余 洋 綜述;劉 彥，牛忠英 審校

(解放軍第306醫(yī)院全軍口腔疾病診療中心，北京100101)

1990年，瑞士科學(xué)家首次提出“微全分析系統(tǒng)”的概念［1］。近年來(lái)，隨著超微加工技術(shù)的發(fā)展，這一分析技術(shù)在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究已經(jīng)成為一個(gè)熱門方向［2-5］。持續(xù)的研究相應(yīng)促進(jìn)了該技術(shù)的不斷進(jìn)步，使其應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大，2007年，有學(xué)者開(kāi)始將這一技術(shù)引入口腔疾病診斷領(lǐng)域［6］，2011年裴振華，朱濤等首次將微流芯片技術(shù)應(yīng)用到口腔細(xì)菌學(xué)研究中［7］。本文就微流芯片技術(shù)在口腔細(xì)菌定量檢測(cè)中的應(yīng)用現(xiàn)狀做一綜述。

1 微流芯片

微流芯片又稱微流控芯片、芯片實(shí)驗(yàn)室或微全分析系統(tǒng)［8］，是利用微加工技術(shù)在芯片上制做微閥、微通道、微反應(yīng)倉(cāng)、微傳感器、微壓力器、微檢測(cè)器等多種微流結(jié)構(gòu)而構(gòu)成的微型分析系統(tǒng)，在該系統(tǒng)中可完成樣品的預(yù)處理、生化反應(yīng)、分離、積聚、檢測(cè)等功能，體現(xiàn)了將分析實(shí)驗(yàn)室的功能轉(zhuǎn)移到芯片上的設(shè)想。

2 微流芯片與細(xì)菌定量檢測(cè)

微流芯片檢測(cè)細(xì)菌，所需樣本液量小，能夠大大縮短檢測(cè)時(shí)間，易于實(shí)現(xiàn)設(shè)備的集成化和自動(dòng)化，因此該方法已經(jīng)成為近年來(lái)許多學(xué)者關(guān)注和研究的方向［9-11］。根據(jù)檢測(cè)原理的不同大致可分為電化學(xué)阻抗譜檢測(cè)、光學(xué)檢測(cè)、阻抗脈沖檢測(cè)和其他一些檢測(cè)方法等。

2.1 電化學(xué)阻抗譜檢測(cè)

給所測(cè)樣本液施加一個(gè)小振幅的頻率不同的交流電勢(shì)波，系統(tǒng)阻抗值會(huì)隨著頻率的變化而改變，每一個(gè)頻率值對(duì)應(yīng)著溶液一個(gè)確定的電阻抗值，這就形成了阻抗譜圖［12］。電化學(xué)阻抗譜法因其對(duì)待測(cè)樣本表征和整體性能變化的敏感性，成為分析復(fù)雜電阻抗系統(tǒng)的強(qiáng)有力的工具［13］。根據(jù)細(xì)胞的電生理和阻抗特性，目前用阻抗譜定量檢測(cè)細(xì)菌細(xì)胞的研究方法分為三個(gè)方向:①細(xì)菌正常代謝產(chǎn)生的離子釋放和胞膜上離子交換，會(huì)引起系統(tǒng)阻抗值的變化。Silley等［14］通過(guò)測(cè)量這種阻抗信號(hào)，實(shí)現(xiàn)細(xì)菌數(shù)量的測(cè)量;②由于細(xì)胞膜的絕緣特性，細(xì)胞貼附在微電極表面上時(shí)，電極的表面積會(huì)減小，從而引起界面阻抗的增加，當(dāng)細(xì)菌的粘附范圍達(dá)到一定程度時(shí)，能夠產(chǎn)生可檢測(cè)的阻抗信號(hào)。Varshney等［15］正 是 利 用 這 一 原 理，進(jìn) 行 了O157∶H7型大腸桿菌的定量分析，同時(shí)，為了得到較強(qiáng)的阻抗信號(hào)，這些系統(tǒng)大多使用了氧化還原探針，比 如 ［Fe(CN)6］-3/-4，檢 測(cè) 范 圍 可 達(dá)104～107cfu/mL，整合納米微珠磁性分選技術(shù)的微流芯片的應(yīng)用，使細(xì)菌數(shù)量檢測(cè)限度達(dá)到102～106cfu/mL［16-17］;③細(xì)胞內(nèi)胞質(zhì)富含離子，使用一定的方法裂解細(xì)胞或促使其釋放內(nèi)部所含的帶電離子，就能夠檢測(cè)到阻抗的變化。電通透作用可大大提高細(xì)胞膜的離子通透性，從而增加離子釋放，科研人員用此種方法，可檢測(cè)低至102cfu/mL大腸桿菌［18］。Yang 等［19］用去離子水懸浮大腸桿菌，促使高離子濃度細(xì)胞質(zhì)向外界環(huán)境釋放離子，通過(guò)測(cè)量去離子水溶液阻抗值變化，可獲得細(xì)菌濃度，該套系統(tǒng)的檢測(cè)范圍達(dá)至105～109cells/20 μL。

2.2 光學(xué)檢測(cè)

根據(jù)光學(xué)原理的不同，這一領(lǐng)域里可細(xì)分為吸光光度檢測(cè)、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)、熒光檢測(cè)等檢測(cè)技術(shù)。

2.2.1 吸光光度檢測(cè)

吸收光度檢測(cè)是基于物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收而建立起來(lái)的一種分析方法，包括比色法、可見(jiàn)紫外吸光光度法、紅外光譜法等。它具有靈敏、準(zhǔn)確、快速、可測(cè)定的物質(zhì)種類多、儀器結(jié)構(gòu)較簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，適用于微量組分的測(cè)定。Lin等(2004)［21］報(bào)告了一種應(yīng)用比色分析法檢測(cè)大腸桿菌的微流芯片，菌體與金納米微珠(直徑80 nm)上包被的抗體發(fā)生免疫反應(yīng)，比色定量測(cè)定溶液顏色強(qiáng)度的改變，系統(tǒng)的檢測(cè)限為10 ng。Li等［21］設(shè)計(jì)的微流芯片，含有免疫固定的抗體，捕獲大腸桿菌后，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)一步檢測(cè)，最低檢測(cè)限為102cfu/mL。

2.2.2 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)

在一些特殊的化學(xué)反應(yīng)中，基態(tài)分子吸收反應(yīng)中釋放的化學(xué)能躍遷至激發(fā)態(tài)，處在激發(fā)態(tài)的分子以光輻射的形式將能量釋放而返回基態(tài)，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光?；瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)正是通過(guò)測(cè)量這些反應(yīng)中的光強(qiáng)度來(lái)測(cè)定被測(cè)物質(zhì)的含量。這種方法具有很高的靈敏度，且不需要光源，儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，易于集成化，是微流控芯片分析系統(tǒng)理想的檢測(cè)方法之一。Han等［22］制作了Y型腔道的PDMS材料的微流芯片，大腸桿菌K1Ⅱ型與共軛抗大腸桿菌多克隆抗體的羧基聚苯乙烯微球，分別通過(guò)Y型腔道的兩側(cè)進(jìn)樣口注入芯片，兩者在中間的匯聚腔道發(fā)生乳膠免疫凝集反應(yīng)，用“極近”芯片的光纖測(cè)定反應(yīng)時(shí)光散射強(qiáng)度的增加量，將結(jié)果繪制成光密度與菌濃度的校準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析，可檢測(cè)的濃度范圍為0～104cfu/mL。

2.2.3 熒光檢測(cè)

激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)法，是目前微流控芯片系統(tǒng)中最常用的檢測(cè)方法，具有很高的靈敏度、良好的選擇性和較寬的線性范圍?；诩す庹T導(dǎo)熒光原理的檢測(cè)器也是目前芯片商品化趨勢(shì)中唯一被采用的一種檢測(cè)器。大多數(shù)生物細(xì)胞能夠產(chǎn)生自體熒光，熒光來(lái)源于機(jī)體的代謝產(chǎn)物和自身組分。Bao等［23］發(fā)明了一種能夠?qū)?xì)菌裂解產(chǎn)物產(chǎn)生的自發(fā)熒光進(jìn)行激光誘導(dǎo)檢測(cè)的微流芯片，試驗(yàn)中觀察到三種標(biāo)準(zhǔn)菌-李斯特菌F4244、腸炎沙門菌PTI和大腸桿菌O157:H7EDL933的自發(fā)熒光密度隨菌數(shù)量的增長(zhǎng)而增加，兩者幾乎成線性關(guān)系。該芯片檢測(cè)限為240～4 100 cells/mL。微流芯片技術(shù)的引入，成功實(shí)現(xiàn)了流式細(xì)胞儀的微型化，整合流式細(xì)胞術(shù)的微流芯片定量分析也因此成為近年來(lái)學(xué)者們研究的一個(gè)熱門方向。Skamoto［24］的研究組應(yīng)用設(shè)計(jì)的此類芯片檢測(cè)河水中的大腸桿菌，能夠檢測(cè)到的濃度范圍達(dá)106～107cells/mL，而他們通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)條件摸索優(yōu)化之后重新設(shè)計(jì)的芯片，對(duì)熒光標(biāo)記的大腸桿菌檢測(cè)限達(dá)到104～106cells/mL。

2.3 阻抗脈沖檢測(cè)

阻抗脈沖檢測(cè)是檢測(cè)單個(gè)粒子和細(xì)胞大小及數(shù)量的一種優(yōu)質(zhì)方法，它能夠檢測(cè)出非導(dǎo)電粒子通過(guò)感應(yīng)腔道時(shí)電阻抗值的變化。目前廣泛應(yīng)用的庫(kù)爾特計(jì)數(shù)器正是這一技術(shù)強(qiáng)大生命力的體現(xiàn)。微納米技術(shù)的進(jìn)步，使基于微流芯片技術(shù)的微型化阻抗脈沖檢測(cè)器檢測(cè)微納米粒子成為現(xiàn)實(shí)。Song等［26］使用的微流芯片由一個(gè)單腔道和兩個(gè)定位在傳感部分末端的檢測(cè)壁腔道和外部鏈接的兩級(jí)差分放大器組成，細(xì)菌流過(guò)感應(yīng)部分的流速與菌濃度成線性函數(shù)關(guān)系。利用高信噪比信號(hào)，系統(tǒng)完成了4種不同細(xì)菌—李斯特菌、沙門氏菌、志賀菌、綠膿桿菌的定量分析，檢測(cè)限精確到5×106～5×107cfu/mL。Skamoto［27］的研究組應(yīng)用課題組設(shè)計(jì)的此類芯片檢測(cè)河水中的大腸桿菌，能夠檢測(cè)到的濃度范圍達(dá)106～107cells/mL，而他們通過(guò)該實(shí)驗(yàn)摸索了優(yōu)化條件之后重新設(shè)計(jì)的芯片，對(duì)經(jīng)熒光標(biāo)記的大腸桿菌檢測(cè)限達(dá)到104～106cells/mL。

3 微流芯片在口腔細(xì)菌定量分析中的初步應(yīng)用

總結(jié)近年來(lái)芯片實(shí)驗(yàn)室技術(shù)在一般細(xì)菌學(xué)定量檢測(cè)中的現(xiàn)況，研究主要集中在食源性致病菌和外界環(huán)境中常見(jiàn)的微生物的計(jì)量分析上，而該技術(shù)在口腔致病菌檢測(cè)上的應(yīng)用研究剛剛起步。裴振華，朱濤等(2011)［27］率先應(yīng)用自己設(shè)計(jì)的基于液體電極的微流芯片，結(jié)合電化學(xué)阻抗譜原理，定量檢測(cè)了成人牙周炎主要致病菌-牙齦卟啉單胞菌，研究發(fā)現(xiàn)不同濃度的牙齦卟啉單胞菌的電化學(xué)阻抗譜有顯著差異，通過(guò)阻抗值可以區(qū)分不同濃度的牙齦卟啉單胞菌。該研究成為微流芯片在口腔細(xì)菌學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用的開(kāi)端。

3.1 基于液體電極微流芯片結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

這個(gè)芯片由前部三條進(jìn)樣腔道、中間一條檢測(cè)腔道和尾部3條廢液排出腔道組成。實(shí)驗(yàn)時(shí)由外側(cè)的兩個(gè)進(jìn)樣腔道勻速注入高導(dǎo)電的氯化鉀液，中間的進(jìn)樣腔道勻速注入一定濃度的細(xì)菌懸浮液，根據(jù)流體的流動(dòng)聚焦原理，兩側(cè)的氯化鉀液會(huì)擠壓中間的菌懸液形成穩(wěn)定的層流，這里的氯化鉀液不僅具有鞘流作用，而且作為整個(gè)芯片系統(tǒng)的液體電極使用。因此該液體電極與固體電極相比具有操作便利、所需試劑簡(jiǎn)單、費(fèi)用低廉等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)可在很大程度上減少固體電極中可能存在的樣本液與金屬反應(yīng)的現(xiàn)象，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值［28］。

3.2 微流芯片定量檢測(cè)牙齦卟啉單胞菌的原理

牙齦卟啉單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株經(jīng)過(guò)復(fù)蘇、培養(yǎng)、增菌、計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)、梯度稀釋、離心、洗滌后，用去離子水重懸靜置20 min，以促使細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)中的離子充分釋放。研究中發(fā)現(xiàn):如果流體流速過(guò)快，會(huì)造成芯片的滲漏，而流速過(guò)慢時(shí)，流層交界處圖像模糊，實(shí)驗(yàn)結(jié)果不可靠。因此經(jīng)過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的摸索，樣本液及氯化鉀液的流速定在1 mL/h。為了進(jìn)一步證明該流速對(duì)檢測(cè)敏感性的影響，研究人員保持氯化鉀液流速不變，菌懸液分別以1.5 mL/h和2 mL/h的速率流動(dòng)，將阻抗分析儀記錄的數(shù)據(jù)制成電導(dǎo)-菌濃度對(duì)數(shù)線性關(guān)系圖，通過(guò)分析發(fā)現(xiàn):流速為1 mL/h時(shí)，線性斜率最大，這就意味著此時(shí)芯片敏感性最高。實(shí)驗(yàn)證明:當(dāng)交流電壓的頻率為100 Hz～10 kHz時(shí)，不同濃度的細(xì)菌液阻抗值有顯著差異，隨著細(xì)菌濃度的增加，阻抗值梯度減小;同一濃度的菌液，阻抗-頻率曲線基本是一條與橫軸平行的線，進(jìn)一步分析系統(tǒng)等效電路可知，低頻時(shí)系統(tǒng)電路阻抗相當(dāng)于電阻R的阻抗，針對(duì)本研究體系，其中電阻包括細(xì)菌液和高導(dǎo)電氯化鉀液的共同電阻，而由于高導(dǎo)電氯化鉀溶液的電阻相對(duì)很小，所以主要可用細(xì)菌液的電阻來(lái)解釋;而當(dāng)頻率超過(guò)100 kHz時(shí)，這一現(xiàn)象消失。因?yàn)樵诟哳l率時(shí)，系統(tǒng)阻抗值的變化主要受雙層液電容阻抗而不是細(xì)菌液阻抗的影響，因此系統(tǒng)阻抗與細(xì)菌濃度之間無(wú)明顯對(duì)應(yīng)關(guān)系。當(dāng)頻率恒定在1.2 kHz時(shí)，細(xì)菌濃度的對(duì)數(shù)與阻抗值呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.99。芯片能夠區(qū)分濃度為:103～109cells/mL［27］。該項(xiàng)技術(shù)申請(qǐng)了專利:一種應(yīng)用電化學(xué)阻抗原理檢測(cè)細(xì)菌的方法及微流控芯片(申請(qǐng)?zhí)?201010100832.2)。

4 微流芯片技術(shù)在臨床口腔細(xì)菌學(xué)檢測(cè)中應(yīng)用

4.1 特異性檢測(cè)方法的建立

檢測(cè)方法的高度特異性，是臨床運(yùn)用的首要條件，為此研究者采用牙齦卟啉單胞菌牙齦蛋白酶K抗體包被的納米磁珠對(duì)細(xì)菌進(jìn)行特異性捕獲，外加磁場(chǎng)下進(jìn)行免疫磁分離，最后通入芯片檢測(cè)。為了驗(yàn)證這種方法的特異性，實(shí)驗(yàn)中使用中間普氏菌作為雜菌與牙齦卟啉單胞菌混合，用納米磁珠蛋白酶K抗體復(fù)合物與混合菌液反應(yīng)，最后通過(guò)PCR方法鑒定磁珠捕獲的細(xì)菌。同時(shí)為了驗(yàn)證該方法在復(fù)雜口腔環(huán)境中應(yīng)用的可行性，磁珠抗體復(fù)合物分別與含有(2.13×103～2.13×109)cells/mL牙齦卟啉單胞菌的唾液、血清、膿液反應(yīng)，免疫磁分離后通入芯片檢測(cè)阻抗譜的變化。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn):結(jié)合免疫磁分離技術(shù)后，芯片對(duì)細(xì)菌的檢測(cè)限升高;免疫磁分離法特異性好;唾液和血清對(duì)牙齦卟啉單胞菌的檢測(cè)限無(wú)明顯影響，但唾液使檢測(cè)靈敏度有所降低。膿液使牙齦卟啉單胞菌的檢測(cè)限及檢測(cè)靈敏度明顯降低［31］。

4.2 檢測(cè)粘結(jié)性牙周夾板固定病人齦溝液中的牙齦卟啉單胞菌和血鏈球菌

裴振華(2011)［29］利用微流芯片結(jié)合免疫磁分離方法，建立了牙齦卟啉單胞菌和血鏈球菌的阻抗—細(xì)菌濃度對(duì)數(shù)線性關(guān)系圖和函數(shù)式。通過(guò)關(guān)系式量化分析了粘結(jié)性?shī)A板固定病人初診、夾板固定即刻、固定后2周、4周時(shí)炎癥和健康對(duì)照位點(diǎn)齦溝液中的牙齦卟啉單胞菌和血鏈球菌，同時(shí)記錄相應(yīng)階段牙周臨床指標(biāo)包括菌斑指數(shù)、齦出血指數(shù)、探針深度和臨床附著水平的變化，通過(guò)與臨床指標(biāo)和細(xì)菌培養(yǎng)以及實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果作對(duì)照，分析粘結(jié)性牙周夾板固定前后牙周微生態(tài)的變化，對(duì)該方法的臨床應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行了初步評(píng)估。

5 結(jié)論

應(yīng)用微流芯片定量檢測(cè)口腔細(xì)菌尚處在初步研究階段，它為口腔細(xì)菌學(xué)領(lǐng)域里細(xì)菌定量檢測(cè)的方法開(kāi)辟了新的途徑。由于口腔環(huán)境的復(fù)雜性，臨床所取樣本含有眾多的干擾因素，少量雜菌的混入以及樣本預(yù)處理過(guò)程中可能引入的一些離子成分、抗體的結(jié)合率，反應(yīng)的溫度、時(shí)間、反應(yīng)物濃度、pH等都會(huì)對(duì)檢測(cè)系統(tǒng)的穩(wěn)定性、敏感性產(chǎn)生影響。因此，進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，完善試驗(yàn)方法，設(shè)計(jì)更加敏感、特異、抗干擾能力強(qiáng)的芯片，提高臨床應(yīng)用價(jià)值，將成為該領(lǐng)域未來(lái)的重點(diǎn)研究方向之一。

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