結(jié)核菌快速檢測(cè)技術(shù)進(jìn)展

徐荒朱紅

結(jié)核病發(fā)病率近年呈上升趨勢(shì)。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，全世界目前約有20億人感染結(jié)核，每年新發(fā)病例890萬(wàn)，死亡160萬(wàn)［1］。我國(guó)是世界上22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，疫情僅次印度居世界第2位，每年新發(fā)病人145萬(wàn)人，死亡20余萬(wàn)人，是其他傳染病死亡人數(shù)總和2倍［2］。不典型結(jié)核和耐藥菌增多。由于涂片鏡檢平均檢出率只有25% ～35%，2008年我國(guó)出入境人員痰涂片陽(yáng)性率17．86%［3］，傳統(tǒng)培養(yǎng)方法需2～3個(gè)月，給結(jié)核病診斷、治療藥物選擇和防控帶來(lái)一定困難。結(jié)核病快速診斷方法研究成為世界重點(diǎn)關(guān)注課題。近年來(lái)快速診斷方法出現(xiàn)給不典型和耐藥結(jié)核診斷和治療提供了很大幫助。下面就結(jié)核菌及耐藥性快速檢測(cè)技術(shù)作簡(jiǎn)單介紹。

一、結(jié)核桿菌培養(yǎng)

1．液體培養(yǎng)方法:結(jié)核桿菌在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較快，方法、設(shè)備簡(jiǎn)單。WHO鼓勵(lì)中低收入國(guó)家使用此方法。

分枝桿菌快速手工培養(yǎng)(分枝桿菌生長(zhǎng)指示管，the mycobacteria grouth indicate tube，MGIT):原理是在米德?tīng)柌剪斂?Middlebrook)7H9肉湯培養(yǎng)基試管底部嵌有熒光指示器，有氧存在時(shí)指示器熄滅，結(jié)核菌生長(zhǎng)時(shí)消耗培養(yǎng)基中溶解氧，指示器發(fā)出橙色熒光。采用生長(zhǎng)對(duì)照管和含抗結(jié)核藥管37℃同時(shí)培養(yǎng)，比較兩管熒光即可得到細(xì)菌生長(zhǎng)和藥敏情況。無(wú)論對(duì)一線或二線藥敏測(cè)試都簡(jiǎn)單、精確、有效［1］。針對(duì)利福平和異煙肼敏感性檢測(cè)精確性＞90%。7～14天得到結(jié)果。The BACTEC MGIT960自動(dòng)培養(yǎng)系統(tǒng)(the BACTEC MGIT960 automated system):原理同MGIT，但培養(yǎng)和熒光信號(hào)讀取按事先設(shè)計(jì)程序由儀器自動(dòng)控制［1］。薈萃分析此系統(tǒng)測(cè)定結(jié)果有較高精確性和預(yù)測(cè)值，用于二線藥敏實(shí)驗(yàn)?zāi)芘cBACTEC TB－460放射測(cè)量法(radiometric method)媲美。檢測(cè)氧氟沙星此法敏感性和特異性均為100%。本系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)同MGIT，但設(shè)備需要一定資金，樣品量受儀器最大工作負(fù)荷限制［4，5］。適合于高負(fù)擔(dān)低資源國(guó)家中小規(guī)模實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。

The BacT/Alert 3D系統(tǒng)(The BacT/Alert 3D system):采用改良7H9 Middlebrook肉湯培養(yǎng)基，試管底部裝有一比色傳感器，能感受細(xì)菌代謝產(chǎn)生的CO2，由綠色變成黃色，儀器自動(dòng)持續(xù)監(jiān)測(cè)顏色變化。該系統(tǒng)用于結(jié)核菌快速培養(yǎng)，藥敏檢測(cè)靈敏度和特異度都較好［1］。但對(duì)二線藥敏試驗(yàn)報(bào)道不足。

The Versa TREK系統(tǒng)(The Versa TREK system):采用富含7H9 Middlebrook肉湯培養(yǎng)基，細(xì)菌代謝使培養(yǎng)容器內(nèi)壓力變化，通過(guò)監(jiān)測(cè)壓力變化了解細(xì)菌生長(zhǎng)情況。培養(yǎng)和檢測(cè)過(guò)程在同一裝置內(nèi)完成。有關(guān)其應(yīng)用報(bào)道不多，實(shí)用性有待進(jìn)一步評(píng)估［1］。

顯微鏡觀察肉湯－藥敏測(cè)試［the microscopic observation broth－drug susceptibility assay(MODS)］:結(jié)核桿菌生長(zhǎng)過(guò)程中形成特征性“繩帶”(cord)。采用含或不含抗生素7H9液體培養(yǎng)基在24孔板中培養(yǎng)細(xì)菌，利用倒置顯微鏡，40倍鏡頭觀察結(jié)核菌特征性cord形成情況。薈萃分析MODS測(cè)試?yán)Ｆ胶彤悷熾旅舾行裕苯佑糜谂R床涂陽(yáng)痰標(biāo)本敏感性96%和92%，特異性96%。平均21天100%得到結(jié)果，便宜，但安全性較差［4，6，7］。

比色氧化還原指示劑法(the colorimetric redox indicator methods):將氧化還原指示劑放入含或不含抗結(jié)核藥培養(yǎng)基中，細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)培養(yǎng)基顏色發(fā)生改變，比較兩管培養(yǎng)物顏色能判斷結(jié)核菌是否耐藥。方法簡(jiǎn)單、快捷，培養(yǎng)7～8天肉眼能觀察結(jié)果。薈萃分析表明耐藥性監(jiān)測(cè)有較高敏感度和特異度［1］。氧化還原指示劑有多種，可根據(jù)不同藥物選擇相對(duì)敏感指示劑。

載玻片培養(yǎng)技術(shù)(slide－culture technique):在載玻片培養(yǎng)基礎(chǔ)上改進(jìn)而來(lái)一種快速培養(yǎng)技術(shù)［1］。將10個(gè)樣品涂片到滅菌載玻片一端，將玻片縱切成兩半，放入裝有7ml液體培養(yǎng)基培養(yǎng)瓶里，3瓶不含抗結(jié)核藥作為對(duì)照，其他瓶含抗結(jié)核藥做藥敏試驗(yàn)，置冰箱過(guò)夜，次日將培養(yǎng)瓶移入培養(yǎng)箱37℃，培養(yǎng)10天。載玻片取出之前85℃加熱30min熱固定干燥，作萋－尼(Ziehl－Neelsen)染色，顯微鏡100倍鏡頭觀察抗酸菌落。當(dāng)對(duì)照組有最少一個(gè)菌落，藥敏組只要有菌落出現(xiàn)即耐藥。此法精確度利福平和異煙肼分別96%和90%，其他藥物略低。原理簡(jiǎn)單，結(jié)果明確，但操作繁雜，安全性較差。

2．固體培養(yǎng)方法:(1)TK培養(yǎng)基(Medium)結(jié)核菌快速培養(yǎng)系統(tǒng):生長(zhǎng)中結(jié)核桿菌代謝活動(dòng)使培養(yǎng)基顏色改變，在細(xì)菌菌落形成前根據(jù)培養(yǎng)基顏色鑒定是否分枝桿菌生長(zhǎng)。方法簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)，比常規(guī)培養(yǎng)縮短10天出結(jié)果［1］。能排除常見(jiàn)細(xì)菌污染，鑒別結(jié)核與非結(jié)核分枝桿菌。規(guī)范應(yīng)用條件和完善質(zhì)量控制，將是一種實(shí)用、有前途的方法。(2)噬菌體法檢測(cè)結(jié)核桿菌:1)噬菌體生物擴(kuò)增法快速檢測(cè)結(jié)核菌:1997年由Wilson等開(kāi)發(fā)?；驹硎菍⑻禺愋粤呀夥种U菌噬菌體引入含有結(jié)核分枝桿菌待測(cè)樣品中，噬菌體能感染活分枝桿菌，未進(jìn)入菌體多余噬菌體被隨后加入的殺毒劑滅活，已進(jìn)入菌體內(nèi)噬菌體不受影響。噬菌體在感染分枝桿菌內(nèi)大量繁殖，并將菌體裂解，釋放出大量子代噬菌體，可感染隨后加入的指示細(xì)胞，并將其裂解，在瓊脂平板培養(yǎng)基上出現(xiàn)透明噬菌斑。根據(jù)噬菌斑有無(wú)和多少來(lái)判斷標(biāo)本中有無(wú)活結(jié)核分枝桿菌感染或其他幾種為數(shù)不多的非結(jié)核分枝桿菌。FASTPlaqueTB(Biotec Laboratories Ltd，Ipswich，UK)就是基于這種原理設(shè)計(jì)的商業(yè)試劑盒，3天能得到結(jié)果。用于診斷敏感性略高于涂片染色，但不及傳統(tǒng)培養(yǎng)。噬菌體D29宿主比較寬泛，需要確認(rèn)試驗(yàn)排除其他分枝桿菌感染。FASTPlaqueTBRif(Biotec Laboratories Ltd)一種商業(yè)化測(cè)定利福平敏感性試劑盒。薈萃分析表明檢測(cè)對(duì)利福平敏感性商業(yè)化試劑敏感度81% ～100%，特異度73% ～100%。而實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部試劑敏感度88% ～100%，特異度84% ～100%［8］。陽(yáng)性預(yù)測(cè)值 92%，陰性預(yù)測(cè)值 95%，特異度為99.0%，靈敏度70．3%?？旖?，2天獲得結(jié)果，無(wú)需昂貴設(shè)備。但存在少數(shù)假陽(yáng)性。2)螢光素酶報(bào)告噬菌體(Luciferase reporter phages，LRP):將整合有螢光素酶基因的噬菌體感染結(jié)核分枝桿菌，螢光素酶基因得到表達(dá)，在菌內(nèi)三磷酸腺苷(ATP)存在情況下，催化培養(yǎng)基中螢光素底物，細(xì)菌發(fā)出螢光。通過(guò)膠片感光或光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果。螢光素酶報(bào)告噬菌體能精確檢測(cè)活分枝桿菌感染，7天得到結(jié)果，但敏感性不如鏡檢。另外需要在測(cè)試中加入p－硝基－a－乙酰氨基－b－羥基苯丙酮 (p－nitro－a－acetylamino－b－h(huán)ydroxy propiophenone，NAP)做確認(rèn)試驗(yàn)排除非結(jié)核分枝桿菌感染造成假陽(yáng)性結(jié)果。據(jù)報(bào)道整合了螢光素酶報(bào)告基因的Che12和TM4噬菌體可用于檢測(cè)活動(dòng)期和休眠期結(jié)核桿菌［9］。用于藥敏檢測(cè)得到結(jié)果時(shí)間利福平為數(shù)小時(shí)，乙胺丁醇、異煙肼、環(huán)丙沙星為2～3天。LRP－NAP實(shí)驗(yàn)證實(shí)LRP用于鑒定結(jié)核桿菌和84份臨床標(biāo)本藥敏實(shí)驗(yàn)，敏感性和特異性分別97%和100%。結(jié)果一致率達(dá)到98．65%。光度計(jì)檢測(cè)儀器昂貴，膠片感光便宜，適合高負(fù)擔(dān)設(shè)備條件不足的實(shí)驗(yàn)室用。

3．硝酸鹽還原酶測(cè)定 (the nitrate reductase assay，NRA):結(jié)核桿菌能將硝酸鹽轉(zhuǎn)變成為亞硝酸鹽，產(chǎn)生顏色變化。是一種快速藥敏試驗(yàn)方法?？芍苯佑糜谔禈?biāo)本檢測(cè)，價(jià)廉。測(cè)試?yán)Ｆ健悷熾?、鏈霉素、乙胺丁醇敏感度分別為94% ～100%、＞92%、100%、93%;特異度為94% ～100%、＞92%、100%、100% ，23 天 100% 得到結(jié)果［6，7，10～13］。

E實(shí)驗(yàn)(the e－test):采用一種浸有不同濃度梯度抗結(jié)核藥塑料條放在接種有結(jié)核桿菌瓊脂培養(yǎng)基表面直接閱讀生長(zhǎng)抑制區(qū)的一種快速藥敏實(shí)驗(yàn)方法。目前除檢測(cè)利福平結(jié)果稍好外，其他藥物結(jié)果不理想［11］?？赏瑫r(shí)測(cè)試多種藥物。但易污染，假陽(yáng)性和陰性率較高，重復(fù)實(shí)驗(yàn)使費(fèi)用增加，技術(shù)有待改進(jìn)［14］。

二、核酸擴(kuò)增技術(shù)(nucleic acid amplification test，NAA)

1．檢測(cè)臨床標(biāo)本中結(jié)核桿菌:7種商業(yè)試劑盒:Amplicor MTB，Cobas Amplicor MTB，BDProbeTecET，E － MTD，LCx，Genotype Mycobacteria Direct Test，Gen－Probe Amplified Mycobacterium Tuberculosis Direct Test(后兩種獲得美國(guó)FDA認(rèn)證)平均敏感度和特異度分別為痰涂陽(yáng)標(biāo)本93% ～98%，71% ～96%;痰涂陰標(biāo)本 57．0% ～79．3%，97% ～99%［15～17］。與標(biāo)本菌含量、存放時(shí)間、處理過(guò)程、是否污染，是否存在擴(kuò)增抑制劑、擴(kuò)增方法、檢測(cè)方法有關(guān)。突出優(yōu)點(diǎn)是快捷，但儀器和試劑較貴。目前一種恒溫多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)方法所需設(shè)備簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，1～2h得到結(jié)果，如:交叉引物擴(kuò)增，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增靈敏度高于常規(guī) PCR，肉眼觀察結(jié)果［18～19］。

2．鑒定分枝桿菌種類:傳統(tǒng)鑒定菌種依靠生化方法，繁瑣、費(fèi)時(shí)、不精確。高壓液相(HPLC)法設(shè)備昂貴。Accuprobe試劑盒利用DNA探針，直接鑒定臨床標(biāo)本?？梢员鎰e復(fù)合結(jié)核桿菌組(M．tuberculosis complex)，鳥(niǎo)結(jié)核分枝桿菌(M．a(chǎn)vium)，胞內(nèi)分枝桿菌(M．intracellulare)，堪薩斯分枝桿菌(M．Kansasii)，戈登氏分枝桿菌(M．gordonae)5種分枝桿菌。酶切分析分枝桿菌PCR產(chǎn)物基因多態(tài)性位點(diǎn)或高變化區(qū)域可以鑒別30多種分枝桿菌。

3．檢測(cè)與耐藥有關(guān)結(jié)核菌基因突變:耐藥產(chǎn)生絕大多數(shù)與結(jié)核菌基因突變有關(guān)。鑒定突變基因能確定結(jié)核菌是否耐藥。市面上試劑盒測(cè)試?yán)Ｆ降男Ч哂谄渌菇Y(jié)核藥。如Genotype MTBDR plus試劑盒測(cè)試?yán)Ｆ?、異煙肼、多種藥物抵抗方法敏感度分別為99% ～100%、88% ～96%、86%;特異度94% ～99% 、100% 、100%［5，7］。薈萃分析商業(yè)探針敏感度為95%，特異度為100%［15］。單鏈構(gòu)象多態(tài)性PCR對(duì)利福平抗藥菌檢測(cè)敏感度79%，特異度96%。

三、展 望

綜上所述，結(jié)核菌快速培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單，便宜，結(jié)果可靠。但仍需要10～20天獲得結(jié)果。核酸擴(kuò)增幾小時(shí)或1～2天得到結(jié)果，敏感度和特異度較高，表現(xiàn)出強(qiáng)大的鑒別診斷能力。但儀器試劑價(jià)格較貴。實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)本身?xiàng)l件選擇不同的檢測(cè)方法。

結(jié)核分枝桿菌快速檢測(cè)技術(shù)出現(xiàn)對(duì)結(jié)核病診斷提供了很大的幫助。但各種技術(shù)仍然存在一定缺陷，需要進(jìn)一步完善。分枝桿菌快速手工培養(yǎng)和The BACTEC MGIT960自動(dòng)培養(yǎng)系統(tǒng)直接用于臨床痰標(biāo)本的檢測(cè)還需要大量試驗(yàn)評(píng)估效果。MODS用于二線抗結(jié)核藥敏感性檢測(cè)還需大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)其應(yīng)用價(jià)值。另外此方法的安全性需要改進(jìn)。噬菌體擴(kuò)增技術(shù)用于利福平以外其他抗結(jié)核藥敏感性檢測(cè)還有待研究。載玻片培養(yǎng)、E實(shí)驗(yàn)等其他快速培養(yǎng)技術(shù)和核酸擴(kuò)增技術(shù)都存在需要進(jìn)一步改進(jìn)和完善的地方。改進(jìn)完善已有的檢測(cè)技術(shù)和尋找快速、可靠、經(jīng)濟(jì)的新檢測(cè)方法和技術(shù)是一個(gè)長(zhǎng)期的研究目標(biāo)，還有很多工作需要我們?nèi)プ觥?/p>

1 Palomino JC，Martin A，Groll AV，et al．Rapid culture－based methods for drug － resistance detection in mycobacterium tuberculosis［J］．J of Microbiol Methods，2008，75:161 －166

2 陳維廣．BiPAP呼吸機(jī)對(duì)COPD合并Ⅱ型呼吸衰竭的治療價(jià)值探討［J］．國(guó)際醫(yī)藥衛(wèi)生導(dǎo)報(bào)，2008，14(3):17－19

3 王健，方筠，張琳，等．上海出入境人員結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)情況分析［J］．中國(guó)國(guó)境檢疫雜志，2010，33(1):15－17

4 Devasia1 RA，Blackman A，May C，et al．Fluoroquinolone resistance in Mycobacterium tuberculosis:an assessment of MGIT 960，MODS and nitrate reductase assay and fluoroquinolone cross － resistance［J］．J of Antimicrobial Chemother，2009，63，1173－1178

5 Bwanga F，Joloba ML，Haile M，et al．Evaluation of seven tests for the rapid detection of multidrug－resistant tuberculosis in Uganda［J］．Int J Tuberc Lung Dis，2010，14(7):890－895

6 Bwanga F，Haile M，Joloba ML，et al．Direct nitrate reductase assay versus microscopic observation drug susceptibility test for rapid detection of MDR － TB in Uganda［J］．PLoSONE，2011，6(5):e19565

7 Bwanga F，Hoffner S，Haile M，et al．Direct susceptibility testing for multi drug resistant tuberculosis:a meta － analysis［J］．BMC Infectious Diseases，2009，9:67 －82

8 Minion J，Pai M．Bacteriophage assays for rifampicin resistance detection in mycobacteriumtuberculosis:updated meta － analysis［J］．Int J Tuberc Lung Dis，2010，14(8):941－951

9 Dusthackeera A，Kumara V，Subbianb S，et al．Construction and evaluation of luciferase reporter phages for the detection of active and non － replicating tubercle bacilli［J］．J Microbiol Methods，2008，73(1):18－25

10 Gupta A，Anupurba S．Direct drug susceptibility testing of mycobacterium tuberculosis against primary anti－TB drugs in northern India［J］．J Infect Dev Ctries，2010，4(11):695 －703

11 Shikama ML，F(xiàn)erro e Silva R，Villela G，et al．Multicenter study of nitrate reductase assay for rapid detection of rifampin－resistant M．tuberculosis［J］．Int J Tuberc Lung Dis，2009，13(3):377 －380

12 Martin A，Panaiotov S，Portaels F，et al．The nitrate reductase assay for the rapid detection of isoniazid and rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis:a systematic review and meta － analysis［J］．J of Antimicrobial Chemother，2008，62:56 －64

13 Gupta A，Anupurba S．Direct drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis against primary anti－TB drugs in northern India［J］．J Infect Dev Ctries，2010，4(11):695 －703

14 Verma JS，Rawat D，Hasan A，et al．The use of E－test for the drug susceptibility testing of mycobacterium tuberculosis－a solution or an illusion?［J］．Indian J of Med Microbiol，2010，28(1):30 －33

15 Cho SN．Current issue on molecular and immunological diagnosis of tuberculosis［J］．Yousi Medical Journal，2007，48(3):347 － 359

16 Laraque F，Griggs A，Slopen M，et al．Performance of nucleic acid amplification tests for diagnosis of tuberculosis in a large Urban setting［J］．Clin Infect Dis，2009，49:46－54

17 Syre H，Myneedu VP，Arora VA，et al．Direct detection of mycobacterial species in pulmonary specimens by two rapid Amplification tests，the Gen－probe Amplified mycobacterium tuberculosis derect test and the Genotype mycobacteria direct test［J］．J Clin Microbiol，2009，47(11):3635－3639

18 Fang R，LI X，Hu L，et al．Cross－priming amplification for rapid detection of mycobacterium tuberculosis in sputum specimens［J］．J Clin Microbiol，2009，47(3):845 －847

19 Aryan E，Makvandi M，F(xiàn)arajzadehA，et al．A noval and more sensitive loop－mediated isothermal amplification assay targeting IS6110 for detection of mycobacterium tuberculosis complex［J］．Microbiol Res，2010，165:211－220