周 新， 牛麗紅， 白 云， 黃軼群， 賴克強(qiáng)， 王 燕

(1．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128;2．上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306)

不同酸處理對(duì)羅非魚皮明膠提取率及物化特性的影響

周 新1， 牛麗紅2， 白 云2， 黃軼群2， 賴克強(qiáng)2， 王 燕1

(1．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128;2．上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306)

以羅非魚皮為原料，探討不同酸處理對(duì)魚皮明膠蛋白質(zhì)提取率、羥脯氨酸含量、蛋白質(zhì)組成和黏度的影響．實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，魚皮明膠蛋白質(zhì)的提取率受溶液中氫離子濃度的影響很大，乙酸、檸檬酸和鹽酸處理的魚皮蛋白質(zhì)提取率分別為13.50%～20.55%，10.52% ～20.01%和4.32% ～20.86%．優(yōu)化3種酸的處理?xiàng)l件，得到最高的蛋白質(zhì)提取率和羥脯氨酸含量較為接近，但對(duì)應(yīng)的黏度不同．凝膠電泳結(jié)果表明，明膠中主要含α-鏈和β-鏈，α-鏈含量高的明膠有更好的黏度特性．

明膠;蛋白質(zhì)提取率;羥脯氨酸;黏度;凝膠電泳

明膠是一種可溶的高分子聚合物，也是一種天然蛋白質(zhì)，可從含有膠原蛋白的哺乳動(dòng)物和魚類中獲取．明膠因其獨(dú)特的化學(xué)物理性質(zhì)，被廣泛應(yīng)用到食品、制藥、攝影和化妝品工業(yè)［1］．由于猶太教、伊斯蘭教、印度教等宗教信仰，傳統(tǒng)的牛皮膠和豬皮膠產(chǎn)品的應(yīng)用受到限制［2］．魚皮明膠成為一種良好的替代品，為魚類加工廢棄物利用提供了新的途徑．

我國(guó)是水產(chǎn)品生產(chǎn)和貿(mào)易大國(guó)，水產(chǎn)品總量居世界第一位［3］，文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)的魚皮明膠主要來(lái)自羅非魚［4］，虹鱒魚［5］，鱘魚［6］和草魚［7］等．與冷水魚相比，溫水魚的魚皮中脯氨酸和羥脯氨酸的含量更高，因此溫水魚皮明膠比冷水魚皮明膠具有更好的功能特性［8］．羅非魚皮明膠提取已見報(bào)道，如 P．Songchotikunpan［9］，Jamilah［10］用固定濃度的酸與堿對(duì)魚皮進(jìn)行預(yù)處理和提取明膠，但各種酸處理對(duì)蛋白質(zhì)提取率及明膠的物化特性的影響未見報(bào)道．本文以羅非魚皮為原料，用不同濃度和種類的酸對(duì)魚皮進(jìn)行處理，提取魚皮明膠，研究明膠的蛋白質(zhì)提取率、羥脯氨酸含量、蛋白質(zhì)分布和黏度隨酸濃度和酸種類的變化規(guī)律，為魚類加工的廢棄物利用提供技術(shù)參考．

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅非魚皮，廣州市恒發(fā)食品有限公司提供．

試劑:氫氧化鈉、鹽酸、冰乙酸、檸檬酸、濃硫酸、甲醇、五水硫酸銅、硫酸鉀、無(wú)水碳酸鈉、甲基紅、溴甲酚綠、硼酸、乙酸鎂、無(wú)水乙醚、酒石酸鉀鈉、三水醋酸鈉、二甲苯、乙二醇獨(dú)甲醚、氯胺T、高氯酸、對(duì)二甲氨基苯甲醛、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷、過(guò)硫酸銨、四甲基乙二胺、甘氨酸、考馬斯亮藍(lán)R－250，以上試劑均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;十二烷基硫酸鈉(SDS)，生工生物工程(上海)有限公司;上樣緩沖液，上海碧云天生物技術(shù)有限公司;牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(BSA)、羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó)Sigma公司;蛋白質(zhì)分子量Marker，寶生物工程(大連)有限公司．

1.2 儀器與設(shè)備

UV3000PC型紫外可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司;DV－Ⅱ +Pro型黏度計(jì)，美國(guó)Brookfield公司;IS－RDD3型臺(tái)式恒溫振蕩器，美國(guó)精騏有限公司;DZF－6050型真空干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;SCZ－06型脂肪測(cè)定儀，上海嘉定糧油儀器有限公司;FOSS TecatorTMDigestor，KjeltecTM2003型FOSS全自動(dòng)凱氏定氮儀;HH－6型數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市金分儀器有限責(zé)任公司;JYSCZ2+型電泳槽、JY 300C型電泳儀，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司;BioSpectrumTM500型紫外凝膠成像儀，英國(guó)劍橋BioSpectrum有限公司．

1.3 方法

1.3.1 魚皮基本成分分析

魚皮水分、灰分、粗脂肪、粗蛋白的含量分別按國(guó)標(biāo) GB 5009.3—2010，GB 5009.4—2010，GB/T 14772—2008和GB 5009.5—2010測(cè)定．

1.3.2 明膠提取工藝流程

魚皮→去鱗、去碎肉→剪碎→稱重→水洗→堿處理→水洗至中性→酸處理→水洗至中性→熱水提取→抽濾→真空干燥→明膠樣品．

本工藝流程在堿處理、酸處理過(guò)程中的操作溫度均為4℃．

稱取30 g魚皮，用料液比(g/mL)為1∶6的去離子水浸泡10 min，瀝干，水洗兩次，每次搖勻4 min后瀝干5 min，最后一次用尼龍紗布擠干．魚皮用0.3 mol/L NaOH(料液比(g/mL)為1∶6)處理，搖勻后靜止浸泡1 h，瀝干5 min．水洗5次，每次搖勻4 min，瀝干5 min，最后一次用尼龍紗布擠干．然后分別用乙酸(0.05(pH=3.03)，0.10(pH=2.88)，0.15(pH=2.79)，0.20(pH=2.73)mol/L)、檸檬酸(0.01(pH=2.57)，0.03(pH=2.33)，0.05(pH=2.22)，0.07(pH=2.14)mol/L)、鹽酸(0.01(pH=2.0)，0.02(pH=1.70)，0.03(pH=1.52)，0.05(pH=1.30)mol/L)以1∶6的料液比(g/mL)處理魚皮，具體步驟與上述堿處理方法一致．最后，魚皮用料液比為1∶4的去離子水在50℃水浴中提取3 h，經(jīng)抽濾得到明膠溶液，真空干燥后得到明膠樣品．實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次2個(gè)平行樣品．

1.3.3 蛋白質(zhì)提取率的計(jì)算

提取液中蛋白質(zhì)濃度測(cè)定:雙縮脲法［11］．取1 mL樣品加入比色管中，加入4 mL雙縮脲試劑．充分搖勻后，室溫下放置30 min，以經(jīng)過(guò)相同處理步驟的去離子水為參比溶液，在波長(zhǎng)為540 nm處測(cè)定其吸光度，根據(jù)吸光度值，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算蛋白質(zhì)濃度，每個(gè)樣品平行測(cè)定4次．

蛋白質(zhì)提取率(PY)的計(jì)算公式:

式(1)中，ρ為測(cè)定的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，mg/mL;F為樣品稀釋倍數(shù);V為提取溶液體積，mL;m為魚皮質(zhì)量，g．

1.3.4 羥脯氨酸含量測(cè)定

提取液的羥脯氨酸含量測(cè)定采用Woessner法［12］．取2 mL提取液到水解管中，加入3 mL 10 mol/L HCl．混勻后于130℃水解反應(yīng)3 h．水解液冷卻到室溫，用2.5 mol/L NaOH調(diào)至中性，用去離子水定容到50 mL，然后取20 μL稀釋到2 mL制成樣品液．取2 mL樣品液，加入1 mL氯胺T，搖勻，室溫反應(yīng)20 min，加入1 mL 3.15 mol/L高氯酸到各個(gè)測(cè)試管，混勻，室溫保持5 min，除去氯胺T，再加1 mL對(duì)二甲氨基苯甲醛，混勻，60℃水浴反應(yīng)20 min，室溫冷卻2 h．以經(jīng)過(guò)相同處理步驟的去離子水為參比溶液，在波長(zhǎng)為557 nm處測(cè)定其吸光度，根據(jù)吸光度值，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品的羥脯氨酸濃度，每個(gè)樣品平行測(cè)定4次．

羥脯氨酸含量(HYP)的計(jì)算公式:

式(2)中，ρ為測(cè)定的羥脯氨酸質(zhì)量濃度，μg/mL;F為樣品稀釋倍數(shù);V為提取溶液體積，mL;m為魚皮質(zhì)量，g．

1.3.5 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

聚丙烯凝膠電泳參照Hao［6］報(bào)道的方法，并略作改進(jìn)．用6%的分離膠和5%的濃縮膠制成電泳凝膠，分別取25 μL 2 mg/mL的樣品和蛋白質(zhì)分子量Marker與上樣緩沖液以1∶4比例混勻，100℃水浴5 min，6000 r·min－1離心3 min，取10 μL 上樣．電泳完成后，將凝膠取下，放入固定液中震蕩1 h(70 r·min－1)，用考馬斯亮藍(lán) R－250染色30 min，脫色液脫色后得到的凝膠用紫外凝膠成像儀進(jìn)行掃描，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次．

1.3.6 黏度的測(cè)定

提取溶液黏度參考Tabarestani［5］報(bào)道的方法:用去離子水將干燥明膠樣品調(diào)成6.67 g/mL的明膠溶液，加熱到60℃，取16 mL溶液加入到小樣適配器中，在溫度60 ℃、轉(zhuǎn)速25 r·min－1的條件下，測(cè)定明膠溶液的黏度，每個(gè)樣品平行測(cè)定2次．

2 結(jié)果與分析

2.1 羅非魚皮基本成分

羅非魚皮的基本成分為:水分62.44±0.7(g/100 g)，灰分0.63±0.02(g/100 g)，粗脂肪 0.39±0.005(g/100 g)，粗蛋白36.71 ±0.53(g/100 g)，以魚皮濕重為基準(zhǔn)．

2.2 不同酸處理對(duì)羅非魚魚皮明膠提取的影響

2.2.1 對(duì)蛋白質(zhì)提取率和羥脯氨酸含量的影響

不同酸處理對(duì)羅非魚皮明膠蛋白質(zhì)提取率和羥脯氨酸的影響見圖1、圖2、圖3．從圖1、圖2、圖3可以看出，明膠蛋白質(zhì)提取率(PY)、羥脯氨酸含量(HYP)與酸的種類和濃度密切相關(guān)．隨著酸濃度增加，蛋白質(zhì)提取率和羥脯氨酸含量先增加后降低．魚皮明膠的較佳提取條件分別為:乙酸0.15 mol/L(pH=2.79)(PY=20.55%，HYP=25.75 mg/g);檸檬酸0.05 mol/L(pH=2.22)(PY=19.91%，HYP=25.11 mg/g);鹽酸0.03 mol/L(pH=1.52)(PY=20.86%，HYP=22.45 mg/g)．P．Songchotikunpan［9］報(bào)道的結(jié)果為 18.1%，B.Jamilah［10］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為12.92%．蛋白質(zhì)提取率的差異可能是由于羅非魚種類、魚皮預(yù)處理方法或計(jì)算方法的不同產(chǎn)生的．

圖1 乙酸處理對(duì)提取明膠的蛋白質(zhì)提取率和羥脯氨酸含量的影響Fig．1 Effects of acetic acid on PY and HYP of extracted gelatin

圖2 檸檬酸處理對(duì)提取明膠的蛋白質(zhì)提取率和羥脯氨酸含量的影響Fig．2 Effects of citric acid on PY and HYP of extracted gelatin

羥脯氨酸是明膠的特定氨基酸，用羥脯氨酸的含量表征明膠產(chǎn)率更加直觀．從圖1、圖2、圖3中看出，酸的種類和濃度與蛋白質(zhì)提取率和羥脯氨酸含量呈相似的規(guī)律，這表明明膠提取率與羥脯氨酸含量存在線性相關(guān)性，蛋白質(zhì)提取率與明膠產(chǎn)率的差異性可能是由于明膠中含有少量的非膠原蛋白所致．羅非魚是一種溫水魚，魚皮中羥脯氨酸含量高，提取的明膠可作為牛皮膠和豬皮膠的良好替代品．

圖3 鹽酸處理對(duì)提取明膠的蛋白質(zhì)提取率和羥脯氨酸含量的影響Fig．3 Effects of HCl on PY and HYP of extracted gelatin

2.2.2 對(duì)明膠相對(duì)分子質(zhì)量分布的影響

不同酸處理對(duì)羅非魚明膠相對(duì)分子質(zhì)量分布的影響見圖4．從圖4可以看出，所有魚皮明膠溶液都包含了 α1，α2，β-鏈，且含量顯著．明膠條帶中顯示出的低分子量蛋白，可能是在先前的預(yù)處理過(guò)程中，非膠原蛋白去除不完全或是α-鏈裂解產(chǎn)生的．溶液中氫離子濃度和酸的電離常數(shù)對(duì)提取明膠的蛋白質(zhì)分子量分布有很大影響［13］．乙酸處理的樣品中，明膠溶液的α-鏈和β-鏈含量變化比較小，可能是因?yàn)橐宜岬碾婋x常數(shù)最小，溶液H+濃度變動(dòng)不大所致．檸檬酸處理樣品時(shí)，隨著酸濃度增加，β-鏈含量降低，低分子量成分含量增加，可能是因?yàn)镠+濃度的增加，致使β-鏈解旋，α-鏈裂解成小分子蛋白．用HCl處理樣品時(shí)，得到的明膠溶液中β-鏈含量先增加后降低，可能因?yàn)镠Cl是一種強(qiáng)電解質(zhì)，在0.01 mol/L(pH=2.0)鹽酸處理魚皮過(guò)程中，H+被吸附到魚皮中，減少了溶液中的H+濃度，溶液pH值升高，當(dāng)達(dá)到pH為6～7時(shí)，魚皮中的內(nèi)生膠原酶活度增加，導(dǎo)致α-鏈和β-鏈的損失，所以用0.01 mol/L(pH=2.0)鹽酸處理的魚皮明膠電泳條帶中α－鏈和β－鏈含量降低，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與M．Ahmad［13］等人的報(bào)道接近．

2.2.3 對(duì)明膠黏度的影響

不同酸處理對(duì)明膠黏度的影響作用見圖5、圖6、圖7．由圖5、圖6、圖7可看出，酸的濃度和種類對(duì)明膠溶液的黏度影響較大，黏度隨著酸的濃度增加先增大而后減?。?dāng)乙酸、檸檬酸和鹽酸的濃度分別為0.15 mol/L(pH=2.79)、0.03 mol/L(pH=2.33)和0.02 mol/L(pH=1.70)時(shí)，得到的明膠黏度最高值分別為 9.27 ±0.17 mPa·s－1、7.62 ±0.20 mPa·s－1和8.50 ±0.22 mPa·s－1．酸處理不僅可以除去魚皮中的礦物質(zhì)，而且使魚皮膨脹，致使膠原蛋白的部分交聯(lián)斷裂，有利于提高魚皮明膠的蛋白質(zhì)提取率，但酸的濃度過(guò)高，可能導(dǎo)致提取得到的明膠中小分子量蛋白質(zhì)的含量增加，降低明膠溶液的黏度．乙酸處理之后提取的明膠中含有較多的α-鏈和β-鏈，所以魚皮明膠的黏度較高．

圖4 不同濃度和種類的酸處理對(duì)提取明膠蛋白質(zhì)分子量分布的影響Fig．4 Effects of different acid treatment on protein distribution of extracted gelatin

圖5 乙酸處理對(duì)提取明膠黏度的影響Fig．5 Effects of acetic acid on viscosity of extracted gelatin

圖6 檸檬酸處理對(duì)提取明膠黏度的影響Fig．6 Effects of citric acid on viscosity of extracted gelatin

圖7 鹽酸處理對(duì)提取明膠黏度的影響Fig．7 Effects of HCl on viscosity of extracted gelatin

3 結(jié)論

用不同濃度和種類的酸處理魚皮，根據(jù)蛋白質(zhì)提取率、羥脯氨酸含量和黏度高低，綜合評(píng)價(jià)了魚皮明膠的物化特性．實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乙酸、檸檬酸和鹽酸的濃度分別為0.15 mol/L(pH=2.79)、0.05 mol/L(pH=2.22)和0.03 mol/L(pH=1.52)時(shí)，提取的魚皮明膠質(zhì)量較好，其中乙酸的處理效果較佳．隨著溶液中氫離子濃度的增加，魚皮明膠的蛋白質(zhì)提取率、羥脯氨酸含量和黏度先增加后減?。宜崽幚韺?duì)明膠蛋白質(zhì)分子量分布影響較小;檸檬酸處理時(shí)，隨酸濃度增加，明膠中大分子量蛋白質(zhì)含量減小，小分子量含量增加;鹽酸處理時(shí)，明膠中大分子量蛋白質(zhì)含量先增加后減?。?/p>

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(責(zé)任編輯:葉紅波)

Effects of Different Acid Treatment on Yield and Physicochemical Properties of Gelatin Derived from Tilapia Skin

ZHOU Xin1， NIU Li-hong2， BAI Yun2， HUANG Yi-qun2， LAI Ke-qiang2， WANG Yan1
(1．College of Food Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China;2．College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China)

The influence of different acid treatment on protein yield(PY)，hydroxyproline(HYP)content，protein distribution and viscosity of fish gelatin was investigated in this paper．The results showed that proton concentration greatly affected the gelatin extraction rate．The protein yield of acetic acid，citric acid and HCl were 13.50% ～20.55%，10.52% ～20.01%and 4.32% ～20.86%，respectively．The highest protein yield and hydroxyproline content using the three acids were similar，while the corresponding viscosity was different．Gel electrophoresis results showed that the extracted gelatin contained mostly α-chains and β-chains，and the gelatin with more α-chains showed better viscosity properties．

gelatin;protein yield;hydroxyproline;viscosity;gel electrophoresis

TS254.9

A

1671-1513(2012)02-0022-05

2012-01-16

周 新，男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程;

王 燕，女，教授，博士，主要從事食品化學(xué)與營(yíng)養(yǎng)方面的研究．通訊作者．