王 進(jìn),師 楊

(周口師范學(xué)院生命科學(xué)系,河南周口466001)

血管內(nèi)皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)為一類糖蛋白,在血管形成中是一個(gè)基本調(diào)節(jié)因子。它具有增加血管滲透性、誘導(dǎo)血管發(fā)生、促進(jìn)細(xì)胞生長和遷移、抑制細(xì)胞凋亡等作用。近來,在神經(jīng)再生的研究領(lǐng)域發(fā)現(xiàn), VEGF除具有促進(jìn)缺血腦血管發(fā)生外,尚有直接的神經(jīng)保護(hù)和促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生作用[1]。人們希望能將其應(yīng)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療,但由于它是生物大分子,常規(guī)靜脈注射或反復(fù)腦內(nèi)注射都不能很好地發(fā)揮作用,用基因治療的方法解決上述給藥途徑的問題將會是很有希望的方案。嘗試構(gòu)建VEGF基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體,以期為VEGF基因修飾的靶細(xì)胞腦內(nèi)移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 生物材料

pcDNA 3.1-VEGF含有人血管內(nèi)皮生長因子(VEGF165)的cDNA,由周口師范學(xué)院生命科學(xué)系分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSN購自Clontech公司。pA317細(xì)胞和NIH3T3細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、Polybrene和G418購自promega公司;質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、DNA提取試劑盒購自上海華舜生物公司;Lipofectanine轉(zhuǎn)染試劑購自invitrogen公司; DEME/F12培養(yǎng)基購自Hyclone公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 pcDNA3.1-VEGF的雙酶切及目的基因片段膠回收

pcDNA3.1-VEGF質(zhì)粒在大腸桿菌中擴(kuò)增后測序鑒定,無堿基突變及序列缺失。根據(jù)酶切位點(diǎn)選擇EcoRⅠ和XhoⅠ兩種酶雙酶切質(zhì)粒pcDNA3.1-VEGF和質(zhì)粒pLXSN,然后進(jìn)行瓊脂糖電泳,用膠回收試劑盒回收570bp目的基因片段。

1.2.2 pLXSN雙酶切

根據(jù)pLXSN的多克隆位點(diǎn),選擇EcoRⅠ和XhoⅠ兩種酶雙酶切。瓊脂糖電泳后,用膠回收試劑盒回收6kbp片段。

1.2.3 pcDNA3.1-VEGF重組體的構(gòu)建

將膠回收獲得的VEGF與pLXSN片段按3∶1的比例用T4DNA連接酶連接反應(yīng)過夜,產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)JM109菌。次日從平板上挑6個(gè)單菌落,分別搖菌,提取質(zhì)粒,雙酶切鑒定。擴(kuò)增JM109菌液5mL進(jìn)行基因測序,并與公布的VEGF165基因序列進(jìn)行校對。

1.2.4 病毒的包裝

將pA317包裝細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿,置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24h。待細(xì)胞貼壁生長達(dá)75%融合時(shí),棄去細(xì)胞培養(yǎng)液,用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞1次,然后以Lipofectamin介導(dǎo)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染:2μg質(zhì)粒及10μL脂質(zhì)體分別用無血清、無雙抗DEME培養(yǎng)液稀釋至100μL。輕輕混勻,室溫靜置45min后,加入DEME/F12,平鋪到pA317細(xì)胞上,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)15h后,加入含20%FBS的DEME,次日更換普通培養(yǎng)液培養(yǎng)48h,然后用0.8g/L G418培養(yǎng)液篩選3周。

1.2.5 病毒滴度測定

將NIH3T3細(xì)胞置于6孔板中,每孔中細(xì)胞為0.5～1X105個(gè),每孔加入2mL無血清培養(yǎng)基。將細(xì)胞培養(yǎng)上清液(病毒液)用含Polybrene的完全培養(yǎng)基倍比稀釋,即每稀釋一次濃度減小10倍。每孔NIH3T3細(xì)胞中分別加入1mL稀釋后的病毒液,Polybrene的終濃度為4mg/L。感染一周后,加入選擇培養(yǎng)基,直至可見細(xì)胞克隆,倒置顯微鏡下計(jì)算克隆形成數(shù),病毒滴度用含有細(xì)胞克隆的稀釋度最高的病毒液濃度表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶切與測序分析

用EcoRⅠ和XhoⅠ兩種酶雙酶切pcDNA3.1-VEGF,電泳后在6kbp和570bp出現(xiàn)兩條亮帶,與理論值相符。雙酶切pLXSN后,電泳只顯示6kbp條帶。測序結(jié)果經(jīng)比對,不存在堿基插入突變,與公布序列一致。

圖1 pLXSN-VEGF重組體酶切結(jié)果

2.2 病毒滴度測定

用pA317-VEGF病毒上清感染NIH3T3細(xì)胞,在G418選擇培養(yǎng)基中,約3周可見抗性細(xì)胞克隆形成,平均病毒滴度為6.5X105cfu/mL,最高為1.8X106cfu/mL。

3 討論

腦梗死后有許多細(xì)胞因子可以促進(jìn)局部血管的形成,增加局部血供,在腦梗死后1～3h內(nèi), VEGF的濃度增加,并明顯促進(jìn)血管生成[2]。 VEGF能刺激軸突生長和改善神經(jīng)細(xì)胞的存活,在病理狀態(tài)下VEGF對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有保護(hù)作用。腦梗死后,在腦梗死灶及周圍給予VEGF可以有效增加缺血半暗帶的血供[3,4]。研究證實(shí),應(yīng)用外源性VEGF可促進(jìn)新生血管的形成,減少腦梗死面積,并能刺激軸突生長和改善神經(jīng)細(xì)胞的存活,對神經(jīng)細(xì)胞具有直接保護(hù)作用[5]。但是VEGF注射到局部后很快降解,作用難以持久,治療效果有限。若能借助基因治療的手段,將VEGF基因轉(zhuǎn)染到移植細(xì)胞內(nèi),移植細(xì)胞將作為基因轉(zhuǎn)移的載體,把治療基因攜帶進(jìn)入缺血半暗帶表達(dá)VEGF,從細(xì)胞移植治療和基因治療兩方面干預(yù)腦缺血,預(yù)期會有更好的治療效果。

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的優(yōu)點(diǎn)是可將目的基因整合到靶細(xì)胞染色體中,具有細(xì)胞感染率高,導(dǎo)入的基因拷貝數(shù)多,外源基因表達(dá)長期穩(wěn)定的特點(diǎn),是目前最為成熟的基因治療載體之一。而質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率低,且要長期穩(wěn)定表達(dá)需要大量篩選工作。腺病毒載體雖可高效轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞,卻不能將目的基因整合到染色體中長期、穩(wěn)定表達(dá),故不適合需長期表達(dá)的轉(zhuǎn)基因治療。pLXSN逆轉(zhuǎn)錄病毒載體較之傳統(tǒng)的病毒表達(dá)系統(tǒng),構(gòu)建和篩選更加簡單,它的5'LTR序列包含增強(qiáng)子能夠控制多克隆位點(diǎn)中目的基因的表達(dá)。SV40啟動子控制新霉素抗性基因的表達(dá),用于真核細(xì)胞中的抗性篩選,經(jīng)G418處理后,穩(wěn)定感染的基因修飾細(xì)胞仍能存活,而未被感染的細(xì)胞則被殺死。根據(jù)包裝細(xì)胞的不同,pLXSN可以瞬時(shí)表達(dá)和長期穩(wěn)定表達(dá),本研究采用的pA317包裝細(xì)胞可使其攜帶基因長期穩(wěn)定表達(dá)。

本試驗(yàn)把雙酶切目的基因與pLXSN連接,進(jìn)行包裝后感染細(xì)胞,從而構(gòu)建成含有VEGF基因的真核表達(dá)載體。結(jié)果顯示,重組載體經(jīng)pA317細(xì)胞包裝后,達(dá)到一定的病毒滴度。酶切結(jié)果及測序表明,連接方向正確,無插入缺失突變。說明成功構(gòu)建了VEGF基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體,為后續(xù)轉(zhuǎn)染移植細(xì)胞進(jìn)行基因治療奠定了基礎(chǔ)。

[1]Sun Y,Jin K,Xie L,et al.VEGF-induced neuroprotection,neurogenesis,and angiogenesis after focal cerebral ischemia[J].Clin Invest,2003,111(12):1843-51.

[2]Samii A,UngerJ,Lange W.Vascular endothelial growth factor expression in peripheral nerves and dorsal root ganglia in diabetic neuropathy in rats[J].Neurosci Lett,1999,262:159-162.

[3]Sondell M,Lundborg G,Kanje M.Vascular endothelial growth factor has neurotrophic activity and stimulates axonal outgrowth,enhancing cell survival and Schwanncell proliferation in the peripheral nervous system[J].Neurosci,1999,19:5731-5740.

[4]Kim SH,Moon HH,Kim HA,et al.Hypoxia-inducible vascular endothelial growth factor-engineered mesenchymal stem cells prevent myocardial ischemic injury [J].Mol Ther,2011,19(4):741-750.

[5]Lee HJ,Kim KS,Park H,et a1.Human neural stem cells overexpressing VEGF provide neuroproteetion,angiogenesis and functional re-covery in mouse stroke model[J].PLoS One, 2007,2(1):156-158.