Strains

WANG Zhi－wei
（Shanghai Institute Quality Inspection and Technical Research，Shanghai 200233，China）

Threekinds of Salmonellas（Salmonellacholeraesuis，Salmonellaty phimurium，Salmonella paratyphi）and two kinds of interference strains（Citrobacter freundii and Proteus mirabilis）were inoculated in isolation medium to observe the growth and color situation.This summary intend to research morphological characteristic of Salmonellae and interference strain in BS，XLD，DHL，HE，BGA and the Chromogenic Medium and biochemical test results.Salmonella paratyphi has delayed production H2S and Citrobacter freundii and Proteus mirabilis have produced H2S.The identification effect of CAS medium is the best，BGA has the worst separation effect.Producing H2S can not be the sole criteria for identification of Salmonella，the using of chromogenic media can significantly improve the detection efficiency and accuracy.

Salmonellae；interference strain；isolation medium；CHROM agar medium

王志偉（1980—），男（漢），助工，碩士，研究方向：食品中致病菌檢測(cè)。

2011-07-17