王俊虎 ，蔣翠花，江 驍，李 玥， 孫自平，殷志琦，張 健，倪以成,4

(1.中國藥科大學(xué) 天然藥物化學(xué)教研室, 江蘇 南京 210009；2.江蘇省中醫(yī)藥研究院 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 南京 210028；3.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 放射醫(yī)學(xué)研究所, 山東 濟(jì)南 564314；4.比利時魯汶大學(xué)醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)影像部, 比利時 魯汶 BE-30000)

冠心病是心血管疾病中發(fā)病率、死亡率較高的疾病。冠心病患者心肌梗死后梗死區(qū)域內(nèi)的細(xì)胞會變性壞死，形成壞死組織，不可再生。壞死組織的面積是急性心肌梗死的重要預(yù)后指標(biāo)。急性心肌梗死的梗死區(qū)域可能存在著相當(dāng)數(shù)量的存活心肌，可能在血流重建后或自發(fā)恢復(fù)心肌活力[1]。準(zhǔn)確的識別冠心病患者的缺血心肌是否可逆對治療方案的選擇具有決定性的作用。因?yàn)樾募」Ｋ赖男呐K上可能同時存在著冬眠心肌、頓抑心肌和壞死心肌，前兩者屬于可恢復(fù)功能的存活心肌[2-3]。如果患者已經(jīng)形成了大面積不可逆的心肌梗死，此時存活心肌已很少，血流重建術(shù)治療的療效不僅很差，而且可能造成再灌注損傷加重病情[4]，應(yīng)選擇的治療方案是心臟移植或者對癥治療[1]。如果情況相反，心肌梗死病變區(qū)域還存在著較多的存活心肌(冬眠心肌、頓抑心肌)，積極的再灌注措施可能使其功能形態(tài)恢復(fù)[5]。因此心肌梗死的準(zhǔn)確診斷，對于冠心病的治療有重要意義。

現(xiàn)在臨床上用于檢測存活心肌的方法主要有磁共振成像(MRI)[6]、正電子發(fā)射斷層掃描(PET)、單光子發(fā)射斷層掃描(SPECT)[1]和心電圖[7]等，通過檢測心肌細(xì)胞心肌纖維化，細(xì)胞

新陳代謝和血流灌注來評價心肌存活情況。但是由于每種方法都存在局限性，降低了診斷的準(zhǔn)確率[8]。 近期研究發(fā)現(xiàn)，萘并二蒽酮類化合物金絲桃素，具有壞死組織親和性[9]，國外有學(xué)者利用放射性碘標(biāo)記金絲桃素示蹤發(fā)現(xiàn)，金絲桃素選擇性聚集在腫瘤中心壞死組織上[10]，F(xiàn)onge等[11]發(fā)現(xiàn)金絲桃素可以與梗死心肌特異性結(jié)合，應(yīng)用于心肌梗死的壞死區(qū)域檢測。番瀉苷A是一種中位二蒽酮類化合物，具有與金絲桃素相似的空間結(jié)構(gòu)，可能也具有相同的活性，其結(jié)構(gòu)圖示于圖1。為考察番瀉苷A的壞死組織親和性和評價應(yīng)用于檢測心肌細(xì)胞存活性的潛力，通過131I標(biāo)記番瀉苷A，研究其在心肌梗死模型大鼠上的分布，探討檢測壞死心肌細(xì)胞的可行性。

圖1 番瀉苷(A)和金絲桃素結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structure of sennoside A and hypericin

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 主要儀器與裝置

RM-905a活度計：中國計量科學(xué)研究院研制；SN-697伽馬計數(shù)器：上海核所日環(huán)光電儀器有限公司；小動物呼吸機(jī)：上海奧爾科特生物科技有限公司；cyclone plus磷屏掃描儀：Perkin Elmer公司。

1.2 主要藥物與試劑

番瀉苷A：sennoside A，純度大于98%，成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；DMSO：分析純，天津博迪化工有限公司；Iodogen試劑：美國Sigma公司；濃鹽酸：分析純，南京化學(xué)試劑有限公司；Na131I溶液：原子高科股份有限公司；2,3,5-氯化三苯基四氮唑：TTC，上海靈錦精細(xì)化工有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

SD大鼠：雄性，200～300 g，SPF級，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司。KM小鼠：雄性，20～25 g，SPF級，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 大鼠心肌梗死模型的建立

SD大鼠腹腔注射10%的水合氯醛(0.3 μL/g)。麻醉后大鼠仰面固定于鼠臺上，經(jīng)口氣管插管連接小動物呼吸機(jī)，呼吸頻率60～80次/min，呼吸比1/1，潮氣量4 μL/g。碘伏皮膚消毒后，沿胸骨左緣3、4肋間開胸，暴露心臟，剝離心包膜，在室間溝處左心耳下方平行穿線，結(jié)扎左冠狀動脈前降支。結(jié)扎后，抽出胸腔空氣，恢復(fù)胸腔負(fù)壓，快速縫合胸腔，撤出氣管插管，每只大鼠肌肉注射青霉素16萬個單位。

2.2 131I標(biāo)記番瀉苷A溶液的制備

2.2.1標(biāo)記條件的優(yōu)化

1)反應(yīng)時間對標(biāo)記率的影響

取200 μL番瀉苷A的DMSO溶液(0.2 g/L)加入Iodogen含量為20 μg的制備涂管中，然后加入50 μL的7.4 MBq Na131I溶液，振蕩搖勻，室溫反應(yīng)。分別取5、15、30、60 min的反應(yīng)液用紙層析法測定標(biāo)記率，Whatman濾紙作為載體，0.1 mol/LHCl作為流動相展開。

2)番瀉苷A的用量對標(biāo)記率的影響

分別取200 μL濃度為0.05 g/L、0.1 g/L、0.2 g/L、0.5 g/L的番瀉苷A的DMSO溶液加入Iodogen含量為20 μg的制備涂管中，然后加入50 μL的7.4 MBq Na131I溶液振蕩搖勻，室溫反應(yīng)30 min，終止反應(yīng)后，用紙層析法測定標(biāo)記率。

3)Iodogen的用量對標(biāo)記率的影響

取Iodogen含量為5、10、20、40 μg的制備涂管，分別加入200 μL番瀉苷A的DMSO溶液(0.2 g/L)然后加入50 μL的7.4 MBq Na131I溶液，振蕩搖勻，室溫反應(yīng)30 min，終止反應(yīng)后，用紙層析法測定標(biāo)記率。

2.2.2131I標(biāo)記番瀉苷A的體外穩(wěn)定性

將0.1 mL131I標(biāo)記番瀉苷A溶液(活度約為11.1 MBq)加入至0.3 mL DMSO中，振蕩搖勻，于室溫條件下放置2、4、6、10、24、48 h后，在每個時間點(diǎn)采用紙色譜法測定放化純度。

2.3 131I標(biāo)記番瀉苷A在正常小鼠體內(nèi)分布

將配制好的131I標(biāo)記番瀉苷A溶液加入PEG 400與丙二醇以1∶1體積比的配比溶液稀釋3倍。取雄性昆明小鼠9只(實(shí)驗(yàn)前一天喂食1%碘化鉀溶液)，隨機(jī)分3組，每組3只，每只尾靜脈注射稀釋后的131I標(biāo)記番瀉苷A溶液0.37 MBq，分別在注射后4、24、48 h斷頭處死，取各臟器(甲狀腺，腎臟，肝臟，脾臟，肺，心，小腸，胃，肌肉，骨骼，毛皮)分別稱重并用伽馬計數(shù)器測量放射性計數(shù)，經(jīng)衰變和背景校正后，計算每克臟器或組織的放射性攝取率(%ID/g)。

2.4 131I標(biāo)記番瀉苷A在心肌梗死模型大鼠體內(nèi)分布

將配制好的131I標(biāo)記番瀉苷A溶液加入由PEG 400與丙二醇以體積比1∶1配比溶液稀釋3倍。取心肌梗死模型大鼠6只(實(shí)驗(yàn)前一天喂食1%碘化鉀溶液)，每只尾靜脈注射稀釋后的131I標(biāo)記番瀉苷A溶液3.7 MBq。24 h后，安樂處死模型大鼠，取各臟器(甲狀腺、腎臟、肝臟、脾臟、肺、正常心肌、梗死心肌、小腸、胃、肌肉和毛皮等)，分別稱重并用伽馬計數(shù)器測量放射性計數(shù)，經(jīng)衰變和背景校正后，計算每克臟器或組織的放射活性攝取率(%ID/g)。

2.5 TTC染色和放射自顯影

取模型大鼠離體心臟制成2 mm厚的切片，避光條件下用2 %的TTC溶液37 ℃孵育15 min。取TTC染色后的心臟切片，在暗室4 ℃下作用于高分辨感光磷屏曝光1 h，曝光結(jié)束后用磷屏掃描儀掃描顯像。

3 結(jié)果與討論

3.1 大鼠心肌梗死模型的建立

采用結(jié)扎左冠狀動脈前降支法建立大鼠急性心肌梗死模型，手術(shù)過程如圖2所示。結(jié)扎后心臟形成心肌梗死，病變部位心肌會缺血變?yōu)榘咨?，如圖3所示。

圖2 大鼠心臟手術(shù)結(jié)扎圖Fig.2 Image of Heart surgery in rats

圖3 心肌梗死心臟Fig.3 Image of infarcted heart

3.2 131I標(biāo)記番瀉苷A溶液的制備

3.2.1標(biāo)記條件的優(yōu)化

1)反應(yīng)時間對標(biāo)記率的影響

采用紙層析法測定標(biāo)記率，游離的131I分布在前沿，而131I標(biāo)記番瀉苷A保留在原點(diǎn)。反應(yīng)時間對標(biāo)記率的影響示于圖4。標(biāo)記率隨著時間的延長逐漸增高，30 min時達(dá)到90.3 %，繼續(xù)反應(yīng)標(biāo)記率變化不明顯，最佳反應(yīng)時間確定為30 min。

圖4 反應(yīng)時間對標(biāo)記率的影響Fig.4 Effect of reaction time on labeling yield

2)番瀉苷A的用量對標(biāo)記率的影響

番瀉苷A的用量對標(biāo)記率的影響示于圖5。標(biāo)記率隨著番瀉苷A的用量增加而逐漸增高，當(dāng)番瀉苷A的濃度為0.2 g/L時標(biāo)記率達(dá)提高90.3%，繼續(xù)確定反應(yīng)濃度為0.2 g/L。

圖5 番瀉苷A的用量對標(biāo)記率的影響Fig.5 Effect of concentration of Sennoside A on labeling yield

圖6 Iodogen用量對標(biāo)記率的影響Fig.6 Effect of Iodogen mass on labeling yield

3)Iodogen的用量對標(biāo)記率的影響

Iodogen的用量對標(biāo)記率的影響示于圖6。其他條件不變，Iodogen用量為20 μg之前，標(biāo)記率隨著用量的增加而增高，在20 μg時達(dá)到90.3 %，之后隨著氧化劑用量的增加而下降，分析原因可能是番瀉苷A的標(biāo)記過程首先是Iodogen氧化劑將Na131I溶液中的I-氧化形成大部分I+離子及少部分的高價態(tài)的碘酸根離子，然后I+通過親電取代反應(yīng)取代番瀉苷A活性部位上的H+，得到131I標(biāo)記番瀉苷A。隨著氧化劑用量的增加，被氧化的I-量增加，標(biāo)記率上升，當(dāng)氧化劑達(dá)到20 μg已經(jīng)足夠?qū)⑺械腎-氧化成I+，這時再增加氧化劑用量可能會將I-氧化成高價態(tài)的碘酸根離子，導(dǎo)致實(shí)際參與反應(yīng)的I+量減少，標(biāo)記率隨著氧化劑用量的增加而下降，因此在制備131I標(biāo)記番瀉苷A時，應(yīng)該將氧化劑用量控制在20 μg。

3.2.2131I標(biāo)記番瀉苷A的體外穩(wěn)定性

131I標(biāo)記番瀉苷A溶液的體外穩(wěn)定性結(jié)果示于圖7。室溫條件下放置24 h，其放化純度仍保持在90 %以上，48 h時放化純度為89.9 %，說明131I標(biāo)記番瀉苷A體外穩(wěn)定性較好。

圖7 131I標(biāo)記番瀉苷A體外穩(wěn)定性Fig.7 131I-Sennoside A’s vitro stability

3.3 131I標(biāo)記番瀉苷A在正常小鼠體內(nèi)的分布

131I標(biāo)記番瀉苷A在正常小鼠體內(nèi)的生物分布結(jié)果列于表1。由表1可知，在血液清除較快，給藥4 h時，血液的放射性攝取為3.052 %ID/g，24 h時降為0.461 %ID/g，48 h為0.243 %ID/g；腎臟放射性攝取高，4 h時為4.656 %ID/g，24 h后為2.674 %ID/g，48 h時為1.597 %ID/g；藥物在鼠體表面如肌肉、骨骼、毛皮等放射性攝取較少。注射后24 h，大多數(shù)器官及組織的放射性攝取小于1%ID/g，注射后48 h，標(biāo)記物基本上從各器官清除。而金絲桃素在小鼠體內(nèi)主要通過肝臟代謝，在腎臟的分布很少[11]。比較金絲桃素和番瀉苷A的結(jié)構(gòu)，金絲桃素屬于脂溶性化合物，而番瀉苷A由于多了兩個糖苷鍵和兩個羧基，水溶性較金絲桃素強(qiáng)，推測番瀉苷A在小鼠體內(nèi)主要是通過腎臟排泄。

3.4 131I標(biāo)記番瀉苷A在心肌梗死模型大鼠體內(nèi)分布

131I標(biāo)記番瀉苷A在心肌梗死大鼠上的分布結(jié)果列于表2。注射標(biāo)記物24 h后，壞死心肌的放射性攝取率為1.537%ID/g，正常心肌為0.129%ID/g，壞死心肌和正常心肌的放射性攝取率比為11.9。血液分布很少為0.096%ID/g，其他各臟器較低，結(jié)果表明，番瀉苷A具有壞死心肌親和性。但是腎臟為0.923%ID/g，這與正常小鼠體內(nèi)分布結(jié)果一致，提示番瀉苷A是水溶性化合物，經(jīng)靜脈注射后在大鼠體內(nèi)的代謝主要通過腎臟。

表1 131I標(biāo)記番瀉苷A在正常小鼠體內(nèi)的生物分布Table 1 Biodistribution of 131I-iodosennoside

表2 131I標(biāo)記番瀉苷A在心肌梗死大鼠體內(nèi)的生物分布Table 2 Biodistribution of 131I-iodosennosideA in Rat model of myocardial ,n=6)

3.5 TTC染色和放射自顯影

TTC試劑可以與正常心肌細(xì)胞中的脫氫酶反應(yīng)而染成紅色，壞死心肌細(xì)胞由于細(xì)胞膜破裂，脫氫酶被完全釋放所以不被染色。心臟經(jīng)過TTC染色后的紅色區(qū)域代表正常心肌，而白色區(qū)域就是心肌梗死區(qū)域(如圖8 A所示)。圖8B放射自顯影圖像中，箭頭所指的紅色區(qū)域就是放射性核素即131I標(biāo)記番瀉苷A的分布區(qū)域，與其相對應(yīng)的TTC染色圖片進(jìn)行比較后，可以發(fā)現(xiàn)，131I標(biāo)記番瀉苷A在白色心肌壞死區(qū)域選擇性聚集，而在紅色正常心肌區(qū)域幾乎沒有聚集，驗(yàn)證了131I標(biāo)記番瀉苷A對于壞死心肌的親和性。

圖8 心臟切片TTC染色圖(A)和心臟切片磷屏自顯影圖片(B)Fig.8 Images of 2mm myocardial slices, after TTC staining (A); Autoradiograms of 2mm myocardial slices, correspond to TTC images (B)

4 結(jié)論

番瀉苷A與梗死心肌特異性結(jié)合，能夠在大鼠的壞死心肌區(qū)域靶向分布，除腎臟外，在正常器官清除較快，在心肌梗死診斷方面具有開發(fā)的前景。

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